金邊土鱉4種工藝樣品對大鼠血液流變性及凝血功能的影響

李成，甘海寧，陳偉韜，陳玉興，畢曉黎，占心佾

(1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院)，廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

“蟲類”藥材在我國是一類特色的醫(yī)藥資源，其通常具有療效高、活性強、潛力大、應用廣等特點，在動物類中藥材中占據重要地位[1]。 “蟲類”藥材具有多種功效且廣泛應用于中藥處方中[2]，在《神農本草經》、《金匱藥略》、《本草綱目》等古代醫(yī)藥著作中以“蟅蟲”入藥，已有近2 000年的入藥歷史。金邊土鱉為昆蟲綱蜚蠊目姬蠊科昆蟲，具有消瘀散結、抗凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經等功效，婦科常用于逐瘀通結，內科常用于散結消癥，傷科常用于續(xù)骨療傷，是中醫(yī)臨床中血瘀證的常用藥[3-4]，臨床上對抗血栓、祛風濕、抗腫瘤等都具有良好的作用[5]，已被收載于《廣東省中藥材標準》(第2冊)[6]。國外對其研究報道較少，國內僅對其生物學、生殖系統(tǒng)及抗癌抗菌等藥理作用進行過研究[7-8]。本文采用不同提取方法提取金邊土鱉進行活血化瘀實驗研究，為金邊土鱉的臨床應用提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 藥品

金邊土鱉(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號161213)；阿司匹林腸溶片[拜耳醫(yī)藥(上海)有限公司，批號SH00358]、10%水合氯醛、鹽酸腎上腺素注射液(成都市科龍化工試劑廠，批號2016092901)；角叉菜膠(Sigma-Aldrich產品，批號SLBN6684V)；細菌脂多糖(International Laboratory產品，批號：374613)。

1.2 試劑

凝血酶原時間(PT)測定試劑盒(批號1804056)、活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(批號1803037)、凝血酶時間(TT)測定試劑盒(批號 1803057)、纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒(批號 348170718)，均為北京普利生儀器有限公司產品。

1.3 主要儀器

JJ500電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；JP-500B-8高速多功能粉碎機(永康市久品電器公司)；HH-6數顯恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)；RE-52旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；LXJ-11B低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)；C2000-A高性能血凝儀(北京普利生儀器有限公司)；LBY-N7500A全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)；L-600臺式大容量低速離心機(江東儀器有限公司)；Varioskan Flash全波長多功能酶標儀(Thermo公司)。

1.4 實驗動物

SPF級SD大鼠，體質量180～220 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產許可證號SCXK(粵)2018-0002。

2 方法

2.1 金邊土鱉提取方法及給藥劑量

勻漿法：取金邊土鱉粉末50 g(六號篩)，加3倍量蒸餾水用組織攪拌機勻漿20 min，再離心20 min，取上清液備用濃縮至0.50 g/mL。冷浸法[9]：取金邊土鱉粉末50 g(六號篩)，每次加6倍量蒸餾水振搖3次，依次提取5 h、4 h、4 h，合并3次提取溶液，離心后濃縮至0.50 g/mL。水煮法：取金邊土鱉50 g碾碎后加蒸餾水煎煮40 min，濃縮后用紗布過濾使其含生藥0.50 g/mL。粉碎法：取50 g金邊土鱉粉末(六號篩)，加100 mL蒸餾水制成混懸液，使質量濃度為0.50 g/mL。阿司匹林組劑量為4 mg/kg，金邊土鱉各工藝樣品高劑量為3.24 g/kg，低劑量為0.81 g/kg。

2.2 金邊土鱉對正常大鼠全血比黏度及凝血功能影響

取SD大鼠100只，適應性喂養(yǎng)1周后，體質量分層隨機分為對照組，阿司匹林組，勻漿高、低劑量組，水煮高、低劑量組，冷浸高、低劑量組，粉碎高、低劑量組，分組后每天上午各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，正常對照組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥前1 d，禁食24 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%(φ)水合氯醛麻醉，腹主動脈取血測定凝血功能和全血比黏度。

2.3 金邊土鱉對寒凝血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影響

根據文獻[9-11]進行改進建立急性寒凝血瘀模型。取SD大鼠110只，適應性喂養(yǎng)1周后，體質量分層隨機將110只大鼠按“2.2”分組、給藥。末次給藥前1 d，除正常對照組外，其余各組大鼠于灌胃給藥后1 h皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mL/kg 2次，2次注射時間間隔為4 h，第1次注射鹽酸腎上腺素后2 h，注射大鼠放入3～5 ℃低溫環(huán)境中30 min。末次給藥前各組大鼠均禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，麻醉取血測定凝血功能和全血比黏度。

2.4 金邊土鱉對熱毒血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影響

根據文獻[12]進行改進建立熱毒血瘀模型。SD大鼠110只同上分組，分組后正常對照組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)，其余各組大鼠喂飼高脂飼料，各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，正常對照組和模型組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)5 d。實驗第3天，除正常對照組外，其余各組均皮下注射角叉菜膠(10 mg/kg)，24 h后腹腔注射給予細菌脂多糖(100 μg/kg)。末次給藥前禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，各組大鼠麻醉取血測定凝血功能和全血比黏度。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 金邊土鱉對正常大鼠凝血功能的影響

與對照組比較，冷浸法高劑量組、粉碎法低劑量組大鼠全血比黏度(低切10)明顯降低(P<0.01)，粉碎法高劑量組降低(P<0.05)；勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組和粉碎法高、低劑量組大鼠全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；4種方法高低劑量組全血比黏度(高切150)均無變化(P>0.05)；勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組大鼠APTT明顯延長(P<0.01)；阿司匹林組、勻漿法低劑量組、水煮法高、低劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法高、低劑量組APTT延長(P<0.05)；粉碎法高劑量組PT明顯延長(P<0.01)；勻漿法高劑量組、冷浸法高、低劑量組，粉碎法高、低劑量組TT延長(P<0.05)，阿司匹林組、勻漿法低劑量組TT延長(P<0.05)；阿司匹林組、勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組、粉碎法高、低劑量組FIB明顯降低(P<0.01),阿司匹林組、冷浸法低劑量組FIB降低(P<0.05)。結果見表1。

表1 金邊土鱉對正常大鼠全血比黏度及凝血功能的作用Table 1 Effect of Opisthoplatia Orientalis Burm. on blood viscosity and coagulation function of normal rats

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.2 金邊土鱉對寒凝血瘀模型大鼠凝血功能的影響

與正常對照組比較，寒凝血瘀模型組全血比黏度(低切10、中切60、高切150)明顯增加(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，冷浸法高劑量組全血比黏度(低切10)降低(P<0.05)；與寒凝血瘀模型組比較，阿司匹林組，勻漿法高、低劑量組，水煮法高、低劑量組，冷浸法高、低劑量組，粉碎法高、低劑量組全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；與寒凝血瘀模型組比較，各實驗組全血比黏度(高切150)無降低現象(P>0.05)；與對照組比較，寒凝血瘀模型組APTT明顯縮短(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，水煮法高、低劑量組APTT明顯延長(P<0.01)；阿司匹林組、勻漿法高劑量組、冷浸低劑量組、粉碎法高劑量組APTT延長(P<0.05)；與對照組比較，寒凝血瘀模型組PT無縮短現象(P>0.05)；與對照組比較，寒凝血瘀模型組TT明顯縮短(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，各實驗組TT明顯縮短(P<0.01)；與對照組比較，寒凝血瘀模型組FIB明顯增加(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，阿司匹林組、勻漿法低劑量組、水煮法低劑量組、冷浸法高、低劑量組FIB明顯降低(P<0.01)，勻漿法高劑量組、水煮法高劑量組、粉碎法高、低劑量FIB降低(P<0.05)。結果見表2。

3.3 金邊土鱉對熱毒血瘀模型大鼠的影響

與正常對照組比較，熱毒血瘀模型組全血比黏度(低切10、中切60)明顯增加(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，各實驗組全血比黏度(低切10)均降低(P<0.05)；與熱毒血瘀模型組比較，各實驗組全血比黏度(中切60)明顯降低(P<0.01)；與正常對照組比較，熱毒血瘀模型組全血比黏度(高切150)未增加(P>0.05)；與正常對照組比較，熱毒血瘀模型組APTT明顯縮短(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，冷浸法高劑量組、粉碎法高劑量組APTT明顯延長(P<0.01)，阿司匹林組、勻漿法高、低劑量組、水煮法高劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法低劑量組APTT延長(P<0.05)；與對照組比較，熱毒血瘀模型組PT縮短(P<0.05)；與熱毒血瘀模型組比較，各實驗組PT無變化(P>0.05)；與對照組比較，熱毒血瘀模型組TT明顯縮短(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，水煮法高、低劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法低劑量組TT明顯縮短(P<0.01)，勻漿高劑量組、冷浸高劑量組TT縮短(P<0.05)；與對照組比較，熱毒血瘀模型組FIB明顯增加(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，各實驗組FIB明顯降低(P<0.01)。 結果如表3。

4 討論

清代唐容川在《血癥論》中記載：瘀血在經絡臟腑之間，則為癥瘕，癥之為病，總是氣和血膠合而成……”?，F代中醫(yī)認為，凡離經之血不能及時消散而瘀滯于人體組織內，或血液運行受阻，瘀滯于經脈或器官之內則稱為瘀血。現代研究表明，血瘀證的形成與血液系統(tǒng)，特別是血小板、纖溶、抗凝血酶系統(tǒng)密切相關，存在血液流變性和微循環(huán)異常等病理生理改變。血瘀時，血液黏度大，流動性差，表現為濃、黏、凝、聚狀態(tài)，血液有效灌注量少，影響了氣血的運行[15-17]。

金邊土鱉為中醫(yī)臨床治療血瘀證的常用中藥，常以水煎內服或以黃酒送服、或者烘焙磨粉后入藥治療血瘀證，臨床效果較佳。本實驗對金邊土鱉采用水煮法、粉碎法、勻漿法和冷浸法作為提取方法制備不同樣品，對比觀察不同工藝樣品的活血化瘀效果，可為臨床應用金邊土鱉提供多種更便利的使用方式，也可為金邊土鱉中藥新藥開發(fā)應用提供更合理的制備制劑方式。

表2 金邊土鱉對寒凝血瘀模型大鼠血流變及凝血功能的作用

組別劑量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4項APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常對照組-8.61±0.915.21±1.044.24±0.6928.20±5.1520.40±5.5725.82±4.26938.50±297.34寒凝血瘀模型組-15.19±2.75##8.15±1.32##5.87±1.26##14.32±1.93##14.09±1.5912.73±2.48##1548.46±234.84##阿司匹林組0.00410.60±2.726.36±0.86?4.36±0.5420.88±4.10?15.25±1.3622.49±2.40??1032.26±207.75??勻漿高劑量組3.2412.55±4.306.68±0.87?4.47±0.5719.03±2.47?15.81±1.1023.42±4.53??1168.26±223.22? 低劑量組0.8111.74±3.546.67±0.91?4.51±0.5517.70±1.9717.04±2.6921.90±1.43??1100.80±180.68??水煮高劑量組3.2411.19±2.226.78±1.52?4.70±1.0518.84±1.74??16.48±2.3721.83±3.25??1144.36±273.46? 低劑量組0.8111.87±2.696.39±0.94?4.38±0.6219.25±2.47??15.63±0.9524.12±3.97??1065.29±236.32??冷浸高劑量組3.2411.01±1.38?6.41±1.02?4.55±0.6619.91±4.0318.30±5.9223.03±3.59??811.53±350.40?? 低劑量組0.8110.80±2.136.51±0,95?4.54±0.6620.43±3.50?18.31±3.1522.87±2.36??1072.64±334.38??粉碎高劑量組3.2412.06±1.576.58±1.21?4.71±0.6017.53±1.30?16.46±3.2024.31±3.71??1241.74±239.56? 低劑量組0.8111.84±1.826.97±1.48?4.79±1.0517.91±4.3615.84±3.1624.71±2.74??1210.41±345.56?

與正常對照組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

表3 金邊土鱉對熱毒血瘀模型大鼠血流變及凝血功能的影響

組別劑量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4項APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常對照組-8.80±1.845.51±0.524.62±0.4836.66±4.6727.98±7.1830.73±6.60657.62±227.58模型組-12.56±2.91##7.42±1.28##5.14±0.9717.98±3.11##16.62±2.04##18.48±2.31#1341.94±251.09##阿司匹林組0.0048.61±2.55?5.08±1.06??4.23±0.8528.15±5.04?21.78±9.0030.47±9.28768.01±199.38??勻漿高劑量組3.248.83±2.34?5.09±1.08??4.32±0.7827.06±4.21?17.44±2.6930.03±7.21?824.24±162.82?? 低劑量組0.819.35±2.37?5.46±0.72??4.58±0.5925.76±3.38?17.51±5.0628.30±6.72879.72±215.73??水煮高劑量組3.249.25±2.08?5.32±0.94??4.48±0.7426.49±5.33?17.48±4.0528.45±3.38??793.69±211.52?? 低劑量組0.819.98±2.63?5.95±1.18??4.85±0.8226.30±9.2319.16±6.5825.20±2.94??860.10±267.34??冷浸高劑量組3.249.01±1.95?5.08±0.75??4.28±0.5935.14±8.64??18.16±3.3426.05±4.50?586.43±303.42?? 低劑量組0.819.24±1.61?5.29±0.74??4.48±0.5430.79±8.52?19.36±5.2826.12±2.93??845.83±304.42??粉碎高劑量組3.249.74±1.78?5.80±1.16??4.82±0.8428.95±5.28??20.18±4.8425.02±4.50950.04±282.18?? 低劑量組0.8110.02±1.73?5.89±0.91??4.87±0.6724.46±3.78?18.30±5.2529.94±1.93??991.97±200.20??

與正常對照組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

上述實驗結果表明，金邊土鱉4種不同制法的樣品對正常大鼠、急性寒凝血瘀模型大鼠、熱毒血瘀模型大鼠都具有明顯的改善血液流變性的作用，其作用主要與延長APTT、TT和降低FIB含量等有關。金邊土鱉4種不同提取法樣品之間比較，彼此間均無顯著性差異，均可作為臨床應用方式。綜合考慮4種金邊土鱉樣品作用程度，勻漿樣品、冷浸樣品、粉碎樣品作用稍好些，水煮樣品作用稍差些；從綜合考慮制劑合理性、便利性來看，冷浸工藝耗時過長，粉碎工藝體積過大，水煮工藝作用稍弱，勻漿工藝更適合金邊土鱉中藥制劑的制備。

本文僅對金邊土鱉開展了初步的工藝篩選和藥效作用探索研究，為金邊土鱉中藥制劑開發(fā)和合理應用提供了初步參考依據，下一步將開展金邊土鱉活血化瘀有效成分的分離及其相關作用機制研究。