天然植物抗菌液凝膠膏劑流變學(xué)特性及燙傷修復(fù)作用研究

楊飄，付鵬德，韋樂華，郝靜，向飛丹州，茆燦泉

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031； 2.云南普洱丹州制藥股份有限公司，云南 寧洱 665199)

天然植物抗菌液(natural plant antimicrobial solution，PAMs)是云南普洱丹州制藥股份有限公司出品的一種多功能酊劑產(chǎn)品，具有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、治療皮膚潰爛以及抗腫瘤等多種功效[1]。凝膠制劑已經(jīng)廣泛地用于治療皮膚燒傷和燙傷，具有創(chuàng)面緊密貼合不粘連、減少微生物滋生、藥物緩慢釋放、延長作用時間、減少用藥次數(shù)、不污染衣物和方便使用等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。為此，將PAMs與凝膠制劑相結(jié)合，可望進(jìn)一步強(qiáng)化PAMs功效、獲得皮膚生物相容性良好、且藥物作用時間長的透皮多功效制劑。

凝膠膏劑兼具固體和液體的特性，屬于透皮藥物傳遞系統(tǒng)，最早應(yīng)用于日本[4]。中藥材中水溶性藥物成分很多，非常適合載入水凝膠基質(zhì)，是目前研究的熱點(diǎn)[5-7]。遺憾的是，現(xiàn)階段關(guān)于水凝膠的配方評價尚缺乏一套完整統(tǒng)一且操作簡便、準(zhǔn)確的評價方法[8-9]。對于交聯(lián)型凝膠膏劑的基質(zhì)來說，流變學(xué)參數(shù)如復(fù)數(shù)模量(Complex modulus，G*)、儲能模量(Storage modulus，G′，也稱彈性模量)、損耗模量(Loss modulus，G″，也稱黏性模量)、相位角(Phase angle，δ)可間接反映交聯(lián)水平。基質(zhì)的固體特性與G′ 有關(guān)，可以使凝膠膏劑擁有更大的內(nèi)聚力；液體特性與G″有關(guān)，可以使基質(zhì)和皮膚緊密的接觸，提高滲透率的同時增強(qiáng)療效；δ和G*用來表示凝膠膏劑基質(zhì)的交聯(lián)程度，從而可較準(zhǔn)確地評價凝膠膏劑的穩(wěn)定性[10]。線性黏彈區(qū)(Linear Viscoelastic Region，LVR)可以確定凝膠基質(zhì)承受壓力范圍的能力，當(dāng)應(yīng)力超過LVR的范圍時，復(fù)數(shù)模量G*明顯下降，表明此時其內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，穩(wěn)定性下降[11-12]。目前，關(guān)于凝膠膏劑流變學(xué)研究的文獻(xiàn)報道較少，本文以聚丙烯酸高分子(Viscomate NP-700)為骨架材料制備載藥(PAMs)凝膠膏劑，結(jié)合它對大鼠燙傷模型的修復(fù)程度，初步探究PAMs凝膠膏劑的流變學(xué)特性及藥效作用[13-14]。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

1.1.1 試藥 PAMs:云南普洱丹州制藥股份有限公司，2015年獲批云南省醫(yī)院制劑(滇藥制字Z20150009)；甘油、EDTA、Viscomate NP-700、酒石酸、無水乙醇、氮酮、丙二醇、薄荷醇、SDS(成都市科龍化工試劑廠)；甘羥鋁(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)。

1.1.2 儀器 AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；AKUP-TV-10愛科超純水機(jī)(振大水處理器材有限公司)；三用恒溫水箱(北京科偉永興儀器有限公司)；TA DHR-1高級旋轉(zhuǎn)流變儀(美國TA儀器公司)。

1.1.3 動物 14只健康Wistar大鼠，體質(zhì)量260～280 g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。

1.2 方法

1.2.1 不同溫度和處理時間下水凝膠基質(zhì)的制備 以甘油∶Viscomate NP-700∶甘羥鋁∶PAMs∶水∶酒石酸∶氮酮∶丙二醇∶SDS=30∶4∶0.4∶31.7∶27.2∶0.2∶3∶3∶0.5(質(zhì)量比)制備凝膠基質(zhì)[15-16]?？紤]PAMs酊劑產(chǎn)品的酒精揮發(fā)性，設(shè)置3種不同的溫度和處理時間制備凝膠基質(zhì)：將新制備的凝膠50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成凝膠(記為：50 ℃-24 h，樣品1)；50 ℃恒溫固化6 h后室溫25 ℃靜置，總固化時間3 d(記為：50 ℃-6 h，樣品2)；室溫25 ℃，固化3 d，備用(記為：25 ℃-24 h，樣品3)。

1.2.2 正交設(shè)計優(yōu)化水凝膠基質(zhì) 采用L9(34)正交表設(shè)計正交試驗(yàn)(見表1)，稱取0.4%甘羥鋁，EDTA 0、0.2%、0.4%，Viscomate NP-700 4.0%、6.0%、8.0%，分別按順序分散于30%甘油中，混勻，作為A相；稱取酒石酸 0、0.2%、0.4%，促透劑(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)，31.7%PAMs，0.5%SDS，溶于水中，攪拌均勻作為B相。將B相緩慢倒入A相，邊加邊攪拌，然后倒入直徑2.0 cm的圓形模具內(nèi)，凝膠厚度控制在1.5 mm左右，50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成凝膠備用。同時根據(jù)促透劑的不同，制備3種不含PAMs的空白凝膠對照(分別記為#10、#11、#12)，各成分配比為甘羥鋁0.4%、EDTA 0.2%、Viscomate NP-700 6.0%、甘油30%、酒石酸 0.2%、促透劑(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)、31.7%乙醇(50%)、0.5%SDS、水。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計

Table1L9(34) orthogonal experimental designw/%

水平因素A(NP-700)B(EDTA)C(酒石酸)D(促透劑)14.000氮酮3.0+薄荷醇0.326.00.20.2丙二醇3.0+薄荷醇0.338.00.40.4氮酮3.0+丙二醇3.0

1.2.3 凝膠膏劑基質(zhì)流變學(xué)特性的考察 采用旋轉(zhuǎn)流變儀，在室溫(25±0.1) ℃下進(jìn)行流變學(xué)性能的檢測，平板夾具直徑為20 mm，間距設(shè)定1 000 μm，在流變儀動態(tài)振蕩模式下進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)力(σ)設(shè)置在0～500 Pa，頻率(f)設(shè)為1.0 Hz，檢測3種樣品的線性黏彈區(qū)(LVR)。在LVR區(qū)域內(nèi)，選取固定應(yīng)力為50.0 Pa，頻率設(shè)在0.016～16.0 Hz進(jìn)行掃描，測定各樣品的流變學(xué)參數(shù)G*=[(G′)2+ (G″)2]1/2、G′、G″、δ(Tanδ=G″ /G′)[10]。

1.2.4 大鼠燙傷模型的建立與修復(fù)初步觀察 14只健康Wistar大鼠飼養(yǎng)于SPF動物房中，自由飲食，適應(yīng)1周后，稱體質(zhì)量。腹腔注射7.0%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉、固定。向帶有刻度的玻璃管(r=8.5 mm)中注入沸水2.0 mL，持續(xù)處理背部脫毛皮膚20 s，致深Ⅱ度燙傷，燙傷面積約為2.27 cm2。每只大鼠背部造模2個傷口并用苦味酸標(biāo)記，隨機(jī)分為4組，分別為PAMs組、PAMs水凝膠膏劑組、空白凝膠組和陰性處理模型組。每日給藥1次，給藥前先用生理鹽水擦拭傷口。每帖凝膠膏劑0.7 g(含PAMs 31.7%)，等量PAMs 246.6 μL。將制備好的水凝膠膏劑，從模具中取出，置于醫(yī)用無紡布上，敷貼于大鼠患處，并用膠帶十字固定，敷16 h后取下；PAMs滴涂，拍照觀察[17]。以上所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度和時間對PAMs凝膠膏劑強(qiáng)度的影響

樣品1(50 ℃-24 h)、樣品2(50 ℃-6 h)、樣品3(25 ℃-24 h)的LVR值分別為1～500、1～188、1～144 Pa，即LVR值排序?yàn)闃悠?>樣品2>樣品3，見圖1。其中，樣品3的LVR范圍最低，說明在應(yīng)力范圍下體系結(jié)構(gòu)最容易被破壞，更有可能斷裂，更不穩(wěn)定。對于3個不同樣品，隨著頻率的升高，G′值和G″值均呈現(xiàn)上升趨勢，且樣品1>樣品2>樣品3，即樣品1擁有更大的內(nèi)聚力和皮膚黏附性，見圖2(a)、(b)。在0.016～11 Hz內(nèi)，Tanδ值排序?yàn)闃悠?>樣品2>樣品1，即樣品1彈性特性占比最大，凝膠固體化性質(zhì)最突出；11～16 Hz內(nèi)，樣品3>樣品1>樣品2，即樣品3黏性特性占比最大，凝膠液體化性質(zhì)最突出，見圖2(c)。G*值排序?yàn)闃悠?>樣品2>樣品3，與LVR順序一致，即樣品1交聯(lián)程度最大。溫度升高以及時間延長可導(dǎo)致交聯(lián)速度增大，見圖2(d)。

1200100080060040020001002003004005006000G*/Paσ/Pa50℃-24h50℃-6h25℃-24h

圖1不同制備條件下PAMs凝膠膏劑應(yīng)力與復(fù)數(shù)模量的關(guān)系

Figure1Relationship between stress and complex modulus of PAMs gel paste by different preparation conditions

2.2 不同基質(zhì)成分對凝膠強(qiáng)度的影響

將正交試驗(yàn)獲得的#1～#9號凝膠膏劑從模具中取出，初步感官感受PAMs凝膠膏劑的成型性及強(qiáng)度依次為配方#9、#7、#5、#4、#3、#2、#8、#1、#6，見圖3(a)。其中，配方#6、#8 LVR范圍小，體系結(jié)構(gòu)容易被破壞和不穩(wěn)定，見圖3(b)。

PAMs凝膠膏劑的內(nèi)聚強(qiáng)度由大到小依次為配方#9、#8、#5、#7、#4、#1、#2、#3(凝膠6結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，排除比較)，見圖4(a)、(d)G*、G′ 變化。PAMs凝膠膏劑的黏附性由大到小依次為配方#9、#8、#1、#5、#4、#7、#2、#3，見圖4(b)G″ 變化。配方#1、#3、#8凝膠液體化性質(zhì)更明顯，#7、#5、#4凝膠固體化性質(zhì)更明顯，隨著Viscomate NP-700濃度的升高凝膠強(qiáng)度增大，見圖4(c)tanδ變化。

100090080070060050040030050℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24hG'/Paf/Hz250200150100500G″/Pa12001000800600400200G*/Pa0.240.200.160.120.080.04101214161802468tanδ(a)(b)(c)(d)f/Hz101214161802468

a.頻率與儲能模量的關(guān)系； b.頻率與損耗模量的關(guān)系； c.頻率與相位角tan δ的關(guān)系； d.頻率與復(fù)數(shù)模量的關(guān)系。

a. 9種PAMs凝膠膏劑的表觀性狀； b. 9種PAMs凝膠膏劑應(yīng)力與復(fù)數(shù)模量的關(guān)系。

a.頻率與儲能模量的關(guān)系； b.頻率與損耗模量的關(guān)系； c.頻率與相位角tanδ的關(guān)系； d.頻率與復(fù)數(shù)模量的關(guān)系。

圖49種PAMs凝膠膏劑的流變學(xué)性能
Figure4Rheological properties of nine PAMs gel paste

2.3 PAMs凝膠膏劑初步藥效測定

陰性處理模型組(negative group)的傷口色澤沒有變化，周邊無翹起痕跡；空白凝膠組(#10，#11，#12)也是如此，2組恢復(fù)效果幾乎相同，說明含50%乙醇的空白凝膠對燙傷基本沒有修復(fù)作用。配方#3組痂體邊緣翹起，有脫落趨勢；#1、#2、#4、#9組第5天痂體邊緣翹起；PAMs 組在第4天時右邊傷口已有明顯恢復(fù)趨勢，第5天時痂體邊緣已經(jīng)翹起，將要脫落，皮膚上有淺紅色恢復(fù)痕跡。以上結(jié)果表明，PAMs與PAMs凝膠膏劑對燙傷均有較好的修復(fù)作用。對比分析后，初步認(rèn)為修復(fù)效果依次為#3、#4、#1、#2、#9、#6、#7、#5、#8(見圖5)。

2.4 PAMs凝膠膏劑性能的綜合評估

結(jié)合PAMs凝膠膏劑表觀成型性和黏彈性、動物燙傷試驗(yàn)，對正交試驗(yàn)中9種不同PAMs凝膠膏劑進(jìn)行打分評價[9](評分標(biāo)準(zhǔn)見表2)，其中考慮綜合因素，經(jīng)驗(yàn)性地將成型性和黏彈性設(shè)置權(quán)重為30%，動物模型評價為70%。由評分結(jié)果(見表3)可知,影響因素C(酒石酸)>因素B(EDTA)>因素A(NP-700)>因素D(促透劑)，最優(yōu)組合為A1B1C2D3，即NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%，不含EDTA。

圖5PAMs凝膠膏劑處理對大鼠燙傷模型傷口愈合的作用
Figure5Wound healing of rats scald model treated with PAMs gel paste

表2 PAMs凝膠膏劑的評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring standard of PAMs gel paste

3 討論

相比測定表觀黏附力，流變學(xué)方法的精確度和可信度更高，實(shí)驗(yàn)參數(shù)更容易調(diào)節(jié)和控制，重復(fù)性良好[18-20]。參考凝膠膏劑基本成分組成，本研究首先開展了PAMs凝膠膏劑的配方研究，綜合LVR、G*、G′、G″及δ流變學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)3種不同溫度、時間條件下，50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成的凝膠 LVR范圍、G*值、G″值均最大，即其體系結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，交聯(lián)程度最大，說明溫度升高、時間延長可能導(dǎo)致交聯(lián)速度增大，凝膠強(qiáng)度更大。酒石酸既起到調(diào)節(jié)pH以及Viscomate NP-700分子中羧基的電離作用，還可競爭性地與Al3+發(fā)生絡(luò)合作用，也發(fā)揮交聯(lián)調(diào)節(jié)劑作用[15-16]。配方#6、#8均不含酒石酸，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯(lián)程度低，其LVR值范圍小，體系結(jié)構(gòu)容易被破壞，不穩(wěn)定，G″值大，黏性大；配方#8相比#6，G*值更大，強(qiáng)度更高，說明EDTA濃度的升高凝膠強(qiáng)度減小。在凝膠形成過程中，調(diào)節(jié)劑EDTA的濃度越大，與Al3+螯合的程度就越大，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯(lián)程度就會降低，凝膠強(qiáng)度也會隨之降低。配方#7無EDTA，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯(lián)程度大，G*、G′ 值大。配方#5相比#4，G*、G′值均更大，說明酒石酸對凝膠強(qiáng)度的影響大于EDTA對凝膠強(qiáng)度的影響。

表3 正交試驗(yàn)評分結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal score results

通過不同配方凝膠膏劑的表觀性狀評價以及對大鼠燙傷修復(fù)程度的對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)凝膠基質(zhì)的黏彈性、硬度以及釋藥性能與凝膠骨架NP-700、交聯(lián)劑甘羥鋁及交聯(lián)調(diào)節(jié)劑EDTA及pH調(diào)節(jié)劑酒石酸的濃度大小存在直接聯(lián)系，且凝膠強(qiáng)度與釋藥性能間存在一定的正相關(guān)。酒石酸和促透劑對藥效的影響較大，其中酒石酸濃度越高可能效果更好，促透劑以氮酮和丙二醇為優(yōu)。初步確定該P(yáng)AMs凝膠膏劑的優(yōu)化基質(zhì)配方為Viscomate NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%、不含EDTA 。

本研究通過體外、體內(nèi)共同評價的方法為PAMs凝膠膏劑基質(zhì)處方的篩選和優(yōu)化提供了一種思路，同時對于建立凝膠膏劑可行的測量指標(biāo)和評價體系具有十分重要的參考價值。需要說明的是，盡管本研究采用了表觀成型性、流變學(xué)特性及對大鼠燙傷修復(fù)相結(jié)合的方法進(jìn)行了PAMs凝膠膏劑初步和多維度的篩選和評價，但作為一個新產(chǎn)品的研發(fā)，還有大量的研究工作需要開展和完善，包括加大實(shí)驗(yàn)的重復(fù)數(shù)以獲得更可靠的數(shù)據(jù)，及對PAMs凝膠膏劑按《中國藥典》進(jìn)行耐熱性、賦形性、黏附性檢驗(yàn)以驗(yàn)證本文評價體系的合理性，等等。關(guān)于以上方面的進(jìn)一步研究，以及PAMs凝膠膏劑的實(shí)驗(yàn)動物模型修復(fù)功效的藥物釋放、分子作用機(jī)制將在今后深入開展和進(jìn)行。