間充質(zhì)干細(xì)胞治療與自然殺傷細(xì)胞的相互作用①

李華杰 王福生 施 明

(北京大學(xué)三〇二臨床醫(yī)學(xué)院，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染性疾病診療與研究中心，北京 100039)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有干細(xì)胞分化特性，但其分化能力有限，在許多疾病的治療中，MSCs通過可溶性細(xì)胞因子發(fā)揮的誘導(dǎo)分化、免疫調(diào)節(jié)能力，是其更加關(guān)鍵的治療機(jī)制。MSCs發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)能力影響著免疫系統(tǒng)的各個方面，其中TGF-β、NO/IDO、PGE2對自然殺傷細(xì)胞(nature killer cell，NK細(xì)胞)有著重要作用并借此影響著治療效果[1]。NK細(xì)胞是固有免疫中無須預(yù)先抗原刺激與活化，即能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的一群細(xì)胞。NK細(xì)胞廣泛分布于骨髓、肝臟、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和黏膜等器官。NK細(xì)胞根據(jù)其分化狀態(tài)可分為過渡型NK和成熟型NK，其表型各異，可根據(jù)需要向各類器官或組織遷移并進(jìn)一步成熟分化。NK細(xì)胞有多種亞群，根據(jù)表達(dá)CD56分子密度可分為殺傷功能為主的CD56dim亞群和分泌細(xì)胞因子為主的CD56bright亞群[2]。NK細(xì)胞表達(dá)許多表面抑制性和活化性受體，在不同疾病中發(fā)揮不同的作用，影響著疾病進(jìn)展，是MSCs治療的靶點之一。

1 MSCs與NK細(xì)胞的相互作用

1.1MSCs對NK細(xì)胞的作用 現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為MSCs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，無論靜態(tài)細(xì)胞模型還是模擬感染和組織損傷的動態(tài)模型，都發(fā)現(xiàn)MSCs會抑制NK細(xì)胞以減弱炎癥反應(yīng)[3-5]。MSCs不僅會影響NK細(xì)胞表面分子表達(dá)，如共培養(yǎng)后MSCs對NKp30、NKp44、和CD69等表達(dá)的抑制[6]，還會抑制其增殖和發(fā)揮功能(細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞毒作用)[7]，如斑禿小鼠模型中MSCs可通過抑制NKG2D來控制毛囊炎癥[8]。在應(yīng)用CCl4建立的肝炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IFN-γ、TGF-β等細(xì)胞因子預(yù)處理的MSCs在小鼠體內(nèi)更傾向分布于肝臟，且其免疫調(diào)節(jié)能力會進(jìn)一步升高，炎性因子的下降和其對NK細(xì)胞裂解敏感性的降低使MSCs的更加適用于治療[9]。

MSCs對各種免疫細(xì)胞有抑制效應(yīng)，但它在特定條件下亦有額外的免疫刺激能力。有研究發(fā)現(xiàn)無論健康捐獻(xiàn)者還是免疫抑制患者，IL-12和IL-18刺激下的MSCs能促進(jìn)NK細(xì)胞釋放IFN-γ，高水平表達(dá)CCR2的CD56brightNK細(xì)胞對MSC的作用更加敏感[10]。MSCs對NK細(xì)胞的影響還隨時間變化而變化。使用聚肌胞甘酸(poly I∶C)刺激模擬MSCs與NK的相互作用發(fā)現(xiàn)，在早期MSCs可通過分泌Ⅰ型干擾素增強(qiáng)NK細(xì)胞效應(yīng)功能，但隨后MSC分泌的TGF-β和IL-6又會誘導(dǎo)調(diào)節(jié)衰老樣NK細(xì)胞表型，下調(diào)炎癥反應(yīng)，限制NK細(xì)胞效應(yīng)功能，反過來促進(jìn)了MSCs的存活、增殖和促血管生成。以上結(jié)果表明MSCs的功能可能會隨感染階段不同而改變[11]。

在一項多中心的臨床實驗中，62名慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus-host disease，cGVHD)患者經(jīng)過230次輸注臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)(3×107cells/100 ml/per month)后NK細(xì)胞數(shù)量減少[12]。同時Zhao等[13]證明同種異體移植物中高濃度的NK細(xì)胞與急性和慢性GVHD風(fēng)險增加有關(guān)。因此，觀察到NK細(xì)胞減少可能是MSCs組中cGVHD發(fā)生率較低的原因之一。

1.2NK對MSCs的作用 生理條件下，NK細(xì)胞可以與組織內(nèi)除NKT和γδT細(xì)胞外其他細(xì)胞相互作用，如單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，中胚層細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分等，其中就包括MSCs[14]。

MSCs對靜息的NK細(xì)胞有抑制作用，但對已活化的NK細(xì)胞反而有促進(jìn)作用，可以進(jìn)一步提高NK細(xì)胞毒性[15,16]。各種刺激活化的NK細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)共培養(yǎng)均發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α增加，且活化NK細(xì)胞會殺傷BM-MSCs，誘導(dǎo)BM-MSCs內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，減弱細(xì)胞活力，降低serpin B9(一種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，抑制粒酶B的釋放)表達(dá)[17]。MSCs會被IL-2刺激活化的NK細(xì)胞溶解，且NK細(xì)胞毒性與其CD16表達(dá)的減少和CD56表達(dá)的升高呈正相關(guān)[18]。NK細(xì)胞可以攻擊MSCs上識別NKG2D和DNAM1的配體，借此誘導(dǎo)殺傷MSCs，釋放促炎因子[19]。

體外活化NK細(xì)胞對MSCs的殺傷作用可以削弱MSCs的治療效力，且已有研究發(fā)現(xiàn)這種能力不會被免疫抑制藥物影響，在培養(yǎng)基內(nèi)活化前以及活化期NK細(xì)胞中添加免疫抑制藥物可以減少NK數(shù)量但不影響它裂解MSCs的能力[20]。

對這種殺傷作用MSCs并不是完全沒有抵抗能力的，MSCs的Toll樣受體3與配體的結(jié)合可以削弱NK細(xì)胞的殺傷[21]。Toll樣受體是MSCs重要的表面受體，這些受體傳遞的信號既影響MSCs對固有性免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)作用，又影響NK細(xì)胞對MSCs的殺傷作用[22,23]，是在活體內(nèi)MSCs的作用依然占主導(dǎo)而沒有被完全殺傷的原因之一。比較細(xì)胞因子預(yù)處理的UC-MSCs發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過細(xì)胞因子[TGF-β、IFN-γ、多細(xì)胞因子混合物(multiple cytokine cocktail，MC)]處理的臍血MSCs可以免受NK細(xì)胞的裂解(與未處理UC-MSCs相比NK細(xì)胞CD107a的表達(dá)顯著降低)[9]。

2 MSCs在治療中對NK細(xì)胞的影響

由于多樣化的表面受體、細(xì)胞內(nèi)信號分子及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、組織特異性印跡和外來抗原暴露，人們對NK 細(xì)胞多樣性的認(rèn)識比最初認(rèn)為的要廣泛得多。盡管多數(shù)亞群有共同的CD56brightCD16-顯性，但它們受各個組織獨特的微環(huán)境所影響，因此彼此不全相同[2]。各個組織的NK細(xì)胞亞群都具有獨特的表型特征，其表型和功能亦不相同。如肝臟富集NK細(xì)胞，占肝總淋巴細(xì)胞的30%～50%，且CD56bright肝NK細(xì)胞亞群占其中40%，遠(yuǎn)高于外周血比例，它們的表面分子(如CXCR6)表達(dá)、顆粒、功能(如產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子減少及脫顆粒和細(xì)胞毒作用增強(qiáng))與外周血NK細(xì)胞均不同[11]。

因此，機(jī)體內(nèi)的NK細(xì)胞在比例、含量、亞群、表達(dá)及功能上差異的NK細(xì)胞對疾病及治療有著深刻影響。

2.1NK細(xì)胞是MSCs治療的重要靶點 MSCs與NK細(xì)胞會形成一個穩(wěn)定的炎癥-修復(fù)系統(tǒng)，既保證了適當(dāng)?shù)难装Y抵御外界侵害的損傷，又避免了過度炎癥及組織的破壞。這已經(jīng)在許多體內(nèi)外實驗中得到驗證[11,14]，包括移植物抗宿主病的臨床治療、肝衰竭的治療等。例如使用MSCs治療HBV感染的小鼠的實驗中，體內(nèi)成像發(fā)現(xiàn)MSCs在受損肝內(nèi)聚集且肝臟炎性細(xì)胞浸潤減少，同時抑制HBV感染所需的NK細(xì)胞激活性受體NKG2D的表達(dá)[24]。

整體上并未觀察到NK細(xì)胞抑制MSCs的實際療效，但消除MSCs對NK細(xì)胞的影響可以進(jìn)一步確定MSCs的療效并可能促進(jìn)MSCs治療的優(yōu)化[20]。如IL-2活化的NK細(xì)胞對MSCs的殺傷會因淋巴細(xì)胞和MSCs的比例不同而改變，因此研究活化NK細(xì)胞對MSCs的影響可能改善MSCs治療的潛力[18]。

綜上，MSCs對NK細(xì)胞的抑制主要體現(xiàn)在活化及增殖的削弱，而MSCs發(fā)揮功能的前提亦需要炎性環(huán)境等激活，未激活的MSCs功能并不明顯。因此它們的相互作用促進(jìn)了MSCs對疾病的治療。

2.2不同來源MSCs的選擇對治療和NK細(xì)胞的影響 盡管MSCs最終會被異體受者的免疫系統(tǒng)清除，但MSCs低表達(dá)MHCⅠ類分子，不表達(dá)MHCⅡ類分子，這種低免疫原性保護(hù)MSCs免受NK細(xì)胞的攻擊并抵抗移植排斥[25]。不同來源的MSCs對不同的疾病的作用和影響不盡相同，其中UC-MSCs是異體移植中較好的選擇[26]。UC-MSCs相比BM-MSCs和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AT-MSCs)壽命長、數(shù)量多、易于增殖、無侵入性、倫理爭議小且p53、p21和p16這些衰老相關(guān)標(biāo)志表達(dá)更低[26,27]。長期體外擴(kuò)增的MSCs可以保持自身的穩(wěn)定，但其免疫抑制特性會略有下降[28]。

不同來源的MSCs對包括NK細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞影響也不盡相同。使用較多的BM-MSCs與AT-MSCs有著相似的表型，都可以削弱NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌[29]，但只有BM-MSCs明顯減弱NK細(xì)胞毒作用。此外，它們對其他免疫細(xì)胞的作用亦略有不同[30]。

2.3MSCs抑制NK誘導(dǎo)的促腫瘤風(fēng)險 應(yīng)用MSCs的免疫抑制功能來減弱免疫損傷可以治療疾病，但對于有腫瘤風(fēng)險的患者(而非腫瘤患者)是把雙刃劍，可能促使腫瘤形成。在腫瘤形成時，腫瘤內(nèi)MSCs(腫瘤微環(huán)境影響下的MSCs，有分泌能力等的改變)對免疫系統(tǒng)的作用同樣是抑制的，可能增加腫瘤風(fēng)險[3,31]。腫瘤內(nèi)MSCs通過直接及間接影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對NK有抑制作用，可以促進(jìn)腫瘤的生長[32]。如腫瘤內(nèi)MSCs比正常來源的MSCs有更強(qiáng)的免疫抑制性，且對NK細(xì)胞亞群影響不同，它們誘導(dǎo)NK細(xì)胞CD56dim表型NK增多且抑制CD56bright亞群產(chǎn)生IFN-γ[33]。正常人和乳腺癌患者中的MSCs在同等情況下對NK細(xì)胞有相似的抑制效應(yīng)[34]。

盡管MSCs有促腫瘤風(fēng)險，但對腫瘤患者可以利用MSCs的腫瘤趨向性來抗腫瘤，如通過基因操作、體外IFN-α或化學(xué)試劑處理來調(diào)節(jié)它們的免疫修飾能力。這樣，MSCs可以用于增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)或特異運(yùn)輸抗腫瘤信號，并還可作為載體用于運(yùn)送細(xì)胞毒藥物直接到腫瘤位點。但基于MSCs的腫瘤治療應(yīng)依據(jù)腫瘤的類型、定位和階段以及腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)來選擇[3]，因此其在有腫瘤風(fēng)險患者中的應(yīng)用安全性還有待商榷。

3 結(jié)語與展望

間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞治療中的優(yōu)勢選擇，它具有來源廣泛、易于增殖、倫理爭議小、免疫原性低、分化潛能高和免疫調(diào)節(jié)性強(qiáng)等治療優(yōu)勢。其中，分化潛能在實際治療中發(fā)揮作用較小，而針對時刻變化的疾病狀況中錯綜復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力可以更加廣泛的應(yīng)對。MSCs如何與免疫系統(tǒng)相互作用，其背后的機(jī)制十分值得探究，NK細(xì)胞與MSCs的相互作用僅是其機(jī)制的一部分，對其機(jī)制的進(jìn)一步研究可為應(yīng)用MSCs治療疾病提供理論支撐。盡管活化的NK細(xì)胞有殺傷MSCs的作用，但MSCs的治療作用在過去的許多實踐中已經(jīng)被證實，在各種動物以及人的疾病模型實驗中都發(fā)揮了積極的作用[35]。且通過不同的處理可進(jìn)一步改善MSCs的功能以改進(jìn)治療效果，活化NK細(xì)胞對MSCs的殺傷作用在活體中并未觀察到。本篇綜述討論了過去所做的成果以進(jìn)一步探究背后的機(jī)制與意義。NK細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，MSCs治療中，MSCs對NK細(xì)胞的抑制作用影響著治療效果，是治療機(jī)制的一環(huán)，可以促進(jìn)MSCs在治療上的應(yīng)用。