內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在納米材料毒性效應中的作用研究進展

張翰超，郭彩霞，李艷博

（首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069）

隨著納米技術(shù)不斷進步，納米材料因其結(jié)構(gòu)和尺度特點具有卓越的導電性和反應活性等被廣泛運用到化工和航天領域、計算機技術(shù)、環(huán)境能源和醫(yī)學生物技術(shù)等領域。當社會各界在支持納米材料的積極作用時，其可能對環(huán)境和人體帶來的消極影響也逐漸引發(fā)關注。多年來，納米材料在其毒性影響未認知的情況下被廣泛使用，導致其不斷沉降于地表、蓄積水體之中并在大氣中擴散，進而通過呼吸、飲食、皮膚接觸等途徑暴露于人體。隨著納米毒理學研究的不斷深入，人們逐漸認識到納米材料的毒性及其作用機制。大量研究表明，氧化應激是納米材料誘導細胞毒性作用的主要機制之一。隨著納米材料顆粒尺寸的縮小，其表面晶格可能出現(xiàn)破損，而出現(xiàn)電子缺損或更多的活性位點，一定條件下可與O2相互作用形成超氧自由基及活性氧（reactive oxygen species，ROS）。新近研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是納米材料引發(fā)細胞毒性效應的另一重要機制。ERS可改變細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，參與ROS的誘導及其引發(fā)的氧化損傷作用，最終參與調(diào)控納米材料引發(fā)的細胞凋亡、自噬紊亂等細胞生物學過程［1-2］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器，是細胞中蛋白質(zhì)合成和折疊的主要部位，對脂質(zhì)的生物生成和鈣的儲存、轉(zhuǎn)運等起重要作用。各種細胞應激，如缺氧、氧化應激、低葡萄糖水平、病毒感染、藥物或環(huán)境應激可導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，這種情況被稱為ERS［3］。ERS會激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號通路，暫停早期蛋白質(zhì)的合成，減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積聚，從而使細胞恢復正常生理功能。但持續(xù)或過度的ERS則會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，最終引發(fā)細胞死亡［4］。納米材料的暴露可引發(fā)或加重人體多種疾病，包括肺、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。越來越多的研究提示，ERS是神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和肥胖等發(fā)生發(fā)展過程的重要環(huán)節(jié)。深入研究ERS及其在納米毒理學中的作用，對于闡明納米材料有害生物效應作用機制、發(fā)現(xiàn)新的生物學標志物具有重要意義。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

UPR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白積聚的一種適應性反應，對于修復早期或損傷較輕的細胞，維持機體生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要作用。當穩(wěn)態(tài)不能重建，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的UPR信號轉(zhuǎn)導途徑將引發(fā)細胞凋亡，清除過度損傷的細胞。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白RNA依賴蛋白激酶樣ER激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇需要酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）是ERS 的傳感器，能感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白的堆積。正常情況下，他們與ER管腔伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78；也稱為BIP）結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。在ERS存在時，GRP78從這3種跨膜應激感受蛋白上解離以協(xié)助蛋白質(zhì)折疊，從而激活這3個ERS傳感器蛋白及各自的UPR通路。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ型跨膜蛋白，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與GRP78解離后，通過自身二聚化和磷酸化而激活，且激活的PERK磷酸化真核細胞翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，EIF2α），抑制蛋白質(zhì)翻譯合成。同PERK類似，IRE1α也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ型跨膜蛋白，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和位點特異的核酸內(nèi)切酶活性。IRE1α活化是細胞處理UPR的關鍵。從GRP78解離后的IRE1α通過同源二聚體化和自磷酸化而激活?；罨腎RE1α可剪切X盒結(jié)合蛋白 1（X-box binding protein 1，XBP1）前體mRNA，切除26 bp的內(nèi)含子，編碼產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子 XBP1剪接體（spliced XBP1，XBP1s）。ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，從GRP78上釋放的ATF6轉(zhuǎn)錄因子被轉(zhuǎn)運到高爾基體，并通過跨膜位點1和位點2蛋白酶水解激活，轉(zhuǎn)入細胞核，促進基因表達。

ERS的產(chǎn)生是為了調(diào)動UPR以抵御應激產(chǎn)生的損害，但當UPR不足以重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，可通過NF-κB激活炎癥反應，或通過以上3個信號通路啟動ERS介導的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡［5］。ERS介導的細胞凋亡信號通路被認為是獨立于線粒體途徑和死亡受體途徑的第3條細胞凋亡途徑。其中，C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）是ERS介導的凋亡通路的重要組成部分［6］。CHOP廣泛表達于哺乳動物細胞，正常情況下表達較低，ERS激活的PERK，IRE1α和ATF6均可激活CHOP，促進CHOP表達，誘導細胞凋亡［7］。如果ERS持續(xù)存在，PERK/EIF2α通路可通過增加某些轉(zhuǎn)錄因子（如活化轉(zhuǎn)錄因子ATF4）的mRNA翻譯來觸發(fā)細胞凋亡。ATF4調(diào)節(jié)許多與細胞存活和細胞應激反應相關的基因，可刺激CHOP翻譯，從而啟動凋亡并抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白的轉(zhuǎn)錄。PERK-EIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達所必需的。人類胱天蛋白酶4與嚙齒類動物胱天蛋白酶12同源，都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，活化后可激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，參與ERS介導的凋亡事件。胱天蛋白酶12可被ERS中的多種途徑激活，如胞質(zhì)鈣活化蛋白可裂解激活胱天蛋白酶12以應答ERS導致的Ca2+向胞質(zhì)外流。此外，IRE1α可通過磷酸化激活JNK，進而磷酸化Bcl-2家族蛋白，促進細胞凋亡的發(fā)生。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在納米材料毒性效應中的作用

除納米從業(yè)人員存在較高水平暴露外，人類通過環(huán)境暴露、皮膚接觸、消化道攝入和醫(yī)源性暴露等途徑接觸納米材料的機會也日漸增加。大量研究證明，納米材料通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進入后可廣泛分布在全身多臟器系統(tǒng)，尤其是肝、脾、腎、肺和心等受累，引發(fā)或加重疾病過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)易受氧化應激攻擊的細胞器，也參與細胞內(nèi)ROS生成、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運以及Ca2+的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒（silver nanoparticles，Ag-NP）、納米氧化鋅（zinc oxide NP，ZnO-NP）和納米羥基磷灰石等NP可累積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中［8-11］。而NP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蓄積會抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯，誘發(fā)ERS以抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷或功能障礙。已有文獻指出，ERS可能是納米材料引發(fā)有害生物效應的早期、敏感的生物標志物［10］，但并不是所有的納米材料均可激活細胞內(nèi)ERS。低濃度ZnO-NP即可激活血管內(nèi)皮細胞中UPR，但納米氧化鈰則不能。類似的是，聚合物修飾的納米金顆粒作用于腦內(nèi)皮細胞后，也未觀察到ERS的發(fā)生［12］。這提示ERS響應與納米材料自身理化特性、作用劑量、時間和細胞模型等有關，有待進一步深入探討。

2.1 在金屬納米材料毒性效應中的作用

2.1.1 碲化鎘量子點

直徑在2～10 nm的半導體量子點（quantum dots，QD）是一類新型的熒光納米材料，被廣泛應用于細胞內(nèi)示蹤、生物醫(yī)療成像、藥物載體和治療中。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是碲化鎘QD引發(fā)血管內(nèi)皮細胞毒性的重要靶細胞器［13］。低濃度（0.1和1.0 mg·L-1）作用下，碲化鎘QD導致人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生擴張，且ERS標志分子GRP78和GRP94表達升高；在高濃度（100 mg·L-1）作用下，細胞則出現(xiàn)嚴重的ERS，PERK/EIF2α/ATF4依賴的ERS信號通路被激活，且ATF4繞過EIF2α磷酸化引起的翻譯抑制，導致凋亡基因如CHOP、胱天蛋白酶12和JNK被激活，最終造成ERS介導的細胞凋亡發(fā)生。該作者認為，較低劑量碲化鎘QD作用時出現(xiàn)的ERS可認為是對最終細胞損害結(jié)果的警告。

2.1.2 納米氧化鋅顆粒

ZnO-NP被廣泛應用于化妝品、防曬霜、高級紡織品、自充電和電子設備中。有研究發(fā)現(xiàn)，ZnO-NP可通過氧化應激造成肝損傷，誘導肝細胞凋亡［14-15］。ERS參與多種外源性化合物誘導的肝損傷。有研究者報道，小鼠灌胃（ig）ZnO-NP（每天0.2或0.4 mg·g-1，連續(xù)90 d）后，肝出現(xiàn)局灶性肝細胞壞死、中央靜脈充血擴張，并伴隨顯著的肝功能改變；透射電鏡觀察可見肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、核糖體脫顆粒，且肝組織中GRP78、GRP94、XBP1和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶3（protein disulfide isomerase，PDI-3）mRNA表達以及PERK和eIF2α磷酸化均呈劑量依賴性增加［16］，表明ig給予ZnO-NP誘導小鼠肝細胞出現(xiàn)ERS。同時，暴露于ZnO-NP可顯著增加肝組織中ERS相關的凋亡調(diào)控蛋白表達，包括JNK磷酸化、CHOP和胱天蛋白酶3，9和12的活性，表明ERS可能介導ZnO-NP誘導的肝細胞凋亡。除在肝細胞中通過UPR通路誘發(fā)ERS外，ZnO-NP在其他細胞中也有類似結(jié)果發(fā)生。CHEN等［10］研究顯示，ZnO-NP通過PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信號通路激活HUVEC或中國倉鼠卵巢細胞內(nèi)ERS反應。而且低濃度ZnO-NP（120 μmol·L-1，24 h）對HUVEC無細胞毒性效應，但已可激活ERS反應，表現(xiàn)為XBP1s和CHOP mRNA表達增高，且抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸預處理可徹底遏制此效應，說明ROS參與ERS的發(fā)生；濃度提高至240 μmol·L-1時出現(xiàn)細胞凋亡，且檢測到活化的胱天蛋白酶12高表達。另外，ZnO-NP誘導ERS與其粒徑有關，較90 nm ZnO-NP相比，30 nm ZnO-NP誘導的ERS更顯著，小鼠肝細胞凋亡更嚴重［17］。

2.1.3 納米銀顆粒

Ag-NP在醫(yī)學產(chǎn)品中的應用，增加了其潛在的人體暴露機會。有研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NP（120 nm）濃度低至0.1 mg·L-1即可誘導斑馬魚胚胎和人肝細胞發(fā)生ERS［18］。線粒體鈣超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫流失參與ERS介導的細胞凋亡。ZHANG等［19］的研究顯示，人肝細胞和倉鼠肺成纖維細胞暴露于Ag-NP后，細胞內(nèi)線粒體鈣水平升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光強度顯著升高；Ag-NP誘導GRP78釋放，PERK/EIF2α磷酸化、IRE1磷酸化和ATF6剪切，導致ERS發(fā)生，并呈現(xiàn)時間依賴效應；而且，沉默PERK，IRE1或ATF6的表達可抑制Ag-NP誘導的ERS，下調(diào)CHOP表達可減弱Ag-NP誘導的細胞凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴注染毒Ag-NP（0.1或0.5 μg·g-1）后，肺、肝和腎顯示出顯著的ERS應答，但僅肺和腎檢測到細胞凋亡發(fā)生；血管和氣管則僅發(fā)現(xiàn)輕微的ERS和細胞凋亡現(xiàn)象［20］。新近研究還發(fā)現(xiàn)，顆粒粒徑大小、表面積和生物冠的形成控制著Ag-NP作用下ERS的誘導［21］。

2.1.4 其他金屬納米材料

其他金屬納米材料（如納米金顆粒）也可通過激活3種ER傳感器（PERK，IRE1和ATF-6）誘導ERS介導的細胞死亡［22］；同樣，氧化鎳NP可激活ERS介導的肝細胞凋亡［23］。還有研究顯示，二氧化鈦NP的毒性依賴于鈦含量和顆粒形狀，其對細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，從而導致ERS［24］。

2.2 在非金屬納米材料毒性中的作用

2.2.1 納米二氧化硅顆粒

二氧化硅NP（silicon dioxide，SiO2-NP）是世界上生產(chǎn)量較多的一種納米材料，其在生物醫(yī)藥領域的應用越來越受到關注，但隨之而來的生物安全性問題不容忽視。早期有研究發(fā)現(xiàn)，無表面修飾和銀包被的SiO2-NP均可提高哺乳動物細胞內(nèi)ERS重要標志分子GRP78和GRP94的水平［25］。新近研究發(fā)現(xiàn)，ERS在SiO2-NP誘導血管內(nèi)皮細胞功能紊亂和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。SiO2-NP可誘導HUVEC細胞內(nèi)3條UPR通路活化，并激活CHOP、胱天蛋白酶12和JNK的表達，通過ERS途徑介導細胞凋亡［8，26］。而且，大鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴注 SiO2-NP后，其血管組織中GRP78和CHOP表達也顯著升高，且內(nèi)皮細胞凋亡增加［8］。同樣SiO2-NP還可激活人肺泡上皮細胞（HPAEpiC）［27］和人肝癌細胞（Huh7）［28］等發(fā)生ERS，導致細胞凋亡發(fā)生。值得一提的是，SiO2-NP誘導ERS的能力與其結(jié)構(gòu)、粒徑等密切相關。如20 nm SiO2-NP以劑量依賴的方式誘導內(nèi)皮細胞活力降低，且GRP78和IRE1α的表達顯著增加，但同等條件下其他粒徑SiO2-NP（30，40和50 nm）處理的內(nèi)皮細胞則無此作用［29］。而且，20 nm SiO2-NP誘導內(nèi)皮細胞經(jīng)不同機制發(fā)生凋亡和壞死，前者由ROS調(diào)控的ERS依賴性方式引起，后者則通過細胞自噬介導壞死性細胞死亡。

2.2.2 碳納米管

碳納米管（carbon nanotubes，CNT）是管狀納米級石墨晶體，可分為多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT）和單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNT）。無論是SWCNT，還是MWCNT，均可誘導ERS。如有研究發(fā)現(xiàn)，暴露于SWCNT中，細胞凋亡、自噬相關蛋白和ERS相關蛋白的水平明顯增加；TEM圖像顯示，SWCNT誘導ER擴張、自噬泡形成以及細胞膜消失，導致細胞器分離［30］。還有研究利用3種MWCNT，即XFM4，XFM22 和 XFM34（粒 徑 XFM4＜XFM22＜XFM34），以了解粒徑對MWCNT毒性作用的影響。在相同質(zhì)量濃度作用下，XFM4較其他2種MWCNT誘導更高水平的細胞毒性，更易被HUVEC攝取。而且，僅XFM4誘導了ERS反應明顯發(fā)生，表明MWCNT的粒徑影響其誘導ERS能力及細胞毒性效應［31］。

3 結(jié)語

綜上所述，納米材料被細胞攝取及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累，打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，導致細胞內(nèi)ERS快速激活，以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，但延長ERS會導致細胞不良結(jié)局。ERS是納米材料誘導細胞凋亡的重要機制，目前已發(fā)現(xiàn)3條ERS誘導的細胞凋亡途徑，即PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和JNK通路活化以及胱天蛋白酶12的激活。ERS還參與納米材料誘導炎癥反應和焦亡等［32］。重要的是，ERS與線粒體、溶酶體和氧化應激等存在交互作用。ERS可通過調(diào)控鈣轉(zhuǎn)運引發(fā)線粒體功能障礙［33］。Ag-NP處理的人神經(jīng)母細胞瘤細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體緊密接觸的膜長度明顯增加［34］。SiO2-NP導致人膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生線粒體功能失調(diào)，同時激活ERS和炎癥［35］。在SiO2-NP誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡［26］、二氧化鈦NP誘導睪丸支持細胞凋亡［36］過程中均有線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的共同參與。此外，納米材料還通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。SiO2-NP處理的人結(jié)腸癌細胞中，自噬泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體發(fā)生共定位［37］。調(diào)節(jié)ERS有可能成為疾病治療的新策略。有研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌細胞MCF-7和T-47D相比，非癌性MCF-10A細胞對Ag-NP更具抗性。Ag-NP可引發(fā)乳腺癌細胞內(nèi)ER傳感器快速響應，最終誘導腫瘤細胞凋亡［38］。不過，納米材料理化性質(zhì)（結(jié)構(gòu)、類型、粒徑等）不同，ERS在其誘導細胞死亡中的作用程度也不盡相同。即便是同一種納米材料，其細胞生物效應也受細胞模型、作用方式、實驗模式等影響。因此，仍需繼續(xù)研究來更好地闡釋ERS在納米材料毒性效應中的作用及機制，更好地指導納米材料的安全生產(chǎn)和使用，更好地開發(fā)納米材料在生物醫(yī)藥領域的應用潛力。