δ-生育三烯酚促進小鼠粒細胞集落刺激因子生成作用及其促造血活性

張文婷，彭仁軍，善亞君，左宗超，從玉文，王麗梅，唐 麗，3

（1.安徽醫(yī)科大研究生院，安徽 合肥 230032；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所北京市放射生物學(xué)重點實驗室，北京 100850；3.生命組學(xué)研究所，北京 102206）

粒細胞是血液的重要組成成分，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮非特異性或特異性抗感染作用。此外，再生障礙性貧血、先天或后天導(dǎo)致的粒細胞減少癥，白血病和癌癥放化療等均會導(dǎo)致骨髓造血損傷，其中粒細胞減少癥會造成骨髓增生異常，脾腫大以及嚴重的體內(nèi)感染等［1］。粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是重要的造血調(diào)控因子，是促進粒細胞生成的重要因子，具有促進造血動員的作用［2］。重組人G-CSF（recombinant human G-CSF，rhG-CSF）在臨床上應(yīng)用廣泛［3-4］，如作為白血病、乳腺癌等腫瘤化療后的升高體內(nèi)的白細胞作用和作為造血動員劑應(yīng)用在骨髓造血干細胞移植中。但rhG-CSF多由外源性的大腸桿菌或CHO細胞生產(chǎn)，人體多次使用后會產(chǎn)生內(nèi)源性抗體，降低療效［5］；rhG-CSF在體內(nèi)給藥半衰期短，并有皮疹、潮紅和骨疼等副作用［6-7］。因此，尋找一種有效、安全、有效時間長的小分子化合物，通過刺激內(nèi)源性G-CSF生成來治療粒細胞減少癥、促進造血動員作用等一直受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol，δ-T3H）屬于維生素E類化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H具有抗氧化、降低膽固醇合成、抗癌和抗輻射損傷等生物學(xué)作用［8-10］。據(jù)報道，δ-T3H可促進電離輻射后全血細胞恢復(fù)，使用G-CSF中和抗體后此作用消失，提示δ-T3H通過誘導(dǎo)體內(nèi)G-CSF水平的升高而促進造血［11-12］。然而，在正常情況下，δ-T3H 促進G-CSF生成的作用以及促進粒細胞升高的作用還不清楚。為此，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），外周血血常規(guī)檢測和流式細胞術(shù)等多種方法，系統(tǒng)評價δ-T3H誘導(dǎo)正常小鼠體內(nèi)G-CSF生成的劑量時間效應(yīng)，組織選擇性和相對專一性，進一步探討δ-T3H升高正常健康小鼠外周血粒細胞的效應(yīng)和造血活性，為δ-T3H作為一種新型升粒細胞小分子化合物，應(yīng)用于粒細胞減少癥等相關(guān)疾病的研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和主要儀器

6～8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量20～23 g（北京華阜康生物科技股份有限公司），動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。光照每12 h晝夜交替，溫度22～26℃，濕度40%～70%。

δ-T3H（北京三區(qū)生物技術(shù)有限公司）；G-CSF ELISA試劑盒（美國Ray Biotech公司）；細胞趨化因子1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、粒巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）和基質(zhì)細胞衍生因子β（stromal cellderived factor-1β，SDF-1β）ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；聚乙二醇-400（PEG400）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙二酸四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）緩沖液和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）（美國Gibco公司）。CD117-APC（C-kit）抗體，Ly-6A/E-PE-Cy7（Sca-1）和 Lineage〔CD3/Gr-1/CD11b/CD45R（B220）〕-FITC抗體（美國eBioscience公司）。

酶標分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；Celltac E自動血細胞分析儀（日本Nihon Kohden公司）；電子天平（上海醫(yī)療器械公司）；高速離心機（美國Sigma公司）；流式細胞分析儀（美國BD公司）。

1.2 ELlSA檢測小鼠血清中G-CSF細胞因子的含量

為檢測δ-T3H的劑量效應(yīng)，取C57BL/6J小鼠30只，隨機分為6組（每組5只），即正常對照組，δ-T3H 12.5，25，50，100和200 mg·kg-1組，在給藥后24 h，小鼠給予ip注射3%戊巴比妥鈉麻醉后進行心臟采血。全血標本收集在不加抗凝劑的1.5 mL EP管中，室溫置2 h后，1000×g離心10 min。吸取上清液，立即檢測或分裝儲存在-80℃冰箱內(nèi)，血清標本應(yīng)避免反復(fù)凍融。按G-CSF ELISA試劑盒說明書對小鼠血清中G-CSF含量進行檢測。將樣本和標準品分別加入反應(yīng)孔，依次加相應(yīng)的檢測抗體，室溫孵育1.5 h；洗滌后加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min；加底物顯色液室溫孵育15 min；加終止液。使用酶標儀檢測各組吸光值。按說明書公式計算其濃度。

1.3 ELlSA法檢測小鼠血清中G-CSF，CXCL1，GM-CSF，lL-6，lL-10，lL-12，TNF- α，EPO，TPO和SDF-1 β細胞因子的水平

取C57BL/6J小鼠25只，隨機分為2組，即正常對照組（5只），δ-T3H（100 mg·kg-1）連續(xù)5 d sc給藥組（20只），按照給藥后1，3，5和7 d每個時間點5只小鼠收集血清，利用ELISA試劑盒檢測血清中G-CSF，EPO，TPO，SDF-1β。另取C57小鼠45只，隨機分為2組，正常對照組（5只），δ-T3H（100mg·kg-1）單次sc給藥組（40只），給藥組按照3，6，12，24，36，48，72和96 h時間點進行心臟采血，每個采血點5只小鼠。利用ELISA試劑盒檢測血清中G-CSF，CXCL1，GM-CSF，IL-6，IL-10，IL-12和TNF-α水平。實驗步驟見1.2。

1.4 ELlSA法檢測小鼠臟器組織勻漿中G-CSF細胞因子水平

雄性C57BL/6J小鼠10只，隨機分為2組（每組5只），即正常對照組和δ-T3H（100 mg·kg-1）組，給藥后24 h進行組織勻漿上清液制備。小鼠脫頸處死，取組織臟器。新鮮組織置預(yù)冷的1%PBS中。首先使用預(yù)冷的1%PBS沖洗空腸、肝、肺和腎等臟器。然后分別稱取100 mg組織剪碎后加1 mL預(yù)冷1%PBS緩沖液，在研缽中利用組織研磨棒磨碎制成組織勻漿液，-20℃過夜保存；脾、胸腺、骨髓、腸系膜結(jié)節(jié)和淋巴結(jié)組織加1 mL 1%PBS緩沖液預(yù)冷，利用組織研磨棒研磨成細胞懸液。最后，組織裂解標本反復(fù)凍融2次以破壞其細胞膜，將勻漿置4℃環(huán)境中500×g離心5 min，吸取上清液，立即檢測或分裝凍存于-80℃冰箱內(nèi)備用。利用G-CSF ELISA試劑盒說明書對小鼠組織勻漿中G-CSF含量進行檢測。實驗步驟見1.2

1.5 全血細胞分析儀檢測小鼠外周血常規(guī)參數(shù)

雄性C57小鼠16只，隨機分為2組（每組8只），即正常對照組和δ-T3H（100 mg·kg-1）組。小鼠連續(xù)sc給藥5 d后，按0，1，4，7，10，14，18，22和28 d進行小鼠尾靜脈采血，將小鼠置小鼠固定器中，露出鼠尾，先找出小鼠尾靜脈，用刀片輕輕劃開小鼠尾靜脈，再用毛細血管吸取10 μL靜脈血，并將其加入2 mL稀釋液中混勻，最后利用血細胞分析儀檢測并得出結(jié)果。

1.6 流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血造血干細胞數(shù)量

雄性C57小鼠15只，隨機分為3組，每組5只。即正常對照組，δ-T3H 100 mg·kg-1單次sc給藥組和δ-T3H 100 mg·kg-1連續(xù)2 d sc給藥組。藥后24 h采血，小鼠給予ip注射3%戊巴比妥鈉麻醉后進行心臟采血，全血標本收集在加EDTA抗凝劑的EP管中備用。采集的小鼠外周血按1∶9比例加紅細胞裂解液，室溫條件下裂解30 min；室溫下500×g，離心5 min，棄上清液，1%BSA PBS洗1遍，離心條件同上；加Lineage、C-kit、Sca-1抗體（1∶50）后4℃孵育30 min；1%BSA PBS清洗1遍；然后加7-AAD染料避光染色5 min；最后加500 μL無血清1640，過濾到流式管，流式細胞儀檢測外周血中造血干細胞數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 δ-T3H單次給藥對小鼠血清中G-CSF含量的影響

δ-T3H 12.5 mg·kg-1可顯著增加血清中G-CSF含量（P＜0.05）（圖1A），隨著δ-T3H給藥劑量的增加，血清中G-CSF含量隨給藥劑量增加而明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），當(dāng)δ-T3H給藥劑量為100 mg·kg-1時，G-CSF生成達到飽和值（38.6±4.4）μg·L-1。小鼠sc給予δ-T3H 100 mg·kg-1，給藥后3 h，小鼠血清中G-CSF含量即顯著升高，且隨時間的延長繼續(xù)升高（圖1B），在給藥后24 h達峰值（36±12）μg·L-1后維持到給藥后48 h；72 h時血清G-CSF含量已相對含量最高值明顯降低，但至96 h時，血清G-CSF含量（8.8±4.1）μg·L-1依然顯著高于正常對照組G-CSF含量水平（0.4±0.1）μg·L-1（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of δ-tocotrienol（ δ-T3H）on serum granulocyte colony-stimulating factor（G-CSF）levels in mice by ELlSA.A：mice subcutaneously received δ-T3H administered at escalating doses（from 0 to 200 mg·kg-1）and serum G-CSF levels were measured 24 h later；B：mice received a single dose of δ-T3H 100 mg·kg-1and serum G-CSF levels were measured at indicated time points.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 mg·kg-1group.

2.2 δ-T3H單次給藥對小鼠血清炎癥相關(guān)細胞因子生成的影響

δ-T3H給藥后3 h，小鼠血清CXCL1含量顯著升高（P＜0.05）（圖2），6 h達峰值（1.4±0.5）μg·L-1，并持續(xù)到24 h，給藥后36 h降到已接近正常值水平（0.23±0.03）μg·L-1。IL-12和IL-10分別于δ-T3H給藥后36 h和48 h有一過性降低，而GM-CSF，TNF-α和IL-6的血清含量在δ-T3H給后不同時間點均無顯著變化。

2.3 δ-T3H單次給藥對小鼠不同組織器官G-CSF含量的影響

正常對照組小鼠肝和腎G-CSF含量最高（圖3A），其次為小腸和肺組織，胸腺、脾、淋巴結(jié)和骨髓組織G-CSF含量相對較低；δ-T3H給藥24 h后，小鼠胸腺、脾、淋巴結(jié)和骨髓組織G-CSF含量較正常對照組明顯增加（P＜0.05），而肝、腎、小腸和肺組織G-CSF含量無顯著變化。

2.4 δ-T3H連續(xù)給藥對小鼠血清造血調(diào)控相關(guān)細胞因子含量的影響

δ-T3H連續(xù)sc給藥5 d，小鼠血清G-CSF含量持續(xù)維持在較高水平〔（35.5±0.1）μg·L-1〕（圖4），停藥后2 d有明顯降低〔（19.4±4.3）μg·L-1〕，但仍保持顯著高（P＜0.01）；給藥期間TPO和EPO也有所升高，但升高幅度有限；而誘導(dǎo)干細胞遷移的SDF-1β在給藥期間及給藥后均無明顯變化。

Fig.2 Effect of δ-T3H on serum CXCL1，GM-CSF，TNF- α，lL-6，lL-10 and lL-12 levels in mice by ELlSA.Mice received a single dose of δ-T3H（100 mg·kg-1）and serum inflammation-related cytokines were measured at indicated time points then.CXCL1：C-X-C motif chemokine ligand 1；GM-CSF：granulocyte macrophage colony stimulating factor；TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL-6：interleukin-6.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control（0 h）group

Fig.3 Effect of δ-T3H on G-CSF levels in different tissue homogenate of mice by ELlSA.Mice were treated with vehicle or δ-T3H（100 mg·kg-1）by subcutaneous injection,subsequent measurement of G-CSF levels in different organs was performed 24 h later.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 δ-T3H連續(xù)給藥對小鼠外周血參數(shù)的影響

外周血白細胞在開始給藥后第3～18天期間顯著高于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01），給藥后14 d達峰值，較正常對照組升高了6倍，隨后降至正常水平（圖5）。中性粒細胞在給藥期間顯著高于正常對照組水平（P＜0.01），給藥后第3天顯著升高，14 d達峰值，22 d顯著降低，隨后降至正常水平。外周血單核細胞在開始給藥后第1天即開始升高（P＜0.05，P＜0.01），停藥后仍持續(xù)增加，給藥后第7天達峰值，隨后緩慢降低，至22 d降至正常水平。外周血淋巴細胞在給藥后5至10 d明顯低于正常對照組（P＜0.05），隨后恢復(fù)到正常水平。血小板呈現(xiàn)兩個升高峰，一是在給藥后第3天明顯高于正常對照組（P＜0.01），隨后降低；二是在給藥后14～22 d明顯高于正常對照組（P＜0.05），隨后降到正常水平。紅細胞在給藥后10～28 d均明顯低于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01），但仍維持在正常值范圍內(nèi)，未表現(xiàn)出明顯的貧血癥狀。

Fig.4 Effect of δ-T3H on serum G-CSF，EPO，SDF-1 β，TPO levels in mice by ELlSA.Mice were sc injected with δ-T3H（100 mg·kg-1）for 5 d and serum hematopoietic related cytokines were measured at indicated time points then.EPO：erythropoietin；SDF-1β：stromal cell-derived factor-1β ；TPO：thrombopoietin.x± s，n=5. ＊＊P＜0.01，compared with normal control（0 h）group.

2.6 δ-T3H單次給藥對小鼠外周血壓造血干細胞的數(shù)量的影響

如圖6所示，δ-T3H單次sc給藥組小鼠外周血單核細胞數(shù)量明顯升高（P＜0.01），δ-T3H連續(xù)2 d sc給藥組升高單核細胞數(shù)更顯著（P＜0.01）。流式細胞術(shù)分析外周血造血干細胞LSK（Lin-Sca1+C-Kit+）和祖細胞LK（Lin-Sca1-C-Kit+）的數(shù)量，與正常對照組相比，δ-T3H連續(xù)2 d sc給藥組LSK數(shù)量顯著增加（P＜0.01），單次sc給藥組LK數(shù)量略有降低，但無統(tǒng)計差異。表明δ-T3H可能通過誘導(dǎo)體內(nèi)G-CSF生成動員小鼠骨髓造血干細胞進入外周血，促進外周血造血干細胞數(shù)量的增加。

Fig.5 Effect of δ-T3H on peripheral blood counts in mice.Mice were sc injected with vehicle or δ-T3H（100 mg·kg-1）for 5 d，peripheral blood cells were counted at indicated time points.x ± s，n=8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.6 Effect of δ-T3H on numbers of hematopoietic stem cells in peripheral blood analyzed by flow cytometry.δ-T3H 100 mg·kg-1was sc administered at a single dose or once day for 2 d.±s,n=5.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with normal control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H促進內(nèi)源性G-CSF生成具有劑量和時間依賴效應(yīng)。且通過檢測小鼠血清中其他細胞因子發(fā)現(xiàn)，δ-T3H促進小鼠體內(nèi)G-CSF生成具有相對專一性。研究發(fā)現(xiàn)δ-T3H能顯著增加小鼠淋巴-造血組織如胸腺、脾、淋巴結(jié)和骨髓組織液中的G-CSF含量，在一定范圍內(nèi)促進造血相關(guān)細胞因子生成。另外δ-T3H能顯著促進小鼠外周血粒細胞的生成，促進外周血造血干細胞的生成，具有一定的造血活性。

G-CSF是骨髓造血的重要調(diào)節(jié)因子，重組人G-CSF在粒細胞減少癥、造血干細胞動員等方面具有明確的療效，粒細胞減少癥患者一般會產(chǎn)生機體內(nèi)的感染導(dǎo)致相關(guān)炎癥細胞因子的改變［13］。臨床上多應(yīng)用G-CSF治療粒細胞減少癥，但存在免疫原性和安全性隱患［14］。δ-T3H作為自然存在的維生素E類小分子化合物，在胭脂果油中含量豐富，易于獲得［15］。研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H除對小鼠中性粒細胞趨化因子CXCL1生成有一定的促進作用外，不影響其他細胞因子如GM-CSF，TNF-α，IL-6，IL-10和IL-12的生成。δ-T3H作為抗炎的小分子化合物通過MAPK和PPAR信號通路抑制NF-κB活性，抑制促炎細胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-1β和 IL-6）的產(chǎn)生［16］。δ-T3H作為放射防護劑通過刺激體內(nèi)G-CSF的生成而產(chǎn)生放射防護作用［11］。但δ-T3H誘導(dǎo)體內(nèi)G-CSF生成的效應(yīng)細胞及信號通路還有待于進一步研究。既往文獻報道生育三烯酚通過單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞等誘導(dǎo)生成G-CSF［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H可顯著增加小鼠淋巴-造血組織如胸腺、脾、淋巴結(jié)和骨髓組織的G-CSF含量。所以δ-T3H有可能通過誘導(dǎo)體內(nèi)內(nèi)源性G-CSF生成作用而應(yīng)用在腫瘤放化療導(dǎo)致的炎癥感染和粒細胞減少癥等疾病中。

G-CSF臨床應(yīng)用在自體或異體造血干細胞移植，G-CSF能動員骨髓造血干細胞進入血液的骨髓靜脈竇的近端和遠端細胞，同時有效減少并發(fā)癥的產(chǎn)生［19］。檢測血清中G-CSF作為造血細胞因子與其他造血相關(guān)細胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)δ-T3H連續(xù)給藥后在一定范圍內(nèi)促進小鼠血清中TPO和EPO升高，能持續(xù)性維持機體內(nèi)高水平的G-CSF含量。另外，δ-T3H連續(xù)給藥5 d后，小鼠外周血白細胞、中性粒細胞和單核細胞顯著增加，說明δ-T3H通過升高G-CSF動員單核細胞和中性粒細胞進入外周血，而且對髓系造血干、祖細胞也有促增殖作用。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H給藥期間及給藥后淋巴細胞和紅細胞計數(shù)較對照組有一過性降低，其作用機制尚不清楚。G-CSF作為造血動員劑存在高達30%的概率對健康機體的G-CSF無反應(yīng)，這樣就需要另選用高成本的藥物普利沙福（plerixafor），無疑增加了患病者的醫(yī)藥負擔(dān)［20］。據(jù)報道諸如鈷原卟啉Ⅸ通過增加內(nèi)源性G-CSF，動員骨髓造血干細胞和粒細胞進入外周血，但其光毒副作用及其生物利用度等弊端還需進一步優(yōu)化［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H作為小分子化合物能通過升高小鼠外周血造血干細胞數(shù)而促進體內(nèi)造血活性，δ-T3H有望作為造血動員劑動員骨髓造血干細胞入血。

δ-T3H作為脂質(zhì)維生素類小分子化合物，有可能會在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成其他形式的維生素E類而降低療效。盡管δ-T3H有促進健康機體中G-CSF含量的升高和促進粒細胞升高的作用，但其效應(yīng)細胞和作用機制，還需利用生物細胞技術(shù)以及基因敲除技術(shù)進一步研究。但δ-T3H促進G-CSF生成及其促造血活性的能力提示其在腫瘤放、化療引起的中性粒細胞減少癥、造血干細胞動員等方面具有潛在的應(yīng)用前景。