漢防己乙素抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化緩解心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡和線粒體氧化損傷

李 昌，王愛玲，肖躍紅，張占海，張 琮，曾憲峰

（1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系，河南 南陽 473000；2.南陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽473000；3.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 南陽 473000）

由心血管事件和急性心肌缺血低氧性心肌病引起的心血管疾病在世界范圍內(nèi)是一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，發(fā)病率和死亡率均在不斷上升［1］。近年來，心血管疾病的臨床治療主要包括及時(shí)復(fù)活、溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，以恢復(fù)供血平衡，從而治療心血管疾病［2］。但再灌注也會(huì)導(dǎo)致一系列不良事件，如線粒體代謝異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥細(xì)胞因子釋放、心肌細(xì)胞凋亡，從而加重?fù)p傷程度［3］。心力衰竭患者5年生存率遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年升高，因此，急需開發(fā)減輕心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的新藥。漢防己乙素（fangchinoline，F(xiàn)an）是一種從防己科千金藤屬植物粉防己塊根分離的生物堿，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性［4-6］。且已有研究表明，F(xiàn)an能抑制肝I/R損傷時(shí)氧自由基的生成，增強(qiáng)對其的清除，從而保肝［7］。Fan對心肌I/R損傷的作用雖然尚不清楚，但已有報(bào)道，粉防己堿（tetrandrine）能明顯抑制I/R損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)、減少Bax蛋白表達(dá)、升高Bcl-2/Bax比值有關(guān)［8］，因此，預(yù)測與粉防己堿同為雙芐基異喹啉衍生物的Fan對心肌I/R時(shí)心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷也具有抑制作用。本研究主要探討Fan對心肌I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷的影響，以期為Fan應(yīng)用于臨床治療心肌缺血引起的心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

Fan（純度HPLC≥99%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，中國）用10%DMSO和90%生理鹽水溶液配制成1，3，10 mg·mL-1溶液，鹽酸維拉帕米（verapamil hydrochloride，VH，純度HPLC≥98%，江蘇四環(huán)生物制藥有限公司）用生理鹽水配制成20 mg·mL-1溶液）；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（PIERCE公司，美國）；MatrigelTM底膜基質(zhì)（BD公司，美國）；兔抗大鼠胱天蛋白酶3、Bcl-2、Bax、c-Myc、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38 MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulatory protein kinase，ERK1/2）單克隆抗體（Sigma公司，美國）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；大鼠肌紅蛋白（myohemoglobin，Mb）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK-Mb）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司，美國）；OLYMPUS DP71顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)有限公司，日本）；高速低溫離心機(jī)（Beckman公司，美國）；電泳槽和電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP（UVP公司，美國）。

1.2 動(dòng)物、心肌l/R損傷模型制備和分組

54只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001。鼠齡為6～8個(gè)月，體質(zhì)量200～240 g。隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組（I/R）、I/R+Fan 1，3和 10 mg·kg-1組，I/R+VH 20 mg·kg-1組，每組9只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈缺血30 min后，松開結(jié)扎線再灌注90 min。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，其余操作相同。I/R+Fan 1，3和10 mg·kg-1組和I/R+VH 20 mg·kg-1組在造模前 20 min ip 給予 Fan 1，3，10 mg·kg-1或 VH 20 mg·kg-1［9］，假手術(shù)組和I/R 組大鼠ip給予等量10%DMSO和90%生理鹽水溶液。檢測各組大鼠心功能指標(biāo)后，處死大鼠，收集外周血，分離心肌組織，用于后續(xù)檢測。

1.3 心功能指標(biāo)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）和左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）的檢測

取1.2分組大鼠，左側(cè)股動(dòng)脈插管，連接三通和U型水銀血壓計(jì)，用于記錄MAP；右側(cè)頸總動(dòng)脈插管至左室，連接BioLab-410型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)測定LVSP。

1.4 ELlSA檢測血清中Mb和CK-MB的含量

按大鼠Mb和CK-MB ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清Mb和CK-MB的含量。

1.5 HE染色觀察心肌組織病理損傷

每組大鼠取左室相同部位心肌組織放入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色：將切片分置二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、梯度乙醇各10 min，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

1.6 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡

將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水及抗原修復(fù)，然后使用TUNEL反應(yīng)試劑盒，將配好的反應(yīng)液滴于標(biāo)本上，置濕盒中，37℃ 1 h。用PBS洗3次，每次15 min，滴加合適濃度的ToPro15 min，然后再用PBS洗3次，每次15 min。最后用中性樹脂封片，在OLYMPUS DP71顯微鏡下拍照。

1.7 試劑盒檢測心肌細(xì)胞SOD活性及MDA和GSH含量

每組大鼠于左心室相同部位取100 mg心肌組織勻漿，分別采用SOD，MDA和GSH試劑盒測定SOD活性及MDA和GSH含量。

1.8 Western印跡法檢測心肌組織胱活化天蛋白酶3、Bcl-2、Bax、c-Myc蛋白表達(dá)水平和P38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平

每組大鼠于左心室相同部位取250 mg心肌組織勻漿，加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，1∶3加入，勻漿，15 000×g，離心 10 min，取上清，據(jù)BCA試劑盒說明書測蛋白濃度。勻漿上清液與上樣緩沖液1∶1配比，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗大鼠單克隆一抗（胱天蛋白酶3 1∶1000，Bcl-2 1∶500，Bax 1∶1000，c-Myc 1∶500，p-P38 MAPK 1∶1000，P38 MAPK 1∶1000，p-ERK1/2 1∶1000，ERK1/2 1∶1000）4℃過夜，山羊抗兔二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發(fā)光劑顯影，采用 Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示蛋白表達(dá)水平，以磷酸化蛋白與總蛋白比值表示蛋白磷酸化水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fan對心肌l/R大鼠心功能MAP和LVSP的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組LVSP和MAP水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Fan 3和10 mg·kg-1及I/R+VH 20 mg·kg-1組LVSP和MAP水平均顯著升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of fangchinoline（Fan）on mean arterial pressure（MAP） and left ventricular systolic pressure（LVSP）of ischemia/reperfusion（l/R）rats

2.2 Fan對心肌l/R大鼠血清中Mb和CK-MB含量的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組Mb和CK-MB含量顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，F(xiàn)an 3，10 mg·kg-1和I/R+VH20mg·kg-1組Mb和CK-MB含量均顯著降低（P＜0.05）（表2）。

Tab.2 Effect of Fan on serum myohemoglobin（Mb）and creatine kinase MB（CK-MB）in l/R rats

2.3 Fan對心肌l/R大鼠心肌病理損傷的影響

假手術(shù)組心肌細(xì)胞邊緣清晰，核膜完整，心肌纖維排列整齊，無細(xì)胞間物質(zhì)水腫；I/R組和I/R+Fan 1 mg·kg-1心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，明顯的細(xì)胞間質(zhì)水腫，界限模糊，有少量交叉條紋；I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH20 mg·kg-1組心肌細(xì)胞心肌排列紊亂和心肌損傷明顯減輕（圖1）。

Fig.1 Effect of Fan on myocardial pathological changes in l/R rats（HE staining）.See Tab.1 for rat treatment.Arrows show the locations of serious myocardial injury.

2.4 Fan對心肌l/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Fan3，10mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）（圖2和表3）。

2.5 Fan對心肌l/R大鼠心肌細(xì)胞SOD活性、GSH和MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞中SOD活性和GSH含量均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與 I/R 組比較，I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1組大鼠心肌細(xì)胞中SOD活性和GSH含量均顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）（表4）。

2.6 Fan對心肌l/R大鼠心肌細(xì)胞活化胱天蛋白酶3、Bax、Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Fan 3，10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1組大鼠心肌細(xì)胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

Fig.2 Effect of Fan on cardiomyocyte apoptosis in l/R rats（TUNEL staining）.See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show apoptotic cells.

Tab.3 Effect of Fan on cardiomyocyte apoptosis in l/R rats

Tab.4 Effect of Fan on SOD activity，GSH and MDA content of myocardial cells in l/R rats

2.7 Fan對心肌l/R大鼠心肌細(xì)胞P38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平的影響

圖4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞中P38和ERK1/2的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Fan 3和10 mg·kg-1和I/R+VH 20 mg·kg-1組大鼠心肌細(xì)胞中P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of Fan on protein expressions of cleaved-caspase 3，Bcl-2，Bax and c-Myc in cardiomyocytes of l/R rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with sham group；#P＜0.05，compared with I/R group.

Fig.4 Effect of Fan on phosphorylation of P38 mitogenactivated protein kinase（P38 MAPK）and extracellular regulatory protein kinase 1/2（ERK1/2） in cardiomyocytes of l/R rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with sham group；#P＜0.05，compared with I/R group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)an升高心肌I/R大鼠LVSP和MAP水平，降低Mb和CK-MB含量，減輕心肌損傷，降低心肌細(xì)胞凋亡率，升高心肌細(xì)胞中SOD活性和GSH水平，降低心肌細(xì)胞中活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平降低，心肌細(xì)胞中P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，提示Fan對心肌I/R大鼠具有一定的保護(hù)作用。

心血管疾病在世界范圍內(nèi)普遍存在且死亡率高［10］。已有研究表明，心肌I/R大鼠的LVSP和MAP水平均明顯降低，CK-MB含量升高［11］。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)an處理后，LVSP和MAP均升高，Mb和CK-MB含量均降低。因此，F(xiàn)an可改善心肌I/R大鼠的心臟功能。

心肌I/R伴隨持續(xù)的I/R損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［12-13］。細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的重要病理過程，凋亡水平?jīng)Q定了心肌I/R損傷的嚴(yán)重程度［14］。LIU等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在心肌I/R期間，心肌細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞的丟失并直接影響心臟功能。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)an處理后，心肌細(xì)胞凋亡率降低，說明Fan可緩解心肌I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致I/R損傷的主要因素之一［16］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)an處理后，SOD活性和GSH含量升高，MDA含量降低。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，已用于評(píng)估I/R心肌的氧損傷；SOD活性和GSH/氧化型GS率水平用于評(píng)估組織過氧化損傷［17］。生理上，ROS通過SOD變?yōu)檫^氧化氫或被抗氧化劑分子如GSH還原。然而，當(dāng)ROS量超過酶抗氧化能力時(shí)，發(fā)生氧化應(yīng)激。這種變化可能導(dǎo)致不飽和脂肪經(jīng)歷脂質(zhì)過氧化作用，從而加劇心肌損害［18］。因此，F(xiàn)an可緩解心肌I/R引起的氧化損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)an處理后，活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平升高。胱天蛋白酶3作為凋亡過程中的主要末端切割酶，參與DNA修復(fù)和基礎(chǔ)完整性，Bcl-2通過抑制線粒體破裂、胱天蛋白酶3活化和Bax細(xì)胞毒性來防止細(xì)胞凋亡，而c-Myc可通過激活Bax誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體釋放［19］。這說明Fan抑制I/R大鼠心肌細(xì)胞線粒體氧化損傷。

包括 P38 MAPK，ERK1/2和JNK在內(nèi)的MAPK具有廣泛的生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、基因表達(dá)、分化、有絲分裂和凋亡［20］。研究表明，P38的激活發(fā)生在I/R過程中，抑制P38 MAPK活化可保護(hù)心肌線粒體免受I/R損傷［21］。在心肌I/R過程中，作為一種早期的適應(yīng)性機(jī)制，AMPK在缺血性心肌中被激活，而這種固有的AMPK激活在預(yù)防心臟損傷中具有有益作用［22］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)an處理后，P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平降低，提示Fan可抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，從而保護(hù)心肌免受I/R損傷。

VH為鈣離子拮抗劑，有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血液通過量、減緩心肌興奮性和房室傳導(dǎo)、抗心律失常的作用，常用于心絞痛和高血壓治療。但使用時(shí)會(huì)出現(xiàn)上腹部不適、疼痛、灼熱感、食欲下降、惡心、嘔吐和泛酸水等副作用。不可否認(rèn)的是，VH已被公認(rèn)為快速、強(qiáng)效的心肌I/R的保護(hù)劑，在藥效研究中常被作為心肌缺血在損傷的陽性對照藥物。本文研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)an與VH一樣可抑制I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡和線粒體氧化損傷，抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。

綜上所述，F(xiàn)an能抑制P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化，緩解心肌I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，為Fan應(yīng)用于臨床治療心肌缺血引起的心血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。