靶向寄生蟲的核酸適配體應用研究進展

楊 帆，李石柱，秦志強

盡管寄生蟲病的防治已取得了顯著成效，但欠發(fā)達國家仍有數(shù)以億計的人正遭受寄生蟲病的危害。在缺乏有效疫苗的情況下，寄生蟲病的防治主要依賴于檢測和治療以及媒介的控制[1]。目前，診斷寄生蟲感染的金標準主要基于顯微鏡檢查的病原學方法，但病原檢測敏感性較低、容易漏檢、費事費力且對操作人員技術要求較高，檢測結果易受制片質(zhì)量和主觀影響。因此，多年來人們一直探尋敏感性較高的免疫學和核酸檢測方法來應用于寄生蟲感染的臨床診治以及流行病學篩檢。此外，傳統(tǒng)的抗寄生蟲藥物種類較為單一，部分地區(qū)的寄生蟲感染者也逐漸出現(xiàn)了抗藥性，因此亟需尋找新的藥物來控制寄生蟲感染。核酸適配體作為一種穩(wěn)定、有效、經(jīng)濟的生物識別元件，有望發(fā)展用于寄生蟲感染的檢測試劑和治療藥物。本文綜述了靶向瘧原蟲(Plasmodiu m)、錐蟲(Trypanosome)、利什曼原蟲(Leishmania)等寄生蟲的核酸適配體應用研究，旨在為寄生蟲感染的檢測和防治提供借鑒。

1 核酸適配體

核酸適配體是一類長度為20～100個核苷酸的單鏈DNA或RNA分子，可通過其獨特的三維結構與靶分子特異性結合，平衡解離常數(shù)(equilibriu m dissociation constants，Kd)介于納摩爾和皮摩爾范圍，具有與抗體相媲美的高親和力和特異性，被稱為“化學抗體”[2]。此外，核酸適配體可于室溫下生產(chǎn)和儲存，易于實現(xiàn)商業(yè)化應用，可替代抗體成為診斷和治療的特定標記物[3]。目前，核酸適配體已被應用于新藥開發(fā)、診斷試劑、藥物遞送劑、生物成像劑等生命科學、醫(yī)學、環(huán)境和食品等領域[4]。

核酸適配體一詞最早由Ellington和Szostak[5]于1990年提出，用于描述特異性結合多種有機染料的RNA分子。同年，Tuerk和Gold[6]開發(fā)了指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systematic evol ution of ligands by exponential enrich ment，SELEX)技術，用于體外篩選特異性結合噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA。SELEX是對包含4n個獨立核酸序列的隨機文庫進行迭代選擇，以獲取高親和力和特異性結合靶標(候選核酸)的過程。SELEX主要包含核酸文庫與靶標分子孵育結合、富集的復合物分離與洗脫和結合序列的PCR擴增等步驟，通過不斷提高篩選條件的嚴格性，直至獲得高親和力結合序列。SELEX各輪次結束后，將富集的核酸序列克隆到合適載體中，進行測序和鑒定[7]。迄今為止，基于SELEX方法，針對小分子、蛋白、細胞、病毒、細菌、寄生蟲等多種靶標，篩選獲得了數(shù)千個具有高親和力和特異性的核酸適配體[8-9]。理論上，可以針對無限范圍的靶標選擇核酸適配體，包括不能被抗體識別的有毒和非免疫原性分子。與抗體(5～15 k Da、直徑約15 n m)相比，核酸適配體具有較低的相對分子質(zhì)量(6～30 k Da)和較小尺寸(直徑約2 n m)，可結合較小的靶標或某些抗體無法抵達的隱藏結合域。此外，核酸適配體不存在免疫原性的限制[10]。核酸適配體需要在血管系統(tǒng)中存在足夠長的時間，順利到達靶標所在位置，通過與靶標的相互作用，發(fā)揮疾病檢測、治療等作用[11-12]。截至目前，通過篩選獲得的核酸適配體中，哌加他尼(Macugen)已獲得了美國食品與藥品管理局的批準，可應用于臨床，作為聚乙二醇化修飾的RNA適配體，Macugen可用于治療黃斑變性和糖尿病黃斑水腫[13]。

2 靶向寄生蟲的核酸適配體

目前，針對寄生蟲感染的核酸適配體開發(fā)策略主要有:①靶向宿主細胞基質(zhì)受體，阻礙寄生蟲與宿主間的相互作用;② 抑制寄生蟲細胞蛋白功能;③攻擊寄生蟲細胞內(nèi)血紅素或干擾細胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)運;④ 靶向寄生蟲細胞蛋白保守結構域，用于寄生蟲感染診斷和鑒定，或充當抗寄生蟲藥物的傳送載體。

2.1 靶向瘧原蟲的核酸適配體 瘧疾是一種重要的熱帶病。2017年全球約有2.19億瘧疾病例，死亡人數(shù)約43.5萬[14]。在已知感染人類的5個瘧原蟲蟲種中，惡性瘧原蟲(P.f alciparum)和間日瘧原蟲(P.vivax)最為常見。惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1(P.f alciparum erythrocyte me mbrane protein 1，Pf EMP1)在寄生蟲致病性中發(fā)揮重要作用，可使被感染紅細胞黏附在血管內(nèi)皮層，未感染紅細胞形成“玫瑰花結”?！懊倒寤ńY”為毒力相關表型，由Pf EMP1的N末端達菲結合樣結構域(N-ter minal duff y-binding-like domain 1α，DBL1α)介導形成。因此，DBL1α有望成為治療瘧疾新藥和疫苗的候選靶標，Barfod等[15]通過8輪SELEX從體外篩選獲了3個與Pf EMP1中半保守表位DBL1α結合的RNA適配體b02、d12和e05，具有定位受感染紅細胞的潛力，387 n mol/L的RNA適配體對“玫瑰花結”的破壞能力為100%。另外，有研究表明，阻斷惡性瘧原蟲的血紅素降解，可以有效抑制其生長發(fā)育[16-17]。Niles等[18]以能與血紅素卟啉結合的DNA適配體PS2 R和PS2 M Mod為研究對象，經(jīng)3′-反向脫氧胸苷修飾后，導入至紅細胞內(nèi)，證明了血紅素結合DNA適配體可抑制惡性瘧原蟲血紅素的解毒途徑。

Lee等[19]報告了針對間日瘧原蟲乳酸脫氫酶(P.vivax lactate dehydrogenase，Pv LDH)和惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(P.f alciparum lactate dehydrogenase，Pf LDH)的 DNA 適配體——p L1，Kd依次為(16.8±0.6)n mol/L、(38.7±1.3)n mol/L。在此基礎上，該課題組開發(fā)了一種基于p L1和陽離子聚合物(聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙胺鹽酸鹽)介導的金納米顆粒聚集的瘧疾診斷生物傳感器，可快速、準確地檢測瘧疾患者陽性血液樣本中的瘧原蟲乳酸脫氫酶。基于聚二烯丙基二甲基氯化銨和p L1的傳感器檢測限分別為80個間日瘧原蟲/μL、92個惡性瘧原蟲/μL，基于聚烯丙胺鹽酸鹽和p L1的傳感器檢測限分別為74個間日瘧原蟲/μL、97個惡性瘧原蟲/μL[20]。Cheung等[21]描述了以高親和力和特異性結合Pf LDH的DNA適配體2008s的選擇和表征。2008s經(jīng)20輪SELEX篩選獲得，通過獨特的扭曲發(fā)夾結構實現(xiàn)與靶標的特異結合，Kd為42 n mol/L。隨后，基于2008s開發(fā)了一種敏感的核酸適配體拴系酶捕獲(aptamer-tethered enzy me capt ure，APTEC)分析方法，該方法對惡性瘧血樣具有特異性，可以區(qū)分間日瘧血樣[22]。此外，報道顯示PLDH表面的抗原決定簇可作為識別瘧原蟲屬的生物標志物[23]。基于此，F(xiàn)rith等[24]以Pf LDH的表位寡肽為靶標，使用SELEX策略篩選獲得的DNA適配體LDHp 11，也可用于區(qū)分惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲感染。

Singh等[25-26]基于以高親和力特異性結合惡性瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(P.f alciparum gl uta mate dehydrogenase，Pf GDH)的硫醇化DNA適配體NG3(Kd＝79 n mol/L)，開發(fā)了可檢測血清樣品Pf GDH的電容式和場效應晶體管傳感器，檢出限分別為0.77、48.6 p mol/L。

最近，Joseph等[27]利用基因表達數(shù)據(jù)庫、核糖體譜分析和結構建模，發(fā)現(xiàn)高遷移率族Box 1蛋白(high mobility group box 1 protein，H MGB1)高表達于惡性瘧原蟲的所有血液階段。他們以惡性瘧原蟲的H MGB1為靶標，進行了14輪SELEX，從9個潛在的DNA適配體中確定了Pf R6，能以高親和力[Kd＝(65±15)n mol/L]與靶標發(fā)生特異性結合。

2.2 靶向錐蟲的核酸適配體 布氏錐蟲(T.br ucei)引起的人類非洲錐蟲病(昏睡病)，是一種流行于撒哈拉以南非洲的人獸共患寄生蟲病[28]。布氏錐蟲系一種細胞外寄生蟲，可在宿主的外周血、毛細血管和組織液中繁殖。血液階段的布氏錐蟲表面約有1億個變異表面糖蛋白(variant surface glycoproteins，VSGs)在細胞膜上作快速橫向運動，細胞膜上同時也存在不變表面糖蛋白(invariant surface glycoproteins，ISGs)、受體復合物、轉(zhuǎn)運蛋白分子等其他表面分子。這些表面分子一部分嵌入VSGs層內(nèi)，分布在錐蟲細胞體表面(包括鞭毛)，另一部分分布于鞭毛袋中，通過鞭毛基部周圍質(zhì)膜的內(nèi)陷發(fā)揮胞吞和和胞吐作用。錐蟲可通過DNA同源重組的方式改變VSGs的抗原特性，逃脫宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。錐蟲基因組約編碼1 000個不同的vsg基因，但特定時間段內(nèi)僅表達1個VSG，1種VSG變體轉(zhuǎn)換為另1種VSG變體的頻率約10-2～10-7/每代細胞，屬于隨機事件，VSGs的抗原可變特性使宿主無法有效清除感染，同時加大了抗錐蟲疫苗的研發(fā)難度[29]。

Ho mann等[30]以布氏錐蟲細胞系 MITat 1.2(表面穩(wěn)定表達VSG221)和MITat 1.4(表面穩(wěn)定表達VSG117)為靶標，進行了12輪SELEX篩選。MITat 1.2、MITat 1.4可作為血液階段布氏錐蟲的代表，在60 min的孵育期內(nèi)完成與RNA的結合。構建的RNA適配體庫無法區(qū)分MITat 1.2和MITat 1.4(提示RNA適配體可能與VSG的恒定結構域或其他保守表面分子相互作用，不依賴于錐蟲表面表達的特定VSG)，也無法識別昆蟲階段的布氏錐蟲(結合效率≤0.1%)。核酸適配體庫中結合能力最強的RNA適配體為2-16，與靶標的親和力為(60±17)n mol/L，結合位點是鞭毛袋中42 k Da蛋白，具有將宿主免疫系統(tǒng)重定向至錐蟲表面的潛力。適配體2-16與鞭毛袋中42 k Da蛋白結合后，會降解為含50個核苷酸的核心序列，通過特異性受體介導的內(nèi)吞途徑轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的溶酶體[31]。為使2-16轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定、血清穩(wěn)定的RNA適配體，Adler等[32]通過化學修飾制備了2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧2′-氨基-尿苷、2′-脫氧2′-氨基-胞苷取代的 RNA。結果顯示，2-16被2′-脫氧2′-氨基-尿苷、2′-脫氧2′-氨基-胞苷取代后，活性喪失，僅2′-脫氧-2′-氟取代的2-16保留了與活錐蟲鞭毛袋結合的能力(氟修飾前后的Kd分別為10、45 nmol/L)，具有熱穩(wěn)定性(Tm＝75℃)，與10 k Da的聚乙二醇結合后，在血清中的半衰期可達3.4 d，且保留了較高的生物學活性。Ho mann等[33]還報道了1種具有穩(wěn)定G四聯(lián)體結構的RNA適配體——N2，經(jīng)13輪SELEX選擇獲得，與MITat 1.2的親和力為(70±15)n mol/L。用嘧啶堿基的2′-氨基取代2′-羥基后，N2在人血清中的半衰期可超過30 h。該N2的結合僅限于布氏錐蟲細胞體和鞭毛之間的鞭毛附著區(qū)，可能具有干擾鞭毛附著的潛力。此外，Lor ger等[34]以MITat 1.2和MITat 1.4的VSG保守結構域為靶標，經(jīng)9輪SELEX篩選獲得的RNA適配體——cl.57，與靶標的親和力分別為(0.3±0.05)、(0.4±0.02)n mol/L，結合位點可能為VSG保守結構域的N末端。實驗顯示，未修飾的原始cl.57在血清中的半衰期為10 s，經(jīng)2′-氟修飾后，其半衰期可達15 h。Zelada-Guillén等[35]基于cl.57開發(fā)了電位碳納米管核酸適配體傳感器，可對血液中低至10 p mol/L濃度的VSG作出實時響應，分析時間為2～10min。

克氏錐蟲(T.cr uzi)引起的美洲錐蟲病(恰加斯病)是西半球最重要的寄生蟲病，心臟受累是最常見的特征，30%～40%的感染者會出現(xiàn)心肌病[36]。已知宿主細胞表面的硫酸乙酰肝素、纖連蛋白、層粘連蛋白和血小板反應蛋白在介導克氏錐蟲黏附和入侵宿主過程中發(fā)揮重要作用，在此基礎上，Ulrich等[37]以硫酸乙酰肝素、纖連蛋白、層粘連蛋白和血小板反應蛋白為靶標，通過8輪SELEX篩選，獲得了4個RNA適配體——HS6、F4、L28和T6，對靶標的親和力依次為40、124、209和400 n mol/L。實驗顯示，1μmol/L RNA適配體即可抑制克氏錐蟲對LLC-MK2猴腎細胞的體外入侵，抑制率約50%～70%。

Nagar katti等[38]利用全細胞SELEX策略開發(fā)了與克氏錐蟲鞭毛體結合的血清穩(wěn)定RNA適配體——Apt16、Apt 25、Apt 68和Apt 79，Kd分別為(22.96±1.6)、(22.12±3.9)、(7.62±1.63)和(29.92±5.62)n mol/L，可特異性捕獲血流階段的克氏錐蟲。實驗顯示，包被Apt 68的磁珠可用于檢測低至5個克氏錐蟲/15 mL濃度的全血樣品。此外，克氏錐蟲作為一種細胞內(nèi)寄生蟲，其分泌的分泌抗原(T.cr uzi excreted secreted antigens，TESA)也可作為檢測其感染的特異性標志物，Nagar katti等[39]經(jīng)過10輪SELEX處理，篩選到可特異性識別TESA的RNA適配體Apt-L44，成功檢測了急性期(7～28 d)和慢性期(55～230 d)感染小鼠血漿中的TESA。

2.3 靶向利什曼原蟲的核酸適配體 利什曼原蟲引起的利什曼病是一種廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲和中南美洲的寄生蟲病，每年全世界約有70萬～100萬的報告病例[40-41]。利什曼原蟲組蛋白與高等真核生物核心組蛋白的序列相似性主要位于球狀區(qū)域，二者N末端和C末端結構域中的高度差異序列具備開發(fā)為疾病診斷、治療靶標的潛力。已有研究顯示，H2 A蛋白可作為犬內(nèi)臟利什曼病血清學診斷工具[42-43]。Ramos等[44]以嬰兒利什曼原蟲組蛋白H2 A(L.infantu m histone H2 A，Li H2 A)為靶標，經(jīng)3輪SELEX篩選，成功分離了一個名為SEL H2 A的DNA序列庫，Kd為(2.065±0.652)n mol/L。SEL H2 A能與Li H2A特異性結合，通過酶聯(lián)寡核苷酸檢測和鑒定H2 A抗原的最低檢測限為50 ng。蛋白質(zhì)印跡結果顯示，SEL H2 A可從低背景的寄生蟲蛋白總裂解物中鑒別天然H2 A。該實驗室后續(xù)從SEL H2A的DNA序列庫中進一步分離出與Li H2 A親和力最高的2個DNA適配體——Apt Li H2 A#1和Apt Li H2 A#2，Kd分別為(0.96±0.17)、(1.16±0.28)n mol/L。2個DNA適配體可從10 000個嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體裂解物中檢出Li H2A[45]。此外，該課題組以嬰兒利什曼原蟲組蛋白H3(Li H3)為靶標，篩選獲得了可與靶標特異性結合的DNA適配體庫SELH3，Kd為(0.94±0.19)n mol/L[46]。

動基體膜蛋白11(kinetoplastid membrane protein-11，K MP-11)是動基體寄生蟲細胞膜的主要成分，為細胞骨架相關蛋白，可能與細胞遷移或鞭毛結構有關[47]。嬰兒利什曼原蟲的 K MP-11(Li KMP-11)為階段特異性表達，不同生命周期階段的Li K MP-11豐度和位置不同，鞭毛體階段的Li KMP-11表達水平顯著下調(diào)[48]。研究顯示，利什曼原蟲的K MP-11可作為自然感染過程中有效的抗體刺激劑和免疫動物T淋巴細胞增殖刺激劑[49-50]。Moreno等[51]在SELEX程序中使用膠體金來選擇針對Li KMP-11的高親和力DNA適配體，膠體金與Li K MP-11結合后可賦予其更高的質(zhì)量，有利于進一步離心純化。10輪SELEX選擇后獲得了DNA適配體庫SELK10，蛋白質(zhì)印跡結果顯示，SELK10能從嬰兒利什曼原蟲裂解物中鑒定出天然Li K MP-11，可作為抗Li K MP-11的多克隆化學抗體?；诖?，以SELK10為識別元件，開發(fā)了一種用于檢測Li K MP-11的電化學核酸適配體傳感器，可 檢 測 到 25 μg/μL(2.27 μmol/L)的Li K MP-11[52]。

真核生物的poly A結合蛋白(poly A binding protein，PABP)與mRNA的3′末端的poly A結合，參與翻譯起始、終止和mRNA從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運[53-54]。Guerra-Pérez等[55]以嬰兒利什曼原蟲poly A結合蛋白(Li PABP)為靶標，通過4輪SELEX，構建了DNA適配體庫SELLi PABP，Kd為(3.87±0.67)n mol/L。隨后，從SELLi PABP群體中分離了3個高親和力DNA適配體——Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11，可從2 500個嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體裂解物中檢測到Li PABP。Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11的Kd分別為(5.4±1.1)、(6.0±2.6)和(10.8±2.7)n mol/L，均可在低納摩爾濃度范圍內(nèi)特異性識別Li PABP，50 n mol/L DNA適配體可檢測6.25 ng Li PABP。研究顯示，3個DNA適配體均可實現(xiàn)對利什曼原蟲細胞裂解物中Li PABP的純化，與Ap-PABP#11相比(低于50%)，Ap PABP#3、Ap PA-BP#7純化效率達75%以上。然而，僅Ap PABP#11能破壞Li PABP與poly A的結合，可作為影響利什曼原蟲翻譯的潛在抑制劑，適用于前鞭毛體和鞭毛體2個階段的Li PABP。

Bhattacharyya等[56]以熱帶利什曼原蟲(L.tropica)線粒體為靶標篩選獲得的核酸適配體序列含有t RNA的反密碼子臂、D臂，VT區(qū)和受體莖等序列基序，可影響線粒體介導的t RNA運輸，以此干擾熱帶利什曼原蟲的生長發(fā)育。

2.4 靶向其它寄生蟲的核酸適配體 Long等[57]利用蟲卵SELEX技術篩選獲得了特異性結合日本血吸蟲(Schistosoma j aponicu m)蟲卵的2個DNA適配體——LC6和LC15，結合率分別為83.6%和70.2%，但僅LC15可以識別和捕獲肝組織中的日本血吸蟲卵，檢出率為80.5%。

切割因子的25 k D亞基(cleavage f actor I m 25，CFIm25)是一種能與poly A聚合酶相互作用的RNA結合蛋白，對寄生蟲毒力和存活至關重要，CFIm25的沉默可降低寄生蟲的活動性并誘導細胞死亡。Ospina-Villa等[58]通過7輪SELEX開發(fā)了針對溶組織阿米巴(Entamoeba histol ytica)的CFI m25的RNA適配體——C4和C5，可通過改變募集、切割和聚腺苷酸化反應，影響溶組織阿米巴滋養(yǎng)體的增殖、存活和毒力特性。

3 展 望

核酸適配體是利用核苷酸之間嚴格的識別能力和親和力而設計的人工合成寡核苷酸，靶標范圍廣泛，已被應用于識別各種靶標分子。核酸適配體既具有檢測的潛在價值，也可作為抗寄生蟲藥物的遞送載體，在寄生蟲學領域展現(xiàn)了良好的應用前景。經(jīng)典的SELEX方法已被證明是一種功能強大且有效的核酸適配體選擇程序，但仍需進一步優(yōu)化以提高篩選效率。引入陰性SELEX有助于消除與環(huán)境成分結合的非特異性序列，尤其是與固相基質(zhì)結合的非特異性序列。基于固相基質(zhì)磁珠的SELEX策略，可在磁場作用下快速分離與靶標結合的核酸適配體。利用高通量測序技術使每輪SELEX篩選可見，通過定量評估整個篩選周期中文庫組成的動態(tài)變化，可更高效、省時地獲得高親和力核酸適配體[59]。將SELEX方法與毛細管電泳、微流控等技術聯(lián)合，可縮短篩選輪次和時間，降低篩選成本，提高核酸適配體的檢測靈敏度和對不同靶標類型的適用性[60]。需要注意的是，以純化蛋白為靶標的SELEX策略不適用于不溶性蛋白、未知蛋白和僅以天然構象發(fā)揮作用的蛋白。對于這些局限，基于全細胞的SELEX策略可作為一種合理的替代方案。以整個細胞為靶標進行篩選，可保持靶標的天然構象，不需要預先進行靶標序列分析和蛋白純化。但細胞SELEX技術是一個復雜的過程，篩選過程中不可避免地會遇到細胞死亡，死細胞會與核酸適配體發(fā)生非特異性結合引起假陽性，營養(yǎng)不良和培養(yǎng)時間過長等不良培養(yǎng)條件可能使細胞表面生物學結構發(fā)生變化，從而為下一輪選擇保留了無用的核酸序列[61]。綜上，改進核酸適配體的篩選方法，將有望為進一步鑒定出特異靶向寄生蟲的分子和發(fā)展有效診斷試劑與藥物提供堅實的基礎。