耐藥基因blaNDM-1和mcr-1在腸道細(xì)菌中的研究進(jìn)展

呂東月，汪照國，王 鑫

1928 年英國微生物學(xué)家弗萊明首次發(fā)現(xiàn)了世界上的第一種抗生素——青霉素[1]，這是人類歷史上的重大發(fā)現(xiàn)。抗生素的發(fā)現(xiàn)使感染性疾病病死率大幅下降，同時(shí)感染性疾病并發(fā)癥的發(fā)病率也顯著降低。但是近年來，抗生素的頻繁使用，出現(xiàn)并加劇了細(xì)菌耐藥問題[2]，尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌中出現(xiàn)了多重耐藥(Multidrug-resistant，MDR)細(xì)菌。另外，全球經(jīng)濟(jì)一體化在促進(jìn)了各國之間的經(jīng)濟(jì)文化交流的同時(shí)，也加劇了細(xì)菌耐藥問題。如今，細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)成為人類面對(duì)的一大公共衛(wèi)生問題，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，嚴(yán)格控制細(xì)菌耐藥性的傳播已迫在眉睫。

2014年4 月30 日，WHO首次發(fā)布關(guān)注全球抗生素耐藥問題的報(bào)告，人類進(jìn)入后抗生素時(shí)代。如今，細(xì)菌抗生素耐藥性的發(fā)展和傳播是全球衛(wèi)生和食品安全的最大威脅之一[3]，引起了全世界的關(guān)注。2008年以來，各個(gè)國家相繼發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類藥物耐藥基因——blaNDM-1基因和多黏菌素耐藥基因——mcr-1基因。

本文就blaNDM-1基因和mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)、流行、耐藥機(jī)制及檢測(cè)方法等方面進(jìn)行綜述，以期能為嚴(yán)格控制抗生素的使用提供理論依據(jù)。

1 耐藥基因blaNDM-1和mcr-1的發(fā)現(xiàn)

1.1 blaNDM-1基因的發(fā)現(xiàn) blaNDM-1(New Delhi metallo-beta-lactamase 1，blaNDM-1)是一種質(zhì)粒編碼的全新的β-內(nèi)酰胺酶。由于其是多藥耐藥和廣譜耐藥，因此又被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。2009年首次發(fā)現(xiàn)blaNDM-1基因[4]。2010年，中國研究者在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)了中國首例blaNDM-1基因[5]。

2008 年初，在印度新德里一家醫(yī)院里，從一位男患者的尿液標(biāo)本中分離出了一株肺炎克雷伯菌，該菌對(duì)多種抗生素，尤其是碳青霉烯類抗生素耐藥。同年3月在該病人糞便標(biāo)本中分離出了同樣對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的大腸埃希菌。檢測(cè)結(jié)果顯示該病人體內(nèi)分離的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中均存在一種新的金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamase，MBL)，可轉(zhuǎn)移B類β-內(nèi)酰胺酶。與其他B類內(nèi)酰胺酶(例如I MP和VI M)相似，而與A、C和D類β-內(nèi)酰胺酶不同的是，blaNDM-1的活性位點(diǎn)存在鋅離子，而不是絲氨酸殘基[6-8]。由于該患者是在印度首都新德里接受治療時(shí)被含該MBL的細(xì)菌感染，因此，研究者將其命名為新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase)，即blaNDM-1，同時(shí)以blaNDM-1來命名編碼NDM-1的基因。blaNDM-1基因開放閱讀框架為813個(gè)堿基，編碼269個(gè)氨基酸，C-G的含量為57%，可以水解單環(huán)類以外的一大類β-內(nèi)酰胺類抗生素。除了β-內(nèi)酰胺類外，大多數(shù)blaNDM-1陽性細(xì)菌對(duì)其他類型的藥物均具有廣泛的耐藥性，即幾乎對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素以外的所有抗生素耐藥。blaNDM-1基因是從同一患者不同菌屬細(xì)菌分離出來，這表明它可能是可轉(zhuǎn)移的。由于其強(qiáng)耐藥性和傳播性，blaNDM-1迅速成為全球細(xì)菌耐藥相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注和研究的焦點(diǎn)之一?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的blaNDM-1基因的亞型有26種。其中，blaNDM-2基因是在鮑曼不動(dòng)桿菌中獲得的[9];blaNDM-3—blaNDM-7基因在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)10-11];blaNDM-14和blaNDM-15基因是由我國首次發(fā)現(xiàn)并命名的[12]。

1.2 mcr-1基因的發(fā)現(xiàn) 多黏菌素類抗生素被稱為對(duì)抗細(xì)菌感染的最后一道防線，常常作為飼料添加劑或治療藥應(yīng)用于畜牧業(yè)。多黏菌素類抗生素的廣泛使用促使了多黏菌素耐藥問題的出現(xiàn)。

2015 年，中國學(xué)者在一株豬源性大腸埃希菌SHP45中首次發(fā)現(xiàn)了可以讓細(xì)菌對(duì)多黏菌素產(chǎn)生抗藥性的新基因——mcr-1(Mobile Colistin Resistance-1)[13]。其開放閱讀框?yàn)? 626 bp，G-C含量49%，位于Inc Hl2型質(zhì)粒上。mcr-1基因是質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因，可介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多粘菌素類藥物產(chǎn)生耐藥性并可通過質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。正是因?yàn)閙cr-1可水平轉(zhuǎn)移的特性，使耐藥菌廣泛快速傳播，黏菌素耐藥率升高。另外，研究表明mcr-1基因可以與其他耐藥基因共存。這一現(xiàn)象，進(jìn)一步加劇了細(xì)菌耐藥性對(duì)人類健康的威脅。隨著研究的深入，mcr-1的亞型mcr-2—mcr-9相繼被發(fā)現(xiàn)。Xavier等人發(fā)現(xiàn)了多黏菌素耐藥基因mcr-2，開放閱讀框?yàn)? 617 bp，與mcr-1的同源性為76.75%[14-15];Yin等人報(bào)道了mcr-3，開放閱讀框?yàn)?62 bp，其與mcr-1和mcr-2分別有45.0%和47.0%的核酸一致性[16];Carattoli A等人在意大利屠宰場(chǎng)的一頭豬中分離到的鼠傷寒沙門氏菌的單相變體并從中發(fā)現(xiàn)了mcr-4基因，其與mcr-1、mcr-2和mcr-3分別具有34.0%、35.0%和49.0%的氨基酸序列同一性[17];Maria Borowiak等人在副傷寒沙門氏菌分離物中鑒定到了新的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶基因，并將其命名為mcr-5，其開放閱讀框?yàn)? 644 bp[18]。

2 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的流行情況

2.1 blaNDM-1基因的流行情況 近年來，大多數(shù)國家和地區(qū)相繼報(bào)道了blaNDM-1基因。blaNDM-1耐藥性在全球范圍內(nèi)呈散發(fā)的趨勢(shì)，而且病例之間沒有流行病學(xué)聯(lián)系。2008－2009年在英國、印度、巴基斯坦和孟加拉國進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)180余例blaNDM-1基因陽性菌，以肺炎克雷伯菌和大腸桿菌為主。2010年2月至2010年7月，印度一家醫(yī)院的blaNDM-1流行率為6.9%[19-20]，在巴基斯坦一家醫(yī)院中，有18.5%的住院病人和門診患者的腸道菌群中攜帶blaNDM-1細(xì)菌[21]。另外，在醫(yī)院的醫(yī)療環(huán)境及外環(huán)境(污水、自來水)中也發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-1的革蘭氏陰性菌[22]。全球范圍內(nèi)，除了存在于肺炎克雷伯菌和大腸桿菌外，blaNDM-1還存在于不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌等大部分革蘭氏陰性菌中。目前，除了非洲中部、南美洲西部個(gè)別國家沒有報(bào)道，其他國家和地區(qū)均呈blaNDM-1耐藥基因全球流行蔓延的趨勢(shì)[23]。

我國blaNDM-1陽性病例存在明顯的地區(qū)、年齡及性別差異。截至2015年已經(jīng)有25個(gè)省市(含港澳臺(tái)地區(qū))報(bào)道了blaNDM-1陽性菌株。其中，東南部沿海地區(qū)blaNDM-1陽性病例分布較多，廣東地區(qū)報(bào)道的陽性病例為109例，占39.49%，明顯多于其他地區(qū)[24]。研究表明，blaNDM-1陽性菌的感染者中，男性明顯多于女性，年齡分布主要集中在10歲以下和60～80歲之間。這表明，基礎(chǔ)體質(zhì)和免疫力較差的人群屬于產(chǎn)blaNDM-1細(xì)菌感染的易感人群。此外，blaNDM-1基因還存在于伴生動(dòng)物中，尤其是候鳥。候鳥的遷徙使blaNDM-1基因的水平轉(zhuǎn)移成為可能，進(jìn)一步促進(jìn)了blaNDM-1的全球蔓延。

2.2 mcr-1基因的流行情況 多黏菌素長(zhǎng)期用于畜牧業(yè)中，主要是多黏菌素B和多黏菌素E，各個(gè)國家一直將其用于禽畜的飼料添加劑以及疾病的預(yù)防和治療。在全球范圍內(nèi)生產(chǎn)多黏菌素E的國家中，亞洲的國家占73%。多黏菌素在畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，促進(jìn)了mcr-1耐藥基因的傳播。從2015年中國報(bào)道m(xù)cr-1基因后，美國、英國、加拿大、泰國、丹麥等35個(gè)國家也相繼發(fā)現(xiàn)了mcr-1基因。2000－2004年，在日本的健康動(dòng)物中，mcr-1陽性的大腸埃希菌占0.4%[25];2009-2015年，法國、德國和越南分別在豬中檢出攜帶mcr-1的大腸埃希菌，陽性率分別為0.5%[26]、2.3%[27]和37.5%[28];2014年，在埃及的奶牛中，攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌的陽性率為2.6%[29];2016年，在中國廣東的貓和犬中，攜帶mcr-1的大腸埃希菌的陽性率分別為14.3%、10.3%[30]。中國上海的一項(xiàng)2006-2016年回顧性研究中，在12 053株沙門氏菌中，有37株是mcr-1陽性，而且2015年后，陽性率呈上升趨勢(shì)[31]?？傮w來看，部分國家動(dòng)物源菌株中的mcr-1攜帶率比較低(＜5%)，而中國、越南等國家的mcr-1基因的陽性率較高。

除了在豬、雞、犬等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有mcr-1基因外，在動(dòng)物性食物、水、蔬菜、醫(yī)院廢水、患者的痰液、血液、尿液以及傷口分泌物中也檢出mcr-1基因。一項(xiàng)研究表明，2011－2014年間，在中國的523份生肉標(biāo)本中，mcr-1陽性率為15%，在804份動(dòng)物體內(nèi)檢出mcr-1陽性率為21%，在1 322份感染患者體內(nèi)，mcr-1陽性率為1%[13]。

3 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的耐藥機(jī)制

3.1 blaNDM-1基因的耐藥機(jī)制 blaNDM-1基因是一種新發(fā)現(xiàn)的B類金屬β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)該基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1基因與 VI M 基因較為相似[32]。blaNDM-1基因?qū)Τ颂婕迎h(huán)素和多黏菌素以外的多種抗生素均耐藥，尤其是碳青霉烯類抗生素。blaNDM-1的活性部位為金屬離子，即鋅離子，必須依賴鋅離子的存在才能發(fā)揮催化活性，鋅離子對(duì)亞胺培南、厄他培南等常見碳青霉烯類抗生素有很強(qiáng)的水解活性，對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。blaNDM-1基因位于一個(gè)耐藥基因元件中，包含Ⅰ類整合子，其上游是基因組DNA，下游還有插入序列IS26和Tn3轉(zhuǎn)座基因。整合子、轉(zhuǎn)座子和插入序列是基因轉(zhuǎn)移的基本元件[33]，因此，耐藥基因blaNDM-1可以通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到敏感菌上，使之成為耐藥菌，從而實(shí)現(xiàn)了blaNDM-1基因的跨種屬傳播。

3.2 mcr-1基因的耐藥機(jī)制 mcr-1位于多種類型的可接合質(zhì)粒上，可以在不同質(zhì)粒與不同菌屬間傳播。mcr-1基因主要位于lnc X4和Inc Hl2型質(zhì)粒上[34]，Inc Hl2、Incl2和l nc P是mcr-1基因的主要質(zhì)粒[35]。此外，該基因可以與其他耐藥基因同時(shí)存在，這會(huì)加速mcr-1的轉(zhuǎn)移和耐藥性的傳播。Liu等人發(fā)現(xiàn)mcr-1能夠降低黏菌素的藥效[13]，對(duì)黏菌素產(chǎn)生耐藥性。mcr-1是磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族的成員，mcr-1蛋白通過5個(gè)跨膜螺旋(TMHS)錨定在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜的周質(zhì)中;細(xì)菌的脂多糖在胞漿中被合成后，通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MSBA翻轉(zhuǎn)到內(nèi)膜的外表面，然后進(jìn)入周質(zhì)中。由于mcr-1具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的活性，脂多糖中的脂質(zhì)A在周質(zhì)中被磷酸乙醇胺共價(jià)修飾，二元調(diào)控系統(tǒng)(TCSs)被激活，使脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞外膜與多黏菌素的親和性下降，從而導(dǎo)致對(duì)多黏菌素耐藥性的產(chǎn)生。在mcr-1基因中，69%的基因結(jié)構(gòu)中存在插入序列ISApl1，ISApll是一個(gè)高度活躍的元素，它的運(yùn)動(dòng)可能對(duì)宿主細(xì)胞有害[36]。這個(gè)可移動(dòng)元件的整合會(huì)使mcr-1基因容易被其他質(zhì)粒捕獲，從而實(shí)現(xiàn)mcr-1基因在不同菌種、不同地區(qū)之間傳播。研究表明，mcr-1陽性菌株不僅可以水平傳播，也存在克隆傳播，具有遺傳多樣性[37]。

4 耐藥基因bla NDM-1和mcr-1的檢測(cè)方法

4.1 blaNDM-1基因的檢測(cè)方法 由于產(chǎn)blaNDM-1細(xì)菌感染的臨床表現(xiàn)與敏感菌感染沒有差異，臨床診斷比較困難[38]，因此，blaNDM-1基因的檢測(cè)常常依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。產(chǎn)blaNDM-1細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室診斷包括篩查、表型確認(rèn)以及分子確證實(shí)驗(yàn)3個(gè)步驟。

4.1.1 表型篩查試驗(yàn) 在細(xì)菌藥物敏感性測(cè)定中，以美洛培南或亞胺培南紙片法(K-B法)或者最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定法對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步篩查，如果達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)懷疑細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶，需要進(jìn)行表型確認(rèn)。厄他培南特異性較低，不推薦用于篩查試驗(yàn)。

4.1.1.1 K-B法 美洛培南(10μg紙片)抑菌圈直徑≤23 mm或亞胺培南(10μg紙片)抑菌圈直徑≤21 mm時(shí)，需要進(jìn)行表型確認(rèn)。

4.1.1.2 最低抑菌濃度(MIC) 測(cè)定美洛培南MIC≥0.5 mg/L時(shí)，需要進(jìn)行表型確認(rèn);對(duì)大腸埃細(xì)菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬和腸桿菌屬，亞胺培南MIC≥2 mg/L時(shí)，可進(jìn)行表型確認(rèn)試驗(yàn)。

4.1.2 表型確認(rèn)試驗(yàn) 采用亞胺培南＋EDTA復(fù)合紙片或者E紙條，進(jìn)行KB法藥敏試驗(yàn)或者M(jìn)IC測(cè)定，如果復(fù)合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值≥5 mm，或單藥與復(fù)合制劑的MIC比值≥8時(shí)，判定產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，需用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行酶型確認(rèn)。

4.1.3 酶型分子確認(rèn)試驗(yàn) 采用blaNDM-1的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確認(rèn)菌株是否攜帶blaNDM-1基因。

4.2 mcr-1基因的檢測(cè)方法 mcr-1基因的檢測(cè)方法有藥敏紙片擴(kuò)散法(disk diff usion)、濃度梯度法(E-test)和自動(dòng)化系統(tǒng)(auto mated systems)以及多黏菌素NP快速測(cè)試法(Rapid Polymyxin NP test)。研究表明，多粘菌素NP快速測(cè)試法對(duì)mcr-1基因的檢測(cè)效率更高，效果更好[39]。另外，Nor dmann P等人探測(cè)細(xì)菌細(xì)胞在多黏菌素存在時(shí)的葡萄糖代謝，來觀察其生長(zhǎng)情況，進(jìn)而鑒定其耐藥性[40]。Chabou S等人用Taq Man (R)探針進(jìn)行快速實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，其特異性和靈敏度可達(dá)到100%[41]。

近年來，細(xì)菌耐藥問題已經(jīng)向多重耐藥和廣譜耐藥方向發(fā)展，耐藥問題已成為人類重要的公共衛(wèi)生問題，對(duì)人類、家畜家禽、環(huán)境等造成巨大的威脅。blaNDM-1基因和mcr-1基因的出現(xiàn)，尤其是其可水平轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，更新了人們的觀念，引起了全球的關(guān)注。目前，耐藥基因blaNDM-1和mcr-1還未形成嚴(yán)重的流行。因此，只要人們及時(shí)采取措施，合理有效的使用抗生素，就能嚴(yán)格控制耐藥基因的傳播，扭轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥問題的嚴(yán)重形勢(shì)。