Wnt信號通路在周圍神經(jīng)損傷后骨質(zhì)疏松中的研究進展

王琰，王艷

1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

周圍神經(jīng)損傷后的骨質(zhì)疏松與骨丟失增多和骨質(zhì)重塑有關，缺乏由骨細胞機械感受功能介導的機械載荷似乎是與骨丟失有關的病因。長期臥床休息或失重環(huán)境導致的機械負荷減少會導致嚴重的骨質(zhì)流失[1]；而過度使用骨質(zhì)會損害組織，進而激活骨質(zhì)重塑，實現(xiàn)自我修復，因此缺失機械負荷會對骨骼重塑產(chǎn)生深遠的影響[2]。骨和骨膜被感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)纖維支配[3]，提示周圍神經(jīng)系統(tǒng)也可能參與骨代謝[4-5]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)影響感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)元的生長和分化，而感覺神經(jīng)與交感神經(jīng)分別通過神經(jīng)肽物質(zhì)P(substance P,SP)和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)影響骨代謝[6-7]，并在調(diào)節(jié)骨骼重塑中起著重要作用[8]。無論是機械載荷、NGF、感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)對骨的合成代謝作用都與Wnt信號通路密切相關[9]。了解Wnt 信號通路與機械載荷和周圍神經(jīng)之間的作用機制，對周圍神經(jīng)損傷后骨質(zhì)疏松的防治具有十分重要的意義。

1 Wnt信號

1.1 Wnt信號發(fā)展歷程

Wnt 信號傳導領域的發(fā)展歷程十分艱難[10-11]，來自不同學科的研究人員為解決Wnt 信號傳導的分子奧秘做出了重要貢獻。Nusse 等[11]在對小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)可能導致乳腺癌的機制研究時，用探針篩選其他腫瘤是否在同一個結(jié)構(gòu)中整合，發(fā)現(xiàn)其中的探針9 特別有用，它在許多個腫瘤中獲得整合，并且大致映射到整合集群的中間，他們稱之為int1(表示第一個常見的整合部位)。

然而確定int1 基因及其編碼蛋白的作用機制并不容易[10]，直到Rijsewijk 等[12]發(fā)現(xiàn)果蠅中的Wingless 基因是int1 的同源物，才從發(fā)育遺傳學角度揭示int1的功能。1990年左右，int命名法已經(jīng)變得不充分且令人困惑，如從腫瘤中MMTV 原病毒插入位點的其他篩選產(chǎn)生了其他活化基因，稱為int2、int3 和int4[13-15]。但通過序列比較，這些基因與int1 無關。為避免混淆，Nusse等[16]同意使用一個新的混合名稱‘Wnt’來表示屬于int1/Wingless系列的基因。

1.2 Wnt信號與疾病

隨著對Wnt 蛋白質(zhì)的多種生理作用所獲得的洞察力越多，就越能開始識別和掌握異常信號及其參與許多人類疾病的發(fā)病機制，從癌癥到代謝紊亂和發(fā)育缺陷[17-18]。了解Wnt 信號在骨骼疾病中的作用，不僅有助于闡明這些疾病的發(fā)病機制，更有助于探索出更具有針對性且有根據(jù)性的新治療途徑。

1.3 Wnt信號傳導的經(jīng)典途徑

Wnt信號的傳導途徑可分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑通過β連環(huán)蛋白(β-catenin)介導信號傳導，而非經(jīng)典途徑獨立于β-catenin 起作用[19]，其中經(jīng)典途徑在骨骼疾病中得到更好的表征。

經(jīng)典的Wnt 信號傳導的標志是活化后細胞質(zhì)中的β-catenin的穩(wěn)定性。當存在經(jīng)典的Wnt 配體(Wnt1、Wnt3a 和Wnt8)時，配體與Frizzled(Fz)家族和低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)5 或LRP6 結(jié)合，引起細胞內(nèi)的散亂蛋白(dishevelled,Dvl)磷酸化，磷酸化的Dvl抑制糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)，使GSK3β活性下降，抑制其磷酸化細胞質(zhì)中的β-catenin，結(jié)果使β-catenin 更穩(wěn)定并易位到細胞核中，與T 細胞因子(T cell factor,Tcf)/淋巴增強劑結(jié)合因子形成轉(zhuǎn)錄復合物，調(diào)節(jié)目的基因的表達[20-21]。若沒有Wnt 配體，細胞質(zhì)中的β-catenin 被蛋白質(zhì)降解復合物，如GSK3β、軸蛋白(Axin)與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyosis coli,APC)等磷酸化，使β-catenin降解[20]。

2 Wnt信號通路與骨

2.1 Wnt信號通路與骨合成代謝

近年來Wnt 信號通路在骨生物學中的作用受到更多的關注。如骨質(zhì)疏松假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征、硬化癥和范布赫姆病等病的骨病理學都與異常的Wnt信號傳導有關，這些都引發(fā)骨生物學中Wnt 信號通路的進一步研究[22-23]。骨質(zhì)疏松假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征與LRP5 基因的新突變有關，患者表現(xiàn)為因骨小梁顯著減少而導致多處骨折。通過LRP5 介導的Wnt 介導的信號傳導會影響生長過程中的骨累積，對峰值骨量的建立很重要[24]。硬化癥和范布赫姆病臨床表現(xiàn)為高骨量，是由于編碼硬化蛋白(sclerostin,SOST)的基因突變導致，SOST 是一種Wnt/βcatenin 信號傳導拮抗劑[25]。因此Wnt信號途徑的突變會導致人的骨密度發(fā)生嚴重變化。

骨量取決于骨骼重塑的過程，涉及成骨細胞、骨細胞和破骨細胞的活動，這三種細胞類型通過控制骨骼重塑，維持骨量平衡[26-27]。成骨細胞和骨細胞來源于間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[28]，破骨細胞來源于造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)[29]。一般而言，成骨細胞形成骨骼，破骨細胞吸收骨骼，骨細胞維持骨骼的穩(wěn)態(tài)，并在骨骼重塑中調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞，以適應生物力學的需要。

Glass 等[30]研究表明，β-catenin(可能是Wnt 信號)可促進成骨細胞分化并抑制破骨細胞分化。Wnt 信號通路抑制MSCs 向軟骨和成脂譜系的分化，增強了對成骨細胞譜系的分化[31-32]。成骨細胞和骨細胞的Wnt/β-catenin 信號通過骨保護蛋白(osteoprotegerin,OPG)的分泌而間接抑制破骨細胞的分化和骨吸收[30]。Wnt 信號通路直接或間接地對成骨細胞、骨細胞和破骨細胞進行調(diào)控，因此在控制骨量方面具有重要作用。

2.2 Wnt信號通過機械負荷影響骨

骨骼是一種不斷重塑的動態(tài)器官[33]，其結(jié)構(gòu)因其機械環(huán)境而不斷變化[34]，包括軸向負荷和全身震動在內(nèi)的許多負荷方式都會影響骨骼的重塑過程[35-36]。骨細胞通過細胞過程相互連接，在骨表面與成骨細胞相連接，形成小管網(wǎng)絡，成為響應機械負荷的骨重塑關鍵調(diào)節(jié)劑[37]。骨細胞感知機械負荷并將其轉(zhuǎn)換為生化信號。機械負荷激活了Wnt信號通路，通過Wnt信號抑制劑SOST、Dickkopf-1(DKK1)等的分泌，調(diào)節(jié)位于骨表面的成骨細胞分化[38-39]。

2.2.1SOST

SOST是SOST基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它是一種有效的骨形成抑制劑，主要由骨細胞合成[40]。該信號是骨骼機械轉(zhuǎn)導的關鍵介質(zhì)，通過調(diào)節(jié)其輸出以調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導[39]，為骨細胞控制機械轉(zhuǎn)導提供了潛在的機制。

Sawakami 等[41]發(fā)現(xiàn)，攜帶LRP5 功能突變的小鼠重現(xiàn)了在LRP5 失活突變的人類中觀察到的低骨量表型；它們幾乎無法對機械刺激進行合成代謝反應。提示W(wǎng)nt/LRP5 信號傳導是正常骨組織中機械轉(zhuǎn)導級聯(lián)的組成部分，機械負荷需要LRP5 的參與才能對骨量產(chǎn)生影響。SOST 與LRP5/6 Wnt 共受體結(jié)合，從而抑制Wnt/β-catenin 信號傳導[42]，SOST 一直被認為是骨骼中的“機械傳感器”[43]。因此，SOST 成為了機械負荷誘導Wnt/LRP5信號的候選人。

Robling 等[44]發(fā)現(xiàn)，尺骨負荷顯著降低SOST轉(zhuǎn)錄和SOST水平，后肢卸載顯著增加SOST 表達。提示W(wǎng)nt 信號抑制劑SOST 受機械負荷的調(diào)節(jié)。此外長期的SOST 缺失會抑制由機械負荷的減少而引起的骨質(zhì)疏松[45]。再次證明在骨骼機械轉(zhuǎn)導級聯(lián)中Wnt 信號是關鍵的一步。但是機械負荷影響SOST 表達的作用機制目前尚不明確，一種假設是由于SOST 在局部成骨細胞不受控制地形成骨的時候，為了調(diào)節(jié)骨量在可控范圍內(nèi)，會由骨細胞大量的生成和分泌[44]。骨細胞感受到局部應力，SOST 水平降低，增強Wnt 信號的表達，使局部的成骨細胞形成骨，最終導致高應變區(qū)新骨生成。Robling 等[44]也發(fā)現(xiàn)，DKK1表達下調(diào)，DKK1對LRP5/6同樣具有高親和力，也主要由骨細胞合成[38]。因此DKK1 也可以解釋機械轉(zhuǎn)導過程中Wnt信號的增強。

2.2.2DKK1

DKK1 是Wnt 信號通路細胞外另一種拮抗劑，它主要由骨細胞合成[44]。DKK1 與Kremen 和LRP5/6 在質(zhì)膜上形成三元復合物，從而防止LRP5/6與Wnt配體結(jié)合[46]。

DKK1 在成骨細胞內(nèi)的過度表達會導致小鼠骨質(zhì)減少[47]，而DKK1的雜合子或純合子缺失導致骨量依賴性增加，這可能是由于骨形成增加并且骨吸收沒有改變[48-49]。在骨骼機械轉(zhuǎn)導中，像SOST 一樣，DKK1 也有作用。特別是在嚙齒動物模型中，當機械負荷增加后，SOST和DKK1的表達均被抑制[50-51]。

Morse 等[52]發(fā)現(xiàn)，DKK1基因敲除小鼠對脛骨負荷的反應增加了脛骨的骨量。因此，DKK1 基因敲除動物對機械負荷敏感性增強。有報道假設SOST 和DKK1 在缺乏的情況下可以在骨髓腔內(nèi)互相補償[45]。Van Lierop 等[53]發(fā)現(xiàn)，SOST 缺乏癥患者的血清DKK1 水平升高。但是在DKK1基因敲除小鼠和野生型小鼠中，SOST表達隨載荷增加而下降[52]。這可能是因為SOST本身對負荷更敏感，并在負荷增加的條件下被下調(diào)[44,50]。盡管DKK1 與SOST 都屬于Wnt 拮抗劑，并具有相似的功能，但DKK1在調(diào)節(jié)骨量方面的作用可能不如SOST重要。

2.3 Wnt信號通過周圍神經(jīng)作用于骨

2.3.1NGF

NGF是一系列神經(jīng)營養(yǎng)因子中的第一個，它影響交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元的生長和分化。成年骨骼中的絕大多數(shù)(80%)無髓鞘/薄髓鞘的感覺神經(jīng)纖維神經(jīng)表達NGF 高親和力受體，即神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptors A,TrkA)[54-55]。

Tomlinson 等[56]指出，NGF 信號通過TrkA 指導發(fā)育中小鼠股骨的神經(jīng)支配，以促進血管形成和骨祖細胞的進程，建立了NGF-TrkA 信號與骨代謝的聯(lián)系。他們研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)是骨細胞中受機械載荷誘導的Wnt/β-catenin 信號受NGF-TrkA信號傳導調(diào)節(jié)。在骨膜和尺骨內(nèi)膜上的成骨細胞中，NGF急劇上調(diào)，表明此區(qū)域的感覺神經(jīng)通過NGF-TrkA 信號對機械刺激作出了反應。但是骨細胞中不表達NGF，而是表達強大的βcatenin報告基因活性，而成骨細胞中β-catenin缺失不會影響負荷誘導的NGF 表達。這表明成骨細胞和骨細胞可能通過獨特的盡管可能重疊的機制對體內(nèi)骨骼負荷作出反應。Wnt配體在神經(jīng)軸突中被隔離，所以在感覺神經(jīng)中的NGF-TrkA 不可能直接刺激骨細胞中Wnt/β-catenin信號表達，而是通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶進而抑制GSK3β 來促進β-catenin 在軸突尖端定位[57]。此外，NGF-TrkA 信號是使NGF 信號從軸突末端傳遞到交感神經(jīng)元胞體的信使[58]，并對感覺神經(jīng)分泌的SP 的釋放也具有促進作用[59]。

2.3.2SP

SP 是骨骼感覺神經(jīng)元分泌的11 個氨基酸的神經(jīng)肽[60]，也是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，對骨組織形成具有重要的調(diào)節(jié)作用[61]。Wang等[62]發(fā)現(xiàn)，跑步機與電針相結(jié)合可以預防坐骨神經(jīng)損傷后脛骨骨丟失的潛在機制，可能與SP 的表達增加相關。Fu 等[63-64]發(fā)現(xiàn)，SP 可以調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨細胞分化、增殖和凋亡，促進骨折愈合。

關于SP 刺激BMSCs 增殖的機制目前研究較少。一種可能的機制是SP 可以通過激活Wnt 途徑的基因和蛋白質(zhì)表達，以及通過移位β-catenin 來增強BMSCs 的分化，并且增強BMSCs的遷移能力，對血管內(nèi)皮生長因子表達也有促進作用[64]。因此，SP 可能通過Wnt 途徑誘導成骨細胞分化，并促進BMSCs的血管生成能力。但是SP 是否通過Wnt 信號介導血管生成還需要進一步探討。

2.3.3NPY

NPY 是高度保守的36 個氨基酸的神經(jīng)肽，在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達[65-66]，目前已知在促進多種細胞和組織的增殖、血管生成和遷移中具有重要的信號傳導功能。然而，關于NPY對BMSCs增殖和凋亡的特定作用卻少為人知[6]。

Liu 等[67]指出，NPY 刺激BMSCs 的成骨細胞分化和遷移。Wu 等[68]發(fā)現(xiàn)，NPY 以濃度依賴的方式顯著促進BMSCs 的增殖，在增殖和凋亡過程中，NPY還增加了經(jīng)典的Wnt信號通路蛋白(包括β-catenin)的mRNA 和蛋白表達水平，激活Wnt 信號通路傳導，從而刺激BMSCs的成骨細胞分化。Dong等[69]發(fā)現(xiàn)，褪黑激素治療上調(diào)NPY 和NPY 受體Y1(NPY1R)的表達，并促進MSC的增殖和遷移。提示褪黑激素通過NPY/NPY1R信號傳導促進MSCs的成骨細胞分化和骨折愈合。

NPY是否促進BMSCs的增殖，研究之間還存在分歧。Lee等[70]發(fā)現(xiàn)，NPY 系統(tǒng)通過Y1 受體直接抑制間充質(zhì)祖細胞的分化以及成熟成骨細胞的活性，構(gòu)成Y1 受體缺失小鼠中明顯存在的高骨量表型的可能機制。

因此NPY 在BMSCs 增殖和凋亡中的具體作用，可能對于維持體內(nèi)適當數(shù)量的BMSCs 至關重要，并且通過β-catenin 信號的傳導，對成骨細胞也起著重要的作用[68]。但是目前尚未得到充分的論證，需要進一步闡明。

3 小結(jié)

目前已有的研究證實Wnt信號通路可以通過機械負荷和周圍神經(jīng)兩方面調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)損傷后骨的合成與代謝。機械負荷主要是由Wnt 信號抑制劑SOST、DKK1 等調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導，進而影響骨骼重塑的過程。周圍神經(jīng)主要是通過感覺神經(jīng)分泌的SP 和交感神經(jīng)分泌的NPY，以及影響感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)元生長和分化的NGF，對骨組織的形成具有重要作用，三者都與Wnt信號通路密切相關。因此可以從“力學”和“神經(jīng)學”兩方面入手進行干預和防治。

盡管已經(jīng)明確了經(jīng)典Wnt途徑對骨骼合成代謝的關鍵性作用，但是非經(jīng)典Wnt途徑還需進一步闡明，影響Wnt信號途徑的其他因子以及與其他信號的串擾方面仍有待發(fā)現(xiàn)。