Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1-核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件抗氧化應(yīng)激通路在多發(fā)性硬化中作用的研究進(jìn)展

蘇玲玲，鄭碧娥，何進(jìn)娣，范建中，尹瑞雪

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東廣州市 510515

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)并與自身免疫炎癥相關(guān)的中樞脫髓鞘疾病[1]，已成為青壯年非創(chuàng)傷性殘疾最常見的原因[2]，美國約有4000 萬，全世界約有1.4 億青壯年因MS 致殘[3]。MS 病理機(jī)制主要是T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[4-5]。炎性攻擊中，巨噬細(xì)胞和激活的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過多炎癥介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)[6]，導(dǎo)致腦白質(zhì)、腦皮質(zhì)和深灰質(zhì)脫髓鞘、炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)增生。

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)-核因子E2 相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element,ARE)信號通路作為機(jī)體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激通路，可調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物，以抵抗氧化應(yīng)激引起的大腦脫髓鞘損害。目前，激活該通路以減輕MS疾病進(jìn)展成為研究熱點。

1 MS臨床表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制

MS 的病理學(xué)特點主要包括炎性反應(yīng)、髓鞘脫失、膠質(zhì)增生；臨床表現(xiàn)具有空間多灶性和時間多發(fā)性[7]，主要表現(xiàn)為行走無力、肢體深淺感覺異常、視覺障礙、反射和自主神經(jīng)障礙、認(rèn)知障礙[8]，每次發(fā)病后產(chǎn)生的功能障礙最終導(dǎo)致非創(chuàng)傷性殘疾。MS 包括4 個臨床分型：原發(fā)進(jìn)展型、復(fù)發(fā)緩解型、繼發(fā)進(jìn)展型和進(jìn)展復(fù)發(fā)型[7]，以復(fù)發(fā)緩解型最常見，約占85%[9]。

MS的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為，MS急性期，自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞透過血腦屏障進(jìn)入CNS，攻擊髓鞘，從而導(dǎo)致脫髓鞘病變；此外，巨噬細(xì)胞在大腦遷移以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活躍，釋放多種酶催化活性自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體損傷[10-11]，使線粒體氧化磷酸化功能失調(diào)，ROS/RNS 水平上升，導(dǎo)致神經(jīng)變性，并破壞少突膠質(zhì)細(xì)胞造成脫髓鞘改變。

神經(jīng)變性是MS 發(fā)生神經(jīng)功能障礙不可逆的重要病理特征，而氧化應(yīng)激是介導(dǎo)神經(jīng)變性的一個重要原因，也是目前MS 發(fā)病機(jī)制研究的焦點之一[11]。氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能障礙可促進(jìn)神經(jīng)退行性病(如MS、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥和肌萎縮側(cè)索硬化等)的進(jìn)展[12-14]。當(dāng)血清中存在過量ROS 和RNS 時，氧化還原系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致神經(jīng)變性、脫髓鞘改變、血腦屏障完整性破壞和軸索破壞[4]，已有研究證實ROS 在MS 發(fā)病中發(fā)揮重要作用[15]。MS 患者氧化應(yīng)激所引起的神經(jīng)變性也得到多個研究證實[10,16]。

當(dāng)氧化還原系統(tǒng)失衡時，機(jī)體為維持氧化還原平衡，會激活抗氧化應(yīng)激通路以清除過多的氧自由基[12]，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的損傷。人體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)相互約束，探討如何有效提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，可為MS 的藥物及非藥物治療提供新的方向。

2 Keap1-Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路及其在MS發(fā)病中的作用

近些年研究發(fā)現(xiàn)[17]，Keap1-Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激最重要的途徑，可調(diào)節(jié)炎癥調(diào)節(jié)因子和酶類，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗細(xì)胞損傷的作用。已有綜述探討該通路與其他炎癥性疾病的相關(guān)性[18]。

2.1 分子基礎(chǔ)

Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化應(yīng)激通路的核心分子主要包括Keap1、Nrf2 和ARE。其中，Keap1 是分子量為69 kDa 的胞漿蛋白，它是Nrf2在胞質(zhì)中的結(jié)合蛋白[19]，也是體內(nèi)重要的Nrf2負(fù)向調(diào)控因子，Keap1 的結(jié)構(gòu)變化影響Nrf2 的活性[20-21]。Nrf2 的分子量為66 kDa，是cap'n'collar(CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族成員中最有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[22]。

生理狀態(tài)下，Keap1 與Nrf2 結(jié)合形成復(fù)合物，以Keap1-Nrf2 結(jié)合體固定在胞漿內(nèi)肌動蛋白細(xì)胞骨架上。Nrf2 穩(wěn)定結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活性受抑制[21]。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS或親電子物質(zhì)[23]引起Keap1 結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致Nrf2 與Keap1 解離，E3泛素連接酶復(fù)合體(Keap1-Cul3-Rbx1 E3 ubiquitin ligase complex)停止降解Nrf2[24]，使Nrf2 激活，從胞質(zhì)釋放，進(jìn)入細(xì)胞核。多種蛋白激酶活化也可通過改變Nrf2 結(jié)構(gòu)[25]，促進(jìn)其與Keap1 分離，激活Nrf2 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)；Nrf2 阻滯劑Bach1[19]可使其從胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。Nrf2與小分子Maf蛋白結(jié)合成異二聚體[26]，再結(jié)合特異性DNA-啟動子結(jié)合序列ARE，完成Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化途徑激活，促進(jìn)Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的產(chǎn)生。

2.2 在CNS中的作用

Nrf2 介導(dǎo)的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路與多種神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦出血等疾病相關(guān)。Karkkaine等[27]在阿爾茨海默病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Nrf2 可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化，減輕β-淀粉樣蛋白對神經(jīng)前體細(xì)胞的毒性作用。在帕金森病患者尸體解剖研究中[28]，Nrf2 介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激通路下游的NAD(P)H:醌氧化還原酶1〔NAD(P)H:quinone oxidoreductase,NQO1〕明顯增多，清除多余氧自由基。三硝基丙酸建立的亨廷頓病動物模型中[29]，原人參三醇進(jìn)行干預(yù)，可觀察到小鼠紋狀體中Nrf2及其下游血紅素加氧酶1(heme oxygenase,HO-1)和NQO1 表達(dá)均明顯升高，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。敲除谷胱甘肽過氧化酶-1 的大腦中動脈栓塞模型小鼠，可誘導(dǎo)Keap1-Nrf2/ARE通路表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[30]。Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激通路不僅作用于神經(jīng)系統(tǒng)，還與腫瘤、肺損傷、癌癥、動脈粥樣硬化等多種疾病相關(guān)[31]。

2.3 Keap1-Nrf2/ARE通路與MS

激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，能促進(jìn)過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、NQO1 和HO-1 等解毒酶和抗氧化蛋白的表達(dá)[24,32]。多種解毒酶和抗氧化蛋白能清除自由基和被氧化的蛋白質(zhì)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕自由基和親電子物質(zhì)引起的細(xì)胞損傷，對氧化應(yīng)激損傷有防護(hù)作用。

HO-1 和NQO1 是Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化應(yīng)激途徑中研究較多的Ⅱ相解毒酶，在MS中進(jìn)行了許多研究。NQO1在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)多見。Jack 等[33]觀察到，在MS 患者急性脫髓鞘病變部位，星形膠質(zhì)細(xì)胞NQO1酶表達(dá)水平較無神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者明顯增高，提示該通路在MS發(fā)病過程發(fā)揮保護(hù)作用。HO-1是Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化應(yīng)激途徑抗炎和細(xì)胞保護(hù)的主要調(diào)節(jié)因子[34]。Licht-Mayer 等[35]在MS 患者白質(zhì)病損部位觀察到Nrf2蛋白表達(dá)及其下游HO-1 的表達(dá)均增加，提示Nrf2 介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激途徑在MS 中起重要保護(hù)作用，在抑制疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用。

3 Keap1-Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路影響因素

由于大腦的氧耗量占整個機(jī)體的20%，CNS尤其易受氧化應(yīng)激損傷，這不僅與ROS 清除能力較低有關(guān)，還與大腦中鐵離子、不飽和脂肪酸過多和較低的抗氧化應(yīng)激能力相關(guān)[36]。Johnson 等[37]比較Nrf2 基因缺失和未缺失的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠模型(MS 經(jīng)典動物模型[38])，發(fā)現(xiàn)Nrf2 基因缺失EAE 模型大鼠臨床癥狀更明顯，發(fā)病速度更快；Nrf2 基因缺失組脊髓T 淋巴細(xì)胞浸潤、炎癥酶、細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)均明顯增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活更明顯，提示Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激通路在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)作用。

探討激活Keap1-Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路以減緩MS病情進(jìn)展，也逐漸成為研究熱點。富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是首個以改善Keap1-Nrf2/ARE 為靶點的藥物，主要抑制核因子κB 活性，促進(jìn)活化T 淋巴細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4 和白細(xì)胞介素-5 的釋放。它通過改變Keap1 結(jié)構(gòu)，使Nrf2解離進(jìn)入胞核內(nèi)，促進(jìn)抗氧化酶和抗氧化蛋白表達(dá)，其口服制劑BG-12于2013年3月被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于MS 疾病修正治療[39]。DMF 或富馬酸單甲酯(monomethyl fumarate,MMF)在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)，而這一現(xiàn)象在Nrf2 基因敲除小鼠中消失[40]，肯定該通路在MS 治療中發(fā)揮不可或缺的作用。

許多康復(fù)措施可激活該通路。Tutakhail 等[41]發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度平板訓(xùn)練均可促進(jìn)小鼠Nrf2、HO-1 在大腦不同部位表達(dá)，并減輕炎癥引起的痛覺過敏。Babayi Daylari 等[42]證明，星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)，ROS在超聲波(頻率500～600 Hz，強(qiáng)度100 dB)刺激下顯著下降；在超聲波(頻率528 Hz，強(qiáng)度100 dB)干預(yù)下，小鼠大腦中氧化應(yīng)激產(chǎn)物較其他強(qiáng)度組明顯下降，推測超聲波可通過抗氧化應(yīng)激，起到神經(jīng)保護(hù)作用。杜韜等[43]對急性腦梗死患者針刺眼區(qū)八穴2周，發(fā)現(xiàn)外周血Nrf2、ARE和NQO1高表達(dá)，并能有效降低神經(jīng)功能缺損評分。

4 展望

CNS因其獨有的特點極易受到氧化應(yīng)激損傷，大腦無法及時清除自由基，促進(jìn)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展。Keap1-Nrf2/ARE信號通路作為機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，介導(dǎo)下游保護(hù)性基因表達(dá)，清除氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡，從而在各個領(lǐng)域內(nèi)具有抗損傷、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗凋亡作用。

提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，從而延緩MS 發(fā)病進(jìn)展已成為研究熱點。在EAE 模型中，DMF 通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)，激活Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[39]。除DMF外，其他Nrf2 激活劑，如姜黃素[44]、萊菔硫烷[45]、特丁基對苯二酚[46]等，均可通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)，激活神經(jīng)保護(hù)作用。對EAE小鼠進(jìn)行力量和耐力訓(xùn)練，其神經(jīng)功能缺損評分、氧化應(yīng)激產(chǎn)物明顯下降，Nrf2顯著升高，可能延緩MS進(jìn)展[47]。

Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控十分精細(xì)和復(fù)雜，多種Nrf2激活劑和康復(fù)措施在該通路的具體作用機(jī)制以及在人體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激能力并不十分清楚，特異性激活該通路還可能出現(xiàn)不可預(yù)測的影響。隨著研究進(jìn)展，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與該通路相關(guān)，推測該信號通路在各個領(lǐng)域中具有廣闊的研究價值和發(fā)展前景。探索以Keap1-Nrf2/ARE 通路為靶點的其他藥物以及康復(fù)治療措施，可為控制MS 病情進(jìn)展和臨床治療提供更多選擇。