具有抗氧化功能的副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M9-1的安全性初步評價

王英，范琳琳，施亞萍，李亞輝，王帆，周劍忠

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所南京210014；2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司南京211225）

0 引 言

乳酸菌主要來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品（乳制品、開菲爾、發(fā)酵茶、發(fā)酵肉、泡菜等），也是腸道微生物的重要菌群。研究表明，乳酸菌具有多種功能作用，在機(jī)體的氧化應(yīng)激、膽固醇降解、免疫力調(diào)節(jié)、炎癥抵抗、腸道菌群的平衡調(diào)節(jié)和病原菌抑制等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。

乳酸菌對發(fā)酵制品的風(fēng)味、感官、質(zhì)地等方面也發(fā)揮這個重要作用[3]。但是也有研究結(jié)果顯示，有些乳酸菌具有抗生素抗性，甚至出現(xiàn)了多重耐藥性[4]。而經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵的產(chǎn)品和益生菌制劑一般不再經(jīng)過二次消毒即可直接食用，如果乳酸菌含有可轉(zhuǎn)移的抗藥基因，就可能作為傳播的媒介將抗性基因轉(zhuǎn)移給其他腸道細(xì)菌，進(jìn)而對人體健康造成危害。

目前我國沒有相關(guān)乳酸菌安全性評價的相關(guān)準(zhǔn)則，但乳酸菌菌株是否有毒性及有害代謝產(chǎn)物檢測、耐藥性檢測、對機(jī)體的內(nèi)在影響等研究也是必不可少的。副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1來源于傳統(tǒng)自然發(fā)酵奶食品，具有優(yōu)良的體外和體內(nèi)抗氧化能力、發(fā)酵性能和抗逆能力,具有潛在的應(yīng)用價值和前景[5-6]。本研究對兩菌株進(jìn)行耐藥性實(shí)驗(yàn)、機(jī)體指標(biāo)和有害代謝產(chǎn)物的評價實(shí)驗(yàn)以及急性毒理實(shí)驗(yàn)，利用體外實(shí)驗(yàn)評價這兩株菌的安全性，為其以后的開發(fā)和應(yīng)用提供理論的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與小鼠

副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品工程研究室保存。

實(shí)驗(yàn)動物采用SPF(Specific pathogen-free)級昆明種小鼠，雄性ICR（Institute of Cancer Research），體重20±2 g，由揚(yáng)州大學(xué)動物中心提供（Scxk蘇2012-0004）。實(shí)驗(yàn)動物普通飼料由青龍山飼料物廠提供。

儀器與試劑：UV-1600PC紫外分光光度計，上海美普達(dá)科技有限公司；DYCP-電泳儀，北京六一儀器公司；GIS3500凝膠成像儀，上海天能儀器有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SIGMA3K-15臺式冷凍離心機(jī)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；124S-CW分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TOMY SX 500自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司。

質(zhì)粒小量提取試劑盒(DP103)，購自Qiagen公司；藥敏紙片（鏈霉素、氨芐西林、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素、利福平、多粘菌素、青霉素G、環(huán)丙沙星和紅霉素），購于杭州濱和微生物試劑有限公司；胰酶、膽鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-賴氨酸鹽酸購自阿拉?。谎桨遒徸阅暇┍阍\生物科技有限公司；其他所用化學(xué)試劑均為分析純級化學(xué)試劑，購自南京卓越生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)

小鼠適應(yīng)一周后，稱重，然后隨機(jī)分成3組（每組10只）。將小鼠同室分籠喂養(yǎng)，采用自然光照，自由采食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25±2℃，相對濕度60%。

1.2.2 FM-M 9-1和FM-LP-4培養(yǎng)及菌體處理

無菌條件下，從新鮮培養(yǎng)的FM-M 9-1和FM-LP-4的平板上挑取單菌落至MRS液體試管中，37℃條件下靜止培養(yǎng)18～20 h至穩(wěn)定初期，按3%的接種量轉(zhuǎn)接到含有150 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)18 h，上述培養(yǎng)好的菌液5 000 r/m離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗2次后重懸菌體，調(diào)整菌體密度（5.01±0.05）×109CFU/mL，備用。

1.2.3 急性毒理實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)的清潔級昆明雄性小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。分別編號為FM-M 9-1實(shí)驗(yàn)組、FM-LP-4實(shí)驗(yàn)組和對照組。將制備好的菌液按每只0.2 mL/10 g體重的劑量進(jìn)行灌胃，一日3次，每次間隔3 h。對照組灌胃相同量的生理鹽水。觀察7日內(nèi)小鼠的活動狀態(tài)，灌胃結(jié)束后稱重并用頸椎脫臼法處死小鼠，計算小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)。

1.2.4 FM-M 9-1和FM-LP-4的藥敏性測定

耐藥性試驗(yàn)：采用藥敏紙片擴(kuò)散法行藥敏試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)中選取常見的11種藥敏紙片，包括鏈霉素、氨芐西林、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素、利福平、多粘菌素、青霉素G、環(huán)丙沙星和紅霉素。以大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌。取100μL FM-M 9-1和FM-LP-4菌液分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，待菌液被培養(yǎng)基完全吸收后，將藥敏紙片放于培養(yǎng)基上，靜置20 min后，倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。

1.2.5 FM-M 9-1和FM-LP-4質(zhì)粒提取

取1.5 m L培養(yǎng)好的菌液，使用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)提取質(zhì)粒。提取步驟參照說明書。在菌體破壁處理步驟中，加入溶菌酶。提取樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測，以含有PMG36e質(zhì)粒的乳酸乳球菌1363為陽性對照。

1.2.6 FM-M 9-1和FM-LP-4生物膜性能測定

菌株的形成生物膜的能力測定的方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，稍作修改，具體方法如下：分別挑取新鮮培養(yǎng)的FM-M 9-1和FM-LP-4的單菌落接種到含有0.25%（m/m）葡萄糖的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)18～20 h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%葡萄糖的MRS液體培養(yǎng)基稀釋20倍，之后取200μL接種到無菌的96孔板中，37℃條件下培養(yǎng)24 h，用無菌的PBS（p H 7.2～7.4）緩沖液沖洗96孔板，倒置干燥后用1%的結(jié)晶紫染色15 min，再次用PBS緩沖液沖洗后加入甲醇和乙醇混合液（80∶20，體積比）溶解，在595 nm條件下測定吸光值。生物膜形成能力采用下面的表示方法表示，吸光值小于1，無成膜能力，吸光值介于1～2之間，成膜能力弱，吸光值在2～3之間，成膜能力中等，吸光值大于3，成膜能力強(qiáng)。

1.2.7 FM-M 9-1和FM-LP-4溶血特性測定

菌株的溶血特性實(shí)驗(yàn)的方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，稍作修改。具體方法如下，分別從培養(yǎng)48 h的平板上挑取FM-M 9-1和FM-LP-4單菌落無菌條件下劃線接種于含有7%羊血的血平板上，以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為對照，其中金黃色葡萄球菌為β-型，表皮葡萄球菌為γ-型。37℃培養(yǎng)72 h觀察溶血圈，菌落周圍沒有明顯變化，其溶血型為γ-型，參照表皮葡萄球菌的溶血現(xiàn)象；在菌落周圍有明顯的溶血圈的為β-型，參照金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象；菌落周圍呈現(xiàn)墨綠色為α-型。

1.2.8 FM-M 9-1和FM-LP-4產(chǎn)生物胺性能測定

檢測菌株FM-M 9-1和FM-LP-4產(chǎn)生物胺的方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，稍作修改。具體操作方法如下：將FM-M 9-1和FM-LP-4接種至分別含有0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)差）的氨基酸前體（L-酪氨酸二鈉鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-賴氨酸鹽酸鹽）的MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)10次，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脫羧酶。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌株在分別含有1%的氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸）的脫羧酶培養(yǎng)基上，以不含氨基酸的脫羧酶培養(yǎng)基作為對照，平板在37℃條件下培養(yǎng)4 d，菌體周圍顏色變紫的菌株具有脫羧酶活性，顏色與不含氨基酸的脫羧酶培養(yǎng)基上相同的菌株不具有脫羧酶活性。

1.2.9 FM-M 9-1和FM-LP-4有害代謝產(chǎn)物評價試驗(yàn)

1.2.9.1 吲哚實(shí)驗(yàn)。

將活化好的FM-M 9-1和FM-LP-4菌株按2%的接菌量分別接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)72 h，加入吲哚試劑8～10滴，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.9.2 硝酸鹽還原酶活性檢測。

將活化好的FM-M 9-1和FM-LP-4菌株按2%的接菌量分別接入到硝酸鹽培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)5 d后，滴加碘化鉀和淀粉溶液各10滴，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.9.3 產(chǎn)偶氮還原酶能力的測定。

將過夜活化的FM-M 9-1和FM-LP-4菌液涂布于含有5 mg/L直接藍(lán)71的MRS固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)72 h，觀察水解圈的產(chǎn)生情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 13.0和One-Way（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性毒理實(shí)驗(yàn)

灌胃的7 d內(nèi)，小鼠的進(jìn)食、飲水和活動正常，無異常行為，皮毛正常。體重結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重正常，與對照組無顯著差異性（見表1）。實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟器系數(shù)和腎臟器系數(shù)與對照組相比沒有明顯差異（P＞0.05）。

表1 體重和臟器系數(shù)（肝和腎）

2.2 耐藥性評價試驗(yàn)

隨著乳酸菌安全性研究成為關(guān)注的熱點(diǎn)，乳酸菌對抗生素抗性的研究逐漸增多。本試驗(yàn)測定了FM-M 9-1和FM-LP-4菌株對11種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示：FM-M 9-1和FM-LP-4菌株都對萬古霉素、慶大霉素和多粘菌素具有抗性，對其他抗生素都具不同程度的有敏感性，具體結(jié)果見表2。

2.3 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4質(zhì)粒提取

腸球菌的抗藥基因是乳酸菌抗藥性的研究熱點(diǎn)，例如紅霉素、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素和慶大霉素耐藥相關(guān)的基因，這些基因位于可轉(zhuǎn)移性遺傳物質(zhì)上[10]。本研究利用提取試劑盒提取菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳做質(zhì)粒檢測，檢測結(jié)果顯示兩菌株所在泳道均未出現(xiàn)熒光條帶(見圖 1)，可以認(rèn)定FM-M 9-1和FM-LP-4不含有耐藥質(zhì)粒。耐藥基因可能存在于細(xì)菌DNA上，即不攜帶有可轉(zhuǎn)移的耐藥基因。

表2 FM-M9-1和FM-LP-4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 質(zhì)粒提取試驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的溶血特性分析

溶血現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于溶血性細(xì)菌侵入引起的，嚴(yán)重時導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生。不具有溶血活性是乳酸菌作為安全菌株篩選和使用的一個重要條件[11]。本研究對FM-M 9-1和FM-LP-4的溶血活性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示，F(xiàn)M-M 9-1和FM-LP-4在7%羊血平板上，37℃培養(yǎng)72 h后長出菌落的周圍沒有明顯變化，說明這兩株菌溶血型為γ-型，不具有溶血活性。Maragkoudakis等對干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的溶血特性研究結(jié)果顯示，菌株大部分是γ-型，少部分是a-型[12]。

2.5 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的生物胺產(chǎn)生能力

正常量的生物胺具有重要的生理作用，是激素、核酸、生物堿等物質(zhì)的前體，具有維持免疫系統(tǒng)代謝活性和正常的內(nèi)臟功能，但當(dāng)超過一定的量就會對人體產(chǎn)生毒副作用[13]。2011年10月歐盟食品安全局（EFSA）發(fā)布關(guān)于“發(fā)酵食品中生物胺”的科學(xué)意見，認(rèn)為組胺和酪胺是最具毒性。另外，生物胺之間的毒性具有協(xié)同增加作用。二胺和多胺會抑制單胺的代謝，進(jìn)而使毒性增強(qiáng)。脫羧酶是生物胺形成過程中的主要酶，因此，檢測乳酸菌中是否具有氨基酸脫羧酶活性是乳酸菌應(yīng)用的一個主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中對FM-M 9-1和FM-LP-4的脫羧酶活性進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，平板在37℃條件下培養(yǎng)4 d，F(xiàn)M-M 9-1和FM-LP-4菌體周圍與不含氨基酸的脫羧酶培養(yǎng)基上相同，表明菌株FM-M 9-1和FM-LP-4沒有本研究內(nèi)容中所包含的4種脫羧酶活性。

2.6 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4形成生物膜能力

在食品工業(yè)中，從衛(wèi)生和安全的角度來看，菌株成膜是不利因素。因?yàn)槌赡た梢詫?dǎo)致食品污染，同時成膜給病原微生物粘附到食品表面提供有利條件。有研究對乳酸菌一些菌株的形成生物膜的能力及相關(guān)的功能基因進(jìn)行報道[14]。本研究中的FM-M 9-1和FM-LP-4的成膜結(jié)果顯示，兩株菌的595 nm的值小于1，無形成生物膜的能力。

2.7 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4有毒代謝產(chǎn)物檢測

本研究測定了FM-M 9-1和FM-LP-4菌株的有毒代謝產(chǎn)物吲哚類物質(zhì)、硝酸鹽還原酶和產(chǎn)偶氮還原酶能力（見表3）。吲哚實(shí)驗(yàn)可以檢測菌株是否能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)消化。色氨酸代謝過程發(fā)生障礙會引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[15]。從表中可以看出，F(xiàn)M-M 9-1和FM-LP-4的代謝產(chǎn)物中沒有吲哚類物質(zhì)。硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，與食品中蛋白質(zhì)分解中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，后者可誘發(fā)多種癌癥如肝癌、胃癌、食道癌和咽癌等[16]，從表中可以看出，F(xiàn)M-M 9-1和FM-LP-4菌株都不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無活性。部分乳酸菌代謝產(chǎn)物中含有偶氮還原酶，能夠催化偶氮鍵（R 1-N=N-R 2）斷裂。研究結(jié)果顯示，機(jī)體內(nèi)微生物代謝產(chǎn)物偶氮還原酶也能還原成某些物質(zhì)為致突變劑或致癌物質(zhì)[17]。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)M-M 9-1和FM-LP-4菌株都不含有偶氮還原酶或偶氮還原酶無活性。

表3 FM-M 9-1和FM-LP-4有毒代謝產(chǎn)物試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

隨著對乳酸菌研究的深入，發(fā)掘出越來越多的功能特性。目前乳酸菌除了應(yīng)用到發(fā)酵食品中，在微生態(tài)益生制劑中的應(yīng)用也越來越多廣泛。雖然大量文獻(xiàn)證明，大多數(shù)乳酸菌菌株或使用乳酸菌進(jìn)行食品發(fā)酵是安全可行的，但也有少量研究結(jié)果顯示能夠從一些患者體內(nèi)分離出乳酸菌，可能與尿道感染、心內(nèi)膜炎等疾病有關(guān)[18]。因此，對新篩選出的擬作為食品發(fā)酵劑或益生菌劑的乳酸菌進(jìn)行安全性評價是十分必要的，尤其是用于食品的菌株[19]。乳酸菌的耐藥性是目前乳酸菌安全性評價中關(guān)注的一個內(nèi)容，研究結(jié)果顯示有些乳酸菌對氨基糖苷類、萘啶酸類、萬古霉素類、頭孢霉素類等抗生素藥品有抗性[20]。乳酸菌本身具有的一些固有抗性是有益的，能夠作為益生菌劑在腸道菌群調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。但是攜帶質(zhì)粒的具有抗藥性的乳酸菌，有可能作為傳播媒介把抗性基因轉(zhuǎn)移給其他腸道細(xì)菌，導(dǎo)致超級細(xì)菌的產(chǎn)生，進(jìn)而對人體健康造成危害[4]。但本實(shí)驗(yàn)中副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1菌株具有萬古霉素、慶大霉素和多粘菌素抗性，但沒有提取耐藥質(zhì)粒。該研究中菌株的抗藥性選擇了一些常規(guī)的抗生素測定其抗性，對其他的抗生素是否具有抗性在后續(xù)的研究中需要繼續(xù)。

副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1是來源于新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶的兩株乳酸菌，均具有優(yōu)良的抗氧化功能，具有良好的加工穩(wěn)定性[5-6]。本研究對副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1安全性進(jìn)行初步評價，結(jié)果顯示這兩株菌均不具有硝酸鹽還原酶活性、偶氮還原酶活性和氨基酸脫羧酶活性（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸）。形成生物膜能力都比較弱。為了提供更加全面的安全性指標(biāo)，對菌株的抗藥性基因和有毒基因的檢測仍需要繼續(xù)研究。另外，利用動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1的安全性也是后續(xù)的研究重點(diǎn)。