QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑

楊明，伊鋆，胡筱靜，董秋花，許晴，李首道，盧躍鵬，江小明，涂鳳琴

（武漢食品化妝品檢驗所武漢430012）

0 引言

β-受體激動劑屬于腎上腺類合成藥物，它具有苯乙醇胺結構[1-2]，對支氣管哮喘、痙攣和高血壓等癥狀均有較好的效果。其能夠擴張平滑肌，進而提高肺活量，同時也可以調控胰島素從而加速分解體內糖類和脂類。然而在動物飼料中添加此類藥物，可以明顯提升動物的廋肉率。但是食品中殘留的瘦肉精會對人體造成嚴重的危害，會出現(xiàn)中毒、引發(fā)惡性腫瘤，甚至是導致死亡等[3-4]。在2002年，我國已將β-受體激動劑列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》[5]，然而在經濟利益的驅使下，依然存在β-受體激動劑非法濫用的情況。嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒生長期不可或缺的營養(yǎng)食品，其β-受體激動劑殘留將會給嬰幼兒的正常發(fā)育和健康成長帶來巨大的傷害。因此，建立嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑分析方法對于監(jiān)控嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動劑殘留情況，以保障嬰幼兒食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。

目前動物源食品中β-受體激動劑類藥物的測定方法主要有毛細管電泳法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[7]、液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[9]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[10]等。毛細管電泳法操作簡便，但分離能力較弱，穩(wěn)定性差，重現(xiàn)性不好。酶聯(lián)免疫吸附法快速簡單，但易出現(xiàn)假陽性。GC-MS法通常需要衍生化處理，操作繁瑣。HPLC法分離效果較好，但是定性能力和特異性較差；HPLC法定性能力較弱，特異性較差；HPLC-MS/MS法具有高靈敏度、高選擇性和抗干擾能力強等特點，已在動物源類食品分析中得到廣泛的應用。在前處理技術方面，傳統(tǒng)的前處理技術存在有機溶劑使用量大、操作復雜等缺點。QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）技術其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點，近年來在獸藥殘留檢測領域應用廣泛[11-12]。目前關于嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動劑測定的方法少見報道。本研究結合了QuECh-ERS技術的操作快速簡便和質譜的高選擇性、高靈敏度等特點，建立了QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質譜（QuEChERS-HPLC-MS/MS）同時檢測嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑類藥物殘留的分析方法。方法操作簡便、分析速度快、準確性高、重現(xiàn)性好，能夠為嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑殘留狀況的監(jiān)測提供有力的技術支撐。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

SCIEX4500TripleQuad質譜儀(配有可用于電噴霧電離的TurboV離子源），美國ABSCIEX公司；LC30A液相色譜儀，日本島津公司；AllegraX-15R Centrifuge離心機，美國貝克曼庫爾特公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器，美國ScientificIndustries公司；PM5-2000TL超聲波清洗器，普律瑪儀器公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；ME204/02電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，英國Genevac公司。

克倫特羅（CAS：37148-27-9）、沙丁胺醇（CAS：18559-94-9）、萊克多巴胺（CAS：90274-24-1）、特布特林（CAS：23031-32-5）、西馬特羅（CAS：54239-37-1）、噴 布 特 羅（CAS：38363-32-5）、妥 布 特 羅（CAS：41570-61-0）、馬布特羅（CAS：54240-36-7）、馬噴特羅（CAS：95656-68-1）、溴氯布特羅（CAS：37153-52-9）、溴布特羅（CAS：41937-02-4）、羥甲基克倫特羅（CAS：

37162-89-3）、塞布特羅（CAS：54239-37-1）、鹽酸苯氧丙酚胺（CAS：579-56-6）均為FirstStandard品牌標準品（純度均≥97.0%），天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸銨（均為色譜純），德國Merck公司；甲酸、氨水（均為色譜純），美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、氨基（NH2）吸附劑、中性氧化鋁(Al2O3-N)、弗羅里硅土（Florisil）和氧化鋯（Zirconia），上海安譜科學儀器公司；乙酸銨、氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）和硫酸鈉（Na2SO4），國藥集團化學試劑有限公司；超純水（18.2MΩ·cm）由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取適量14種β-受體激動劑標準品，用甲醇溶解，配制質量濃度約為10μg/mL的標準儲備液，于-18°C保存。臨用時用空白樣品基質提取液配制系列濃度的標準工作溶液，用于制作標準曲線。

1.3 樣品前處理

嬰幼兒配方奶粉充分混勻，準確稱取1g（精確至0.0001）試樣置于50mL具塞塑料離心管中，加入5.0mL2mol/L乙酸銨緩沖液，50μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋使奶粉充分溶解，37℃酶解12h，然后再加入10mL5.0%氨水乙腈，渦旋混勻，超聲提取30min，加入3gNaCl+3gNa2SO4，渦旋振蕩,以4750r/min冷凍離心5min。取全部上清液置于含100mgPSA吸附劑的15mL具塞離心管中，渦旋振蕩2min，4750r/min離心5min，取5mL上清液于試管中，40℃旋轉濃縮至近干，用1.0mL乙腈-0.1%甲酸水（1+9，體積比）復溶，經0.22μm濾膜過濾后，供HPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)；柱溫：40℃；進樣量：5μL；流動相A：5mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1.5min，5.0%B；1.5～4.0min，5.0%～40.0%B；4.0～6.0min，40.0%～90.0%B；6.0～9.0min，90.0%B；9.0～9.01min，90.0%～5.0%B；9.01～12.0min，5.0%B。

1.4.2 質譜條件

電離源：ESI正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式；電噴霧電壓(IS)：4500V；霧化氣(GS1)：50.0psi；輔助氣流速(GS2)：50psi；氣簾氣壓力(CUR)：35psi；碰撞氣體(CAD)：Medium；離子源溫度(TEM)：500℃。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

利用針泵進樣將兩種目標化合物的標準溶液注入質譜儀中優(yōu)化質譜參數(shù)。分別采用ESI+和ESI-模式對14種β-受體激動劑進行母離子全掃描，結果表明14種β-受體激動劑在ESI+和ESI-模式下均有較高的質譜響應，在ESI+模式下信號穩(wěn)定性較好。因此優(yōu)先選擇ESI+掃描模式，在該模式下兩種化合物均產生[M+H]+的母離子。對兩種化合物進行二級碎片離子掃描，選擇響應較高、干擾小的兩個碎片離子用于定性定量分析，其中響應最高的碎片離子用于定量分析，同時優(yōu)化各目標化合物的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等質譜參數(shù)。目標化合物的質譜條件如表1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗選擇WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)色譜柱對14種β-受體激動劑進行分離分析。采用ESI+模式，比較了14種β-受體激動劑在乙腈-水與甲醇-水流動相體系中的色譜行為，結果表明，目標化合物在乙腈-水流動相體系中分離度較好。在流動相中加入適量的酸和乙酸銨可以提高分析物的離子響應和分離度，從而達到足夠的靈敏度。因此，本研究進一步考察在流動相體系中添加不同含量的甲酸、乙酸銨對目標物響應的影響。結果表明，以5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈為流動相時，各目標物的質譜響應高、保留穩(wěn)定且峰形好。因此，本實驗采用5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈作為流動相。

表1 14種β-受體激動劑的母離子、子離子等重要質譜參數(shù)

2.3 提取試劑優(yōu)化

14種化合物具有苯乙醇胺結構母核[13]，極性強，易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶劑，本實驗選用乙腈、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑并比較其提取效率。結果發(fā)現(xiàn)，甲醇提取液的水分較多且顏色較深，不僅會干擾目標物的分析、損害色譜柱、污染質譜離子源；乙酸乙酯作為提取溶劑時乳化現(xiàn)象嚴重；嬰幼兒配方奶粉中含有豐富的蛋白質和脂類，而乙腈具有很好的沉淀蛋白作用[14]，且各化合物的提取回收率均優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。故本實驗選擇乙腈作為提取溶劑，同時進一步考察比較了添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%氨水的乙腈提取情況，測定結果以3次平行測定的平均值表示。結果表明：14種目標化合物在0.5%、1%、2%三種氨水乙腈提取溶劑中平均回收率相差不大，分別為72.61%、72.14%、71.66%，且略低于3%、4%、6%三種氨水乙腈的平均回收率，分別為77.06%、81.06%、79.87%。相比之下5%氨水乙腈作為提取溶劑時的平均回收率最高，為93.30%，特別是沙丁胺醇的回收率大大高于其它5種，且各目標物的回收率均在80%～110%之間，完全滿足實驗要求。因此本實驗采用5%氨水乙腈作為提取溶劑。不同提取溶劑對目標物回收率的影響如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑對目標物回收率的影響

2.4 吸附劑的選擇

嬰幼兒配方奶粉基質中富含蛋白質、脂肪和糖類等多種有機成分，可能會對目標化合物的測定造成干擾。本實驗考察了含量均為100 mg的PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、NH2吸附劑、中性氧化鋁（Al2O3-N）和弗羅里硅土（Florisil）和氧化鋯（Zirconia）等QuECh-ERS方法常用凈化劑對目標化合物的凈化效果和回收率情況，測定結果以3次平行測定的平均值表示。結果表明（如圖2所示），NH2吸附劑和Al2O3-N作為吸附劑時各目標化合物的平均回收率分別為79.81%和76.61%，均在70%～80%之間；PSA、C18、GCB、Florisil和Zirconia作為吸附劑時各目標化合物平均回收率分別為83.45%、84.72%、85.84%、83.88%和80.35%，均優(yōu)于NH2吸附劑和Al2O3-N，且噴布特羅在PSA吸附劑條件下的回收率為70.93%，而在其它6種吸附劑條件下回收率均低于60%，表明這六種吸附劑對噴布特羅具有一定程度的吸附。故本實驗最終選用100 mg PSA吸附劑對樣品提取液進行凈化。

圖2 不同凈化劑對目標物回收率的影響

2.5 鹽析劑的優(yōu)化

NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的鹽析劑，嬰幼兒配方奶粉樣品經過酶解后的水分含量較高，需要加入合適的鹽析劑使在用5%氨水乙腈提取時出現(xiàn)有機相和水相分層，以達到除水的目的。本實驗考察了6 g NaCl、6 g MgSO4、6 g Na2SO4、3 g NaCl+3 g MgSO4、3 g NaCl+3 g Na2SO4、3 g MgSO4+3 g Na2SO46種鹽析劑對目標化合物回收率的影響，測定結果以3次平行測定的平均值表示。結果表明（如圖3所示），Mg-SO4、NaCl+MgSO4、MgSO4+Na2SO4三種鹽析劑分別為52.71%、78.71%、60.85%，各目標化合物平均回收率偏低，可能原因是目標物與Mg2+發(fā)生螯合反應；Na2SO4作為鹽析劑時目標化合物的平均回收率為53.14%，完全不滿足實驗要求；而NaCl和NaCl+Na2SO4這兩種作為鹽析劑時平均回收率分別為83.29%和90.59%，很明顯NaCl+Na2SO4作為鹽析劑時效果優(yōu)于NaCl。因此，在該實驗中，選擇3 g NaCl+3 g Na2SO4作為鹽析劑。

圖3 不同鹽析劑對目標物回收率的影響

2.6 基質效應

基質效應（Matrix Effect,ME）是指目標化合物在離子化時受到樣品基質中的某些組分的干擾而引起的分析信號變化，包括基質增強效應和基質抑制效應?；|效應可通過比較基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率來評價[15]。計算公式：ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率。當ME為0.85-1.15時，基質效應不明顯；當ME＞1.15時，存在基質增強效應；當ME＜0.85時，存在基質抑制效應[16]。本實驗對14種β-受體激動劑的基質效應進行了評價。結果表明，羥甲基克倫特羅（ME=0.84）基質效應＜0.85，存在一定的基質抑制效應，其它13種化合物的基質效應均在0.85～1.15之間。為使定量分析結果更加準確可靠，故本實驗采用基質匹配標準工作溶液作校準曲線來降低基質效應對測定結果的影響。

2.7 方法學考察

用空白基質提取液配制系列濃度的14種β-受體激動劑混合標準工作溶液，在各優(yōu)化條件下分析測定，以峰面積為縱坐標(y)，質量濃度為橫坐標(x)繪制基質標準工作曲線。結果表明，14種目標化合物在0.5～58.0 ng/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數(shù)（r）均大于0.9990。以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）計算定量限（LOQ），目標化合物的檢出限均為0.12～0.52μg/kg，定量限為0.40～1.73μg/kg。選取陰性樣品添加3個濃度水平(2.0、10.0、40.0μg/kg)的混合標準溶液，每個加標水平做6個平行樣，以考察方法的回收率和精密度。結果見表2，14種目標化合物的平均回收率為70.69%～98.54%，相對標準偏差為0.59%～9.24%，方法回收率高、精密度高，滿足嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑殘留監(jiān)測的要求。

表2 分析物的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.8 實際樣品測定

采用本方法對從市場上隨機抽取的56批次嬰幼兒配方奶粉（28批次Ⅰ段，14批次Ⅱ段，14批次Ⅲ段）進行了測定，結果表明，所測嬰幼兒配方奶粉中均未檢出這14種β-受體激動劑。

3 結論

本研究以5%氨水乙腈為提取溶劑，采用QuECh-ERS前處理技術，結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，通過優(yōu)化色譜質譜條件，建立了快速測定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑的分析方法。方法簡單快速、操作簡便、靈敏可靠，并成功用于實際樣品的測定，可作為嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑的定性定量檢測手段，對于嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動劑殘留情況的監(jiān)測具有重要的應用價值。