膿毒癥體內(nèi)外模型研究進展

李 晗， 田李均， 韓旭東

膿毒癥（sepsis）被定義為機體對感染反應失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙[1]，是危重癥患者死亡的主要原因。近年來，膿毒癥的患病率和膿毒癥相關死亡人數(shù)一直在增加[2]。Fleischmann等[3]研究指出，膿毒癥的總體院內(nèi)病死率約為25%～30%，當存在休克時，則高達40%～50%[4-5]，迄今為止還沒有有效的特異性抗膿毒癥治療措施，膿毒癥及其相關并發(fā)癥仍是當代醫(yī)學的一大挑戰(zhàn)，也是全世界重癥監(jiān)護病房長期存在的問題。然而膿毒癥潛在的病理生理學機制至今仍知之甚少。為了研究膿毒癥復雜的分子學機制、深入了解膿毒癥期間機體損傷后發(fā)生的病理生理變化，進而發(fā)現(xiàn)潛在的治療藥物，各種實驗模型相繼出現(xiàn)。本文將對膿毒癥體內(nèi)外實驗模型分別進行闡述，為適宜而準確地應用實驗模型去研究膿毒癥的病理生理學機制和測試潛在的新型治療藥物提供理論依據(jù)。

1 膿毒癥體內(nèi)模型

1.1 血流感染模型

病原微生物和毒素進入血液循環(huán)，對機體的器官功能造成損害，嚴重者可出現(xiàn)休克、多臟器功能衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血甚至死亡[6]。因此血流感染模型主要是模仿病原微生物和毒素侵入血流所引起的全身性感染。目前常用的主要有內(nèi)毒素模型和細菌感染模型。

1.2 內(nèi)毒素模型

體內(nèi)內(nèi)毒素模型已被廣泛用于研究膿毒癥的病理生理學機制[7]。內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁外膜中的脂多糖（LPS）成分，膿毒癥患者血液中內(nèi)毒素的濃度與病情和預后密切相關。給動物靜脈注射內(nèi)毒素可以誘導多種炎性介質(zhì)的合成和釋放，引起急性感染癥狀，死亡率較高。內(nèi)毒素可以經(jīng)靜脈注射、腹腔注射，也可通過氣管注入體內(nèi)[8-10]。該模型在操作上相對簡單，并且比較容易重復。但是有研究提出，內(nèi)毒素模型不能準確地再現(xiàn)膿毒癥的細胞因子表達譜[11]，即不能準確地反映人類膿毒癥的復雜性，因此該模型不再被認為是準確模擬膿毒癥的有效模型。

1.3 細菌感染模型

除上述內(nèi)毒素模型外，還存在多種細菌感染模型。例如腹腔注射大腸埃希菌、靜脈注射銅綠假單胞菌等[12-13]。許多實驗通過推注或短期持續(xù)輸注大劑量細菌來誘導膿毒癥的模型，在這些模型中，輸注細菌會導致心功能和心輸出量快速、顯著降低，并且實驗動物可在數(shù)小時內(nèi)死亡[14]。細菌可以通過靜脈、氣管、肌肉或腹腔等途徑注射入體內(nèi)。其死亡率主要取決于注射細菌的種類和菌落形成單位（CFU）的數(shù)量、注射途徑、液體復蘇的程度以及是否使用抗生素等。但是它們同樣具有顯著的缺點，因為臨床膿毒癥往往是多細菌性感染，即要求細菌種類的復雜多樣，并且由于補體系統(tǒng)激活發(fā)揮快速裂解作用，大量細菌通常不會在宿主內(nèi)定植和復制，因此實驗所獲得的只是一種潛在的內(nèi)毒素中毒模型，而不是真正的多微生物感染的模型[11]。

1.3.1 呼吸道感染模型 通過向動物氣管或鼻腔內(nèi)注入鏈球菌、克雷伯菌或銅綠假單胞菌等，可誘導呼吸道感染的模型，注入細菌后，肺臟可出現(xiàn)彌散性損傷，肉眼可見肺腫脹、表面散在多個出血點，組織形態(tài)學觀察顯示有中性粒細胞聚集[14]。考慮到與膿毒癥的臨床病程不相符，該模型現(xiàn)已較少使用。

1.3.2 腹腔感染模型 誘導產(chǎn)生細菌性腹膜炎的方法，主要是試圖再現(xiàn)膿毒癥患者中觀察到的病理生理變化[15]。膿毒癥患者最常見的感染源來自腹腔，且造成腹腔內(nèi)感染相對容易，因此腹腔感染模型是目前最常采用的膿毒癥動物模型[16]。盲腸結扎穿刺 （CLP）模型和升結腸持續(xù)置管腹膜炎（CASP）模型是兩種研究膿毒癥常用的動物模型，均模仿臨床腹腔感染的病理生理過程。

1.3.3 CASP模型 CASP模型是膿毒癥的高度標準化模型。重現(xiàn)了急性多重細菌感染膿毒癥性腹膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程。其方法是將一固定管徑的支架插入大鼠或小鼠的升結腸中，使腸腔與腹腔相通，持續(xù)感染導致腹膜炎、菌血癥、多器官感染，以及多種促炎因子和抗炎因子的釋放。該模型動物的典型癥狀有活力降低、毛發(fā)豎立、出汗、進食減少、體重減輕以及逃避行為減少等。其死亡率以及細胞因子的變化主要與置入支架管的管徑大小有關。置入不同管徑的支架，可以產(chǎn)生不同的死亡率。例如，置入14G支架管產(chǎn)生的死亡率為100%，16G導致70%死亡率，使用18G支架管可達到50%死亡率，假手術組存活率為100%。通常，動物在CASP后48 h內(nèi)死亡。CASP誘導的膿毒癥還表現(xiàn)為促炎因子、抗炎因子和趨化因子的釋放，在CASP造模完成后12 h，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）可在血液中以及肝、肺、脾、腎等臟器懸浮液的上清液中檢測到腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL- 10、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子的大量表達。因此，在建立CASP模型時，應將生存率、細菌學和細胞因子釋放等作為控制CASP正確操作的參數(shù)。CASP模型是一種易于學習且高度可重復的模型，可以模擬膿毒癥的臨床病程。該模型可用于免疫學、感染病學或外科學等學科領域的研究[17-18]。

1.3.4 CLP模型 CLP模型已成為實驗膿毒癥最廣泛使用的模型，該模型非常類似于人類膿毒癥的病程進展和病理生理特征，能比其他模型更準確地反映臨床現(xiàn)實，因此目前被認為是膿毒癥研究的“金標準”。CLP模型通過結扎和穿刺盲腸，制造一個盲腸穿孔的模型，腸內(nèi)容物進入腹腔，多微生物感染加速誘發(fā)免疫應答，誘導產(chǎn)生腹膜炎、菌血癥、感染性休克以及多臟器功能衰竭，最終導致死亡。影響誘導膿毒癥嚴重程度的因素眾多，包括麻醉藥劑量、腹部切口長短、盲腸結扎位置、穿刺針直徑大小、穿刺孔數(shù)量、液體復蘇以及小鼠品系和性別等。值得一提的是，多數(shù)研究一致認為盲腸結扎位置是CLP模型中死亡率和疾病嚴重程度的最主要決定因素[19-21]。結論為：①結扎25%或以下的盲腸死亡率幾乎為零，為輕度膿毒癥；②結扎50%～60%的盲腸導致術后死亡率為60%，為中度膿毒癥；③結扎75%或以上的盲腸導致小鼠在術后2～3 d內(nèi)全部死亡，為重度膿毒癥。而在不同程度膿毒癥中，死亡主要集中在最初的48 h內(nèi)。有研究通過改變盲腸結扎位置和穿刺針直徑來調(diào)節(jié)膿毒癥的嚴重程度，其中提到與結扎長度小于1 cm的小鼠相比，結扎長度超過1 cm的小鼠死亡率顯著增加至100%；增加穿刺針的直徑也使得存活率從100%（22G針）降低至55%（19G針）。結論為：在上述兩個因素中，盲腸結扎位置比針頭大小影響更為顯著[20]。CLP誘導的膿毒癥術后6 h即可出現(xiàn)菌血癥，術后約12 h出現(xiàn)膿毒癥相關臨床癥狀，包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、毛發(fā)豎立、全身無力和活動減少等，術后18 h開始死亡[21]。總之，在制作CLP模型時，必須仔細考慮所有可能影響實驗的條件和技術參數(shù)以獲得可重復且一致的實驗結果。因此，要求實驗人員深入了解和熟練掌握操作過程才能準確地構建CLP模型。

1.3.5 CASP模型和CLP模型的比較 CASP模型和CLP模型所表現(xiàn)的疾病側重點不同，當實驗需要進行彌漫性腹膜炎的相關研究時，CASP模型優(yōu)于CLP模型；而對于其他腹腔內(nèi)感染如腹腔膿腫的研究，則應優(yōu)先選擇CLP模型[22]。

2 膿毒癥體外模型

2.1 巨噬細胞

巨噬細胞在膿毒癥期間對損傷作出第一反應，是宿主免疫防御的第一道防線[23-24]。巨噬細胞可產(chǎn)生許多細胞因子，包括促炎性細胞因子TNF-α以及抗炎性細胞因子IL-10等。機體損傷后釋放的促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的平衡影響膿毒癥的炎性反應程度和結局[25]。巨噬細胞在宿主抵御感染、修復組織損傷、分泌細胞因子從而調(diào)節(jié)炎性反應等方面起重要作用[26]；有文獻提到，膿毒癥期間的炎性反應依賴于單核細胞/巨噬細胞（如肝臟中的Kupffer細胞）上病原識別受體的激活（即Toll樣受體），這是膿毒癥的重要發(fā)病機制[27]。簡而言之，巨噬細胞在膿毒癥觸發(fā)炎性反應時起重要作用，膿毒癥的炎性反應過程與巨噬細胞關系密切。因此，巨噬細胞被廣泛用于膿毒癥的體外實驗研究。較常用于膿毒癥體外實驗的巨噬細胞包括來源于白血病小鼠的巨噬細胞（RAW264.7）和來源于骨髓的原代巨噬細胞（BMDM）等。

2.2 單核細胞

單核細胞在膿毒癥的發(fā)病機制中起核心作用[28]。膿毒癥期間，單核細胞進入一種炎癥激活狀態(tài)，并且伴隨著炎性介質(zhì)的大量釋放。隨著炎癥進展，機體逐漸進入免疫耐受狀態(tài)，單核細胞從炎癥激活狀態(tài)到免疫耐受狀態(tài)過程中呈現(xiàn)出不同的表型，這些表型產(chǎn)生細胞因子的能力也不同[29]。有研究表明，膿毒癥患者單核細胞CD14、HLA-DR的表達水平與膿毒癥的疾病嚴重程度相關[30-32]；并且嚴重膿毒癥患者的單核細胞表面CD40和CD80的表達顯著增多[32]。綜上，膿毒癥的病理生理學機制與單核細胞亦有著密不可分的關系。因此，單核細胞也被廣泛用于膿毒癥的體外實驗研究。常用的有人外周血單個核細胞（PBM）和人單核白血病細胞系（THP-1）等。

2.3 內(nèi)皮細胞

多個研究表明，內(nèi)皮細胞參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程[33-35]，并且內(nèi)皮細胞在膿毒癥的發(fā)病中起著重要作用。過度炎性反應和微血管功能障礙是膿毒癥的重要發(fā)病機制，而內(nèi)皮細胞是該過程中最重要的效應細胞[36]；膿毒癥期間誘發(fā)的內(nèi)皮細胞損傷在膿毒癥的疾病進展過程中起著至關重要的作用，并且內(nèi)皮細胞損傷的嚴重程度與膿毒癥的預后密切相關[37]；Zahran等[38]也提到，膿毒癥期間伴隨著廣泛的內(nèi)皮損傷，隨后循環(huán)中出現(xiàn)內(nèi)皮細胞，從而膿毒癥患者的循環(huán)內(nèi)皮細胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細胞（EPC）表達顯著增多，并且內(nèi)皮細胞的表達水平與膿毒癥的疾病嚴重程度和預后有關。因此內(nèi)皮細胞也是膿毒癥體外實驗研究的常用載體。例如，人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）和人肺微血管內(nèi)皮細胞（HPMEC）等。

2.4 其他細胞

樹突狀細胞（DC）是一種重要的抗原提呈細胞，在膿毒癥的免疫應答中發(fā)揮著重要作用[39]；膿毒癥和膿毒性休克伴隨著多個器官和組織的損傷，病程中可誘導成體干細胞的再生，因此也有研究分析造血干細胞（HSC）、EPC和極小胚胎樣干細胞（VSEL）等在膿毒癥過程中所發(fā)揮的作用[40]；還有研究以原代肝細胞為載體證明某蛋白激酶能夠減輕膿毒癥肝損傷[41]。根據(jù)不同的研究內(nèi)容，研究者會選擇不同的細胞作為載體。

3 存在的問題

Dejager等[42]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)膿毒癥動物實驗獲得的有效結果所提出的數(shù)種療法無法完全應用于臨床，這表明實驗性膿毒癥模型還不能完全模擬人類膿毒癥。所有膿毒癥模型在臨床相關性方面有2個共同的缺點：① 缺乏疾病發(fā)展所需的時間，構建實驗膿毒癥模型時都是要求可再現(xiàn)和快速的疾病過程。例如，在大多數(shù)實驗模型中，出現(xiàn)膿毒癥的炎性反應以及發(fā)展為多臟器功能衰竭發(fā)生在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)，而在臨床患者中，膿毒癥的疾病發(fā)展往往需要數(shù)天至數(shù)周；② 缺乏干預治療，臨床上會給患者加用各種標準療法去迅速治療膿毒癥，例如氧療、機械通氣、液體復蘇、抗生素、血管加壓藥以及營養(yǎng)支持等[43]。美國加州大學醫(yī)學院在膿毒癥動物模型研究方面曾提出：“這些臨床前研究的結果永遠不應該直接運用到人類膿毒癥問題上”[44]。鑒于這些因素，將由膿毒癥模型所得療效結果應用到臨床時，要求我們謹慎處理。

綜上所述，體內(nèi)腹腔感染如CLP模型和體外巨噬細胞為載體的膿毒癥模型分別是目前較為常用的膿毒癥體內(nèi)和體外實驗模型。除此以外，研究者也可根據(jù)具體研究內(nèi)容的不同選擇其他的造模方式。膿毒癥模型的改進可提高我們定義適當目標人群的能力，以便于更準確、更低成本地去進行有關膿毒癥治療的臨床試驗研究。最后，盡管仍存在缺點，但膿毒癥模型為深刻理解膿毒癥時宿主對感染的免疫反應及炎性介質(zhì)的作用作出了重要貢獻。膿毒癥的動物模型和體外細胞模型仍將是評估膿毒癥新治療策略最合適的工具。模型越接近于人類疾病，所得結果就越可靠。因此，如何縮小實驗性膿毒癥模型與臨床人類膿毒癥之間的差距，是需要我們共同面對和處理的問 題。