ctDNA在腫瘤檢測、篩查、預(yù)后和治療中的應(yīng)用進展

0 引言

目前，癌癥是危害人類健康的疾病之一。2020年，美國預(yù)計將會有1 806 590例癌癥新發(fā)病例和606 520例死亡病例[1]。研究人員一直在尋求可以通過篩查、判斷預(yù)后結(jié)果和監(jiān)測療效來檢測和治療癌癥的方法。然而，目前已知的診斷方法在癌癥檢測過程中有的可能會對患者的身體健康產(chǎn)生一定程度的影響，如放射學(xué)[2]；有的檢測效率較低，如超聲波掃描和磁共振成像（MRI）掃描等方法；有的是侵入性的，如組織活檢，且該方法存在一定的局限性[3]。因此，迫切需要開發(fā)用于癌癥篩查、預(yù)后以及治療的非侵入性和較準(zhǔn)確的方式。

液體活檢是體外診斷的一個分支，是一種非侵入式的血液檢測方法[4]?，F(xiàn)有的液體活檢技術(shù)主要包括循環(huán)腫瘤細胞（CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）以及外泌體檢測[5]。ctDNA是指腫瘤細胞脫落或者凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)中的一類DNA，是腫瘤細胞的一種特征性的生物標(biāo)志物。ctDNA中還含有其他腫瘤部位釋放到血液中的游離DNA，如腫瘤轉(zhuǎn)移部位、克隆性造血體細胞等，ctDNA檢測結(jié)果提供的是患者體內(nèi)腫瘤的全景數(shù)據(jù)，所以在腫瘤晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移時應(yīng)用ctDNA檢測具有可行性高、數(shù)據(jù)全、效果好等優(yōu)點，在癌癥臨床檢測中具有廣泛的應(yīng)用潛力[6-7]。在本文中，我們主要討論了ctDNA在腫瘤篩查和治療中的臨床應(yīng)用及其面臨的一些問題。

1 ctDNA

ctDNA是血液中腫瘤衍生的片段化DNA。ctDNA直接來自腫瘤或來自循環(huán)腫瘤細胞，其主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，存在于血漿或血清中[8]。ctDNA中常包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關(guān)突變信息[9]。健康人中ctDNA的水平僅以低水平存在，但在癌癥患者體內(nèi)可以檢測到更高水平的ctDNA[10]。目前關(guān)于ctDNA釋放的確切機制尚不明確。

2 ctDNA檢測方法

2.1 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（qPCR）是一種傳統(tǒng)的ctDNA檢測技術(shù)，已被廣泛運用于醫(yī)學(xué)檢測相關(guān)領(lǐng)域[11]。Spindler等[12]利用qPCR定量分析了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在接受西妥昔單抗和伊立替康治療期間血漿中cfDNA以及KRAS和BRAF突變的信息。該方法操作簡便、數(shù)據(jù)分析比較容易，且檢測費用低廉。但是該方法突變檢測限約為0.5%，而且只能檢測有限的基因位點信息，不能檢測未知序列。所以在ctDNA的相關(guān)檢測中具有一定的局限性。

2.2 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR,ddPCR）系統(tǒng)是第三代PCR技術(shù)。其在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，不需要標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線便可以實現(xiàn)絕對定量，突變檢測限約為0.01%。該方法只需要很少的模板量便可實現(xiàn)分析，與第二代PCR技術(shù)相比，該技術(shù)可以精確測定基因拷貝數(shù)、實現(xiàn)定性和定量分析痕量突變[13-14]。ddPCR滿足了更多臨床檢驗的需求，特別是檢測一些稀有樣本中的核酸信息。Taly等[15]利用雙重dPCR檢測結(jié)直腸癌患者血液中KRAS和BRAF突變信息。Gevensleben等[16]使用dPCR檢測了乳腺癌患者中HER2的拷貝數(shù)，測定的陽性預(yù)測值為70%，陰性預(yù)測值為92%。該方法的缺點是同樣只能檢測到有限的基因位點信息。

2.3 新一代基因測序

新一代基因測序（Next Generation Sequencing,NGS）技術(shù)因其通量高、成本較低等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于血漿DNA的分析中。根據(jù)檢測過程中的實驗方法和檢測目的不同，NGS技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用主要分為兩個方面：一是目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，該方法通過設(shè)計合適的芯片和探針，便可實現(xiàn)對多個已知致病基因的測序分析。Shu等[17]通過靶向新一代測序技術(shù)分析了ctDNA突變，為多種類型癌癥的個性化治療提供指導(dǎo)。Hou等[18]基于新一代測序技術(shù)檢測晚期非小細胞肺癌患者體內(nèi)的ctDNA，發(fā)現(xiàn)了可靶向的遺傳變異信息。該方法敏感度較高，而且較其他NGS技術(shù)便宜。雖然該方法沒有其他NGS方法的檢測結(jié)果全面，但是比較適用于有明確致病基因或易感基因的疾病。二是全外顯子組或全基因組測序。人全基因組重測序是對人類的不同個體或者是群體進行全基因組測序和生物信息學(xué)分析。Heitzer等[19]通過全基因組測序可以分析前列腺癌患者循環(huán)體系內(nèi)與腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)變化，也可以檢測癌癥患者循環(huán)體系中的染色體變異情況[20]。人全外顯子組測序是指將全基因組外顯子區(qū)域的DNA進行捕獲富集后，利用高通量測序技術(shù)進行測序的分析方法[21]。這兩種方法應(yīng)用范圍廣泛，不受個體的限制，但是費用較高，且敏感度較低。

3 ctDNA在腫瘤中的臨床應(yīng)用

通過檢測ctDNA，可以獲得血液中腫瘤的相關(guān)蹤跡信息。ctDNA已成為一類新的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的篩查、預(yù)后以及治療等各方面發(fā)揮著重要的作用。

3.1 ctDNA與腫瘤篩查

在腫瘤預(yù)測與篩查中，ctDNA已被作為液體活檢中的一種新型生物標(biāo)志物。Gao等[22]基于30例晚期胃癌患者的ctDNA和原發(fā)腫瘤的突變信息進行了研究，發(fā)現(xiàn)基于ctDNA的分析可以部分性地克服腫瘤的異質(zhì)性，并可能成為胃癌中HER2基因分析的潛在替代指標(biāo)。Bettegowda等[23]對640名不同類型的癌癥患者進行了研究，結(jié)果顯示有75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、胃-食管癌患者體內(nèi)均可檢測到ctDNA。該研究結(jié)果表明ctDNA是一種適用范圍廣、敏感度高且具有特異性的生物標(biāo)志物，可用于多種類型癌癥患者的臨床診斷。另有相關(guān)研究表明，在一些癌癥患者體內(nèi)，ctDNA的平均水平高于健康者。如Park等[24]通過比較54例胃癌患者和59例年齡相匹配的健康者血漿中ctDNA的信息發(fā)現(xiàn)患者組血漿ctDNA平均水平比對照組高2.4倍，表明血漿中的ctDNA水平可用于篩查胃癌患者。

ctDNA內(nèi)基因突變和異常甲基化也成為腫瘤預(yù)測和篩查的指標(biāo)。例如在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)常見的基因突變包括KRAS和BRAF V600E[25]。與基因突變相比，特定啟動子區(qū)域的異常DNA甲基化在ctDNA和腫瘤組織內(nèi)一致性更高。DNA甲基化是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期現(xiàn)象，已有研究分析了使用甲基化的ctDNA進行結(jié)直腸癌篩查和診斷。Herbst等[26]利用甲基化特異性qPCR分析了健康個體和結(jié)直腸癌患者血清中10個標(biāo)記基因的甲基化信息，發(fā)現(xiàn)NEUROG1基因的甲基化經(jīng)常在結(jié)直腸癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)，并且與腫瘤分期無關(guān)。結(jié)果表明定量檢測血清中NEUROG1 DNA甲基化是一種篩查無癥狀結(jié)直腸癌的非侵入性方法。另外，Warren等[27]發(fā)現(xiàn)SEPT9甲基化檢測法對結(jié)直腸癌患者的總體敏感度為90%（95%CI:77.4%～96.3%），特異性為88%（95%CI:79.6%～93.7%），可以檢測所有階段的結(jié)直腸癌患者，可作為篩查結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，適用于那些不愿意或不能進行結(jié)腸鏡檢查的結(jié)直腸癌患者。

3.2 ctDNA與腫瘤治療

大量研究表明，治療后腫瘤患者血漿中ctDNA的水平出現(xiàn)下降趨勢。因此，ctDNA可作為監(jiān)測放療和化療以及手術(shù)切除效果的生物標(biāo)志物[28]。Diehl等[29]發(fā)現(xiàn)所有結(jié)直腸癌患者血液樣本內(nèi)手術(shù)前均可檢測到ctDNA，連續(xù)血液采樣顯示ctDNA水平的變化與手術(shù)切除的程度相關(guān)。在該研究中，ctDNA（100%）水平檢測是比CEA（56%）更可靠和敏感的術(shù)后監(jiān)測指標(biāo)。Reinert等[28]發(fā)現(xiàn)通過ctDNA檢測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)時間比常規(guī)隨訪提前了2～15月（平均10月），且體檢結(jié)構(gòu)變異在監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)方面的敏感度和特異性均為100%。

然而，有研究卻發(fā)現(xiàn)治療后腫瘤患者血漿ctDNA濃度的增加也是某些病例治療成功的指標(biāo)。增加的ctDNA水平反映了細胞死亡的增加，這反過來表明了治療的有效性[30]。

ctDNA的早期變化與后期治療過程中腫瘤的反應(yīng)相關(guān)，并且連續(xù)的ctDNA檢測具有更顯著的應(yīng)用潛力，可補充到基于實體瘤的疾病評估標(biāo)準(zhǔn)中。Tie等[31]募集了53名接受一線化療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，并探索了ctDNA水平的早期變化，研究發(fā)現(xiàn)ctDNA可在大部分初治轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中檢測到。在第2周期治療前觀察到ctDNA顯著降低（P<0.001），通過放射成像觀察到ctDNA水平的倍數(shù)變化與腫瘤體積的百分比變化呈正相關(guān)（P=0.016）。研究結(jié)果說明一線化療期間ctDNA的早期變化預(yù)示著后期的放射學(xué)反應(yīng)。

除了監(jiān)測ctDNA水平的動態(tài)變化之外，分析ctDNA中癌癥特異性生物標(biāo)志物的變化模式可以作為預(yù)測和監(jiān)測癌癥治療反應(yīng)的早期定量指標(biāo)。Wang等[32]研究表明ctDNA中HER2拷貝數(shù)的變化可有效監(jiān)測曲妥珠單抗的療效，其功效優(yōu)于常用的標(biāo)志物CEA和CA199。

3.3 ctDNA與腫瘤預(yù)后

ctDNA在腫瘤預(yù)后中也具有很高的價值。研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA可能是與較差治療結(jié)果相關(guān)的可靠預(yù)后因素。ctDNA的陽性檢測意味著腫瘤患者在接受手術(shù)、化療、放療或靶向治療后，復(fù)發(fā)風(fēng)險高或總生存期短。Ling等[33]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中的XAF1甲基化與較差的預(yù)后顯著相關(guān)（P<0.001）。此外，術(shù)后胃癌患者血清中XAF1甲基化從陰性到陽性的轉(zhuǎn)變與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。檢測血清中循環(huán)甲基化DNA XAF1可評估胃癌患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)情況。

另外，研究發(fā)現(xiàn)TAC1和SEPT9甲基化增量的動態(tài)變化可獨立地預(yù)測結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)（在所有測試中P<0.05）。更重要的是，與同時期的血清中癌胚抗原（CEA）相比，隨訪患者血液內(nèi)術(shù)后6月TAC1和術(shù)后一年SEPT9能更早地表現(xiàn)出復(fù)發(fā)的可能性。因此，在結(jié)直腸癌患者的術(shù)后血清中檢測到的TAC1和SEPT9甲基化水平有望成為新的預(yù)后標(biāo)志物，并且可能被用于監(jiān)測結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)[34]。

通過檢測ctDNA也可以確定復(fù)發(fā)風(fēng)險最高的患者，找出后期輔助治療的方法。Tie等[35]研究發(fā)現(xiàn)在接受化療的患者中，化療結(jié)束后ctDNA的存在與較低的無復(fù)發(fā)生存期相關(guān)（風(fēng)險比為11; 95%CI:1.8～68;P=0.001）。Ⅱ期結(jié)腸癌切除術(shù)后的ctDNA檢測提供了殘留疾病的直接證據(jù)，并確定了復(fù)發(fā)風(fēng)險非常高的患者。

4 ctDNA在臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)

ctDNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，其在腫瘤的篩查、預(yù)后以及治療等多個方面的應(yīng)用越來越廣泛，特別是對于那些臨床癥狀不典型、檢查無特異性以及不能進行組織活檢的腫瘤患者。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究和ctDNA相關(guān)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，ctDNA的相關(guān)檢測勢必會成為臨床腫瘤篩查、預(yù)后判斷和治療等過程中一項重要檢測手段。

然而，目前ctDNA檢測技術(shù)仍面臨著一些需要克服的難題。針對不同種類及不同時期的腫瘤，并沒有樣本采集、ctDNA提取以及擴增的標(biāo)準(zhǔn)流程。在已發(fā)表的相關(guān)文獻內(nèi)并未有詳細的介紹，且不同文獻得到的ctDNA濃度也有所差異。通常體液中ctDNA會被巨噬細胞實時清除掉，從而導(dǎo)致含量極低，且在炎性反應(yīng)和藥物刺激時，人體正常細胞的DNA也會對ctDNA產(chǎn)生干擾。而且目前大多數(shù)ctDNA研究集中于具有相對高濃度ctDNA的晚期癌癥，缺乏早期癌癥和低濃度ctDNA的詳細經(jīng)驗。

ctDNA檢測會出現(xiàn)一定程度的假陰性和假陽性問題。主要原因是腫瘤的異質(zhì)性，原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、ctDNA三者之間存在差異。而且在腫瘤組織和ctDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)不一致，比如是否包含驅(qū)動基因，是否排除拷貝數(shù)變異（copy number variations,CNVs），這些原因?qū)е虏煌芯拷o出的一致性數(shù)據(jù)相差很多，而且樣本采集運輸、實驗過程規(guī)范與否、基因檢測不同儀器、生物信息分析軟件、生物學(xué)因素對腫瘤組織和ctDNA檢測都會產(chǎn)生影響。此外ctDNA在此階段依然不成熟，ctDNA檢測下限、不同突變類型的最佳檢測下限和不同用途對應(yīng)的處理過程等，這些因素都可能導(dǎo)致了一些檢測的差異存在。

此外，目前ctDNA尚處于小范圍測試，不同研究文獻得到的結(jié)果還存在些許差異，需要進行大量的實驗、詳細的數(shù)據(jù)分析，從而證明ctDNA作為腫瘤臨床生物標(biāo)志物的可靠性。而且ctDNA技術(shù)作為一項新興的無創(chuàng)檢測技術(shù)，臨床檢測費用昂貴，這也是制約該項技術(shù)大規(guī)模推廣的原因之一。

5 總結(jié)

ctDNA檢測具有便于動態(tài)監(jiān)測，能完整地反映腫瘤基因信息，克服單一病灶取樣的空間限制等優(yōu)勢，為不易做穿刺手術(shù)取樣的患者，提供了腫瘤基因檢測的途徑，也為術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)控提供了方便渠道。現(xiàn)階段需要完善ctDNA檢測的業(yè)界標(biāo)準(zhǔn)，細化取樣時間、取樣部位等操作細則，還需要研究生物學(xué)等因素對腫瘤釋放到血液中ctDNA含量的影響，以及標(biāo)準(zhǔn)化的實驗流程和對應(yīng)的生物信息分析流程等。