miR-497-5p靶向調(diào)控CCNE1基因抑制胰腺癌細(xì)胞增殖

姜達(dá)偉，許瀏，王偉林

0 引言

胰腺癌（Pancreatic cancer,PaCa）是惡性程度極高的實(shí)體腫瘤，以早期診斷困難、進(jìn)展迅速、易轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性為主要臨床特征[1]。雖然近年來PaCa的治療取得了較大進(jìn)步，包括手術(shù)切除、化療和放療，但PaCa患者術(shù)后5年總體生存率仍低于5%[2]。微小RNA（microRNA,miR）是一類長(zhǎng)度極短的非編碼RNA分子，通過直接結(jié)合靶基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region,3’-UTR）而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，表現(xiàn)為誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯[3]。有研究表明，miR在PaCa的發(fā)生和進(jìn)展中具有關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在血管肉瘤中表達(dá)下調(diào)，并且靶向調(diào)控KCa3.1離子通道抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[5]。骨肉瘤組織和細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)miR-497-5p表達(dá)下調(diào)，且過表達(dá)miR-497-5p靶向調(diào)控ADP-核糖基化因子樣蛋白2（ADP ribosylation factor-like protein 2,ARL2）抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[6]。此外，Chai等[7]發(fā)現(xiàn)miR-497-5p在黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-497-5p抑制A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡。目前，miR-497-5p在PaCa中的作用及其分子機(jī)制尚未明確。本研究擬對(duì)比進(jìn)行探討，為該腫瘤的治療提供新的見解及思路。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集2008年3月—2013年3月嘉興學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科通過手術(shù)或穿刺方式獲取的34例PaCa癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織（癌細(xì)胞邊緣≥3 cm），其中男22例，女12例，平均年齡51.72±5.96歲，29例導(dǎo)管腺癌，5例腺鱗癌?；颊咝g(shù)前均無放化療記錄。所有組織均由本院兩位病理學(xué)專家以雙盲方式進(jìn)行檢查核對(duì)，立即放置于液氮中進(jìn)行快速冷凍并儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。該研究已獲嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意書。術(shù)后隨訪時(shí)間為5年，生存期為手術(shù)至死亡時(shí)間或手術(shù)至最后記錄點(diǎn)時(shí)間。

1.2 儀器與試劑

Prism 7900HT/FAST型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（Beckman，美國(guó)），E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)（Invitrogen，美國(guó)），LSM710倒置光學(xué)顯微鏡（Zeiss,德國(guó)），熒光素酶測(cè)試儀（Invitrogen，美國(guó)）。反轉(zhuǎn)錄試劑（Qiagen，德國(guó)），熒光定量試劑盒（Takara，日本），細(xì)胞培養(yǎng)基、血清及l(fā)ipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（BD，美國(guó)），抗CCNE1抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)），miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對(duì)照（RiboBio，中國(guó)廣州），雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（Promega，美國(guó)），Capan-2和PANC-1細(xì)胞（ATCC，美國(guó)）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對(duì)照的序列分別是5’-CAGCAGCACACUGUGGUUUGUAAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3’和5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。將Capan-2和PANC-1細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞融合度約80%后更換無血清培養(yǎng)基。使用lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別加入100 pmol miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對(duì)照，培養(yǎng)6 h后更換含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的Capan-2和PANC-1細(xì)胞接種至96孔板中，37℃、5%CO2的條件下分別培養(yǎng)0、12、24、48及72 h，加入20 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。利用酶標(biāo)儀在450 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔光密度值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化

將轉(zhuǎn)染后的Capan-2和PANC-1細(xì)胞接種至6孔板中，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)至1×106個(gè)/毫升。取1 ml單細(xì)胞懸浮液放至75%乙醇中4℃固定過夜。冷PBS洗滌細(xì)胞三次，37℃恒溫水浴中用RNase A處理細(xì)胞30 min，并在4℃暗室中用碘化丙啶染色20 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各期細(xì)胞比例。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol試劑抽提細(xì)胞和組織的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-497-5p反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 60 min，95℃ 5 min及4℃ 30 min。miR-497-5p實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-497-5p正義引物：5’-CCTTCAGCAGCACACTGTGG-3’；反義引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；以U6為內(nèi)參，U6正義引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反義引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。CCNE1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s及4℃30 min。CCNE1實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：98℃ 20 min，98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。CCNE1正義引物：5’-GGAAGAGGAAGGCAAACGTG-3’；反義引物：5’-GCAATAATCCGAGGCTTGCA-3’；以GAPDH為內(nèi)參，正義引物：5’-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3’；反義引物：5’-ATGATGTTCTGGAGAGCCCC-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算PaCa細(xì)胞和組織中miR-497-5p和CCNE1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用MiRcode 11（http://www.mircode.org）分析miR-497-5p與CCNE1 3'-UTR之間的結(jié)合位點(diǎn)。將人CCNE1 mRNA 3’-UTR（包括miR-497-5p的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)）克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的螢火蟲基因的下游，構(gòu)建CCNE1-野生型（WT）報(bào)告質(zhì)粒。同時(shí)將突變的結(jié)合位點(diǎn)插入螢火蟲基因的下游產(chǎn)生CCNE1-突變體（MUT）報(bào)告質(zhì)粒。將Capan-2和PANC-1細(xì)胞接種至6孔板，共轉(zhuǎn)染0.5 μg CCNE1-WT或CCNE1-MUT報(bào)告質(zhì)粒和50 pmol miR-497-5p模擬物或模擬物陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

采用RIPA裂解液在4℃下提取總蛋白。通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠分離總蛋白，將蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜，37℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，膜與抗CCNE1抗體（1:500稀釋）4℃共孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶綴合（HRP）的二抗（1:2 000稀釋）37℃共孵育1 h。曝光膠片并檢測(cè)陽(yáng)性條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，計(jì)數(shù)資料以率的形式表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析miR-497-5p與CCNE1 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。卡方檢驗(yàn)分析miR-497-5p的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier生存分析法分析miR-497-5p的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，其余結(jié)果采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-497-5p在PaCa中的表達(dá)水平及臨床意義

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在癌組織中miR-497-5p表達(dá)顯著低于癌旁組織（P<0.001），見圖1A。T3+T4期患者癌組織中miR-497-5p的表達(dá)水平顯著低于T1+T2期患者（P<0.001），見圖1B。以miR-497-5p在癌組織表達(dá)水平的中位數(shù)（0.21）為臨界值，將34例PaCa患者劃分為低表達(dá)miR-497-5p組和高表達(dá)miR-497-5p組，每組17例。低表達(dá)miR-497-5p與較高的T分期相關(guān)（P=0.003），而與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、臨床分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及CA19-9水平無相關(guān)性，見表1。

2.2 miR-497-5p的表達(dá)與PaCa患者預(yù)后的關(guān)系

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析miR-497-5p在癌與癌旁正常組織(A)及不同T分期癌組織(B)中的表達(dá)Figure 1 miR-497-5p expression in cancer tissues,adjacent normal tissues(A) and different T stages cancer tissues(B)detected by real-time quantitative PCR

表1 miR-497-5p的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Relation between miR-497-5p expression and clinicopathological characteristics of pancreatic cancer(PaCa) patients

低表達(dá)miR-497-5p組與高表達(dá)miR-497-5p組的中位生存時(shí)間分別為31月和47月。低表達(dá)miR-497-5p組中15例患者死亡，2例患者存活，生存率為11.76%（2/17）；高表達(dá)miR-497-5p組中12例患者死亡，5例患者存活，生存率為29.41%（5/17）。低表達(dá)miR-497-5p組患者5年總體生存率顯著低于高表達(dá)miR-497-5p組患者（P=0.036），見圖2。

圖2 Kaplan-Meier法分析miR-497-5p的表達(dá)與PaCa患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Relation between miR-497-5p expression and prognosis of PaCa patients detected by Kaplan-Meier method

2.3 過表達(dá)miR-497-5p對(duì)PaCa細(xì)胞增殖的影響

與模擬物陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-497-5p模擬物可顯著提高Capan-2和PANC-1細(xì)胞中miR-497-5p的表達(dá)水平（均P<0.001），見圖3A。與模擬物陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，Capan-2和PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497-5p模擬物12、24、48及72 h后細(xì)胞的增殖能力顯著降低，見圖3B～C。與模擬物陰性對(duì)照相比，Capan-2和PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497-5p模擬物后G0/G1期比例增加，S期比例減少，見圖4。

圖3 miR-497-5p模擬物促進(jìn)miR-497-5p的表達(dá)(A)并抑制Capan-2(B)和PANC-1(C)細(xì)胞的增殖Figure 3 miR-497-5p mimics promoted miR-497-5p expression(A) and inhibited proliferation of Capan-2(B) and PANC-1(C) cells

2.4 miR-497-5p對(duì)靶基因CCNE1的直接調(diào)控作用

生物信息學(xué)分析顯示，CCNE1 mRNA 3'-UTR中5’-UGCUGCU-3’序列與miR-497-5p中3’-ACGACGA-5’序列互補(bǔ)結(jié)合，見圖5A。CCNE1 mRNA在PaCa癌組織的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.001），且癌組織中CCNE1 mRNA與miR-497-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P<0.001），見圖5B～C。與模擬物陰性對(duì)照相比，miR-497-5p模擬物顯著抑制CCNE1-WT報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Capan-2和PANC-1細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性（P<0.001），見圖6A～B。此外，與模擬物陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-497-5p模擬物后Capan-2和PANC-1細(xì)胞中CCNE1蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.001），見圖6C。

圖4 miR-497-5p模擬物對(duì)Capan-2(A)和PANC-1(B)細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effect of miR-497-5p mimics on cell cycle of Capan-2(A) and PANC-1(B) cells

圖5 生物信息學(xué)分析miR-497-5p對(duì)CCNE1的調(diào)控作用Figure 5 Effect of miR-497-5P on CCNE1 bioinformatics analysis

圖6 miR-497-5p對(duì)CCNE1基因的調(diào)控作用分析Figure 6 Analysis of the regulatory effect of miR-497-5p on CCNE1 gene

3 討論

研究表明，miR參與細(xì)胞多種病理與生理過程，包括增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移和內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)等[8]。miR異常表達(dá)與人類多種疾病的進(jìn)展相關(guān)，如腫瘤、不育癥、精神性疾病、代謝疾病及高血壓病等[9-10]。目前，研究者已通過高通量芯片在PaCa中篩選出大批差異表達(dá)的miR，部分miR作為致癌因子促進(jìn)PaCa生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，而另一部分miR作為腫瘤抑制因子降低PaCa生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[11-12]。例如，Lv等[13]報(bào)道m(xù)iR-661在PaCa中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，miR-661可能是PaCa預(yù)后相關(guān)的一種新的標(biāo)志物。Ta等[14]證實(shí)miR-1290在PaCa中發(fā)揮致癌因子作用，miR-1290可能是一種新的PaCa診斷和治療靶標(biāo)。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)miR-101在PaCa中表達(dá)下降，過表達(dá)miR-101可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲，而干擾miR-101可以降低增殖與侵襲。此外，miR-494通過抑制腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移與侵襲在PaCa中起腫瘤抑制因子的作用[16]。然而，目前仍有很大一部分miR在PaCa中的作用和機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究這部分miR將進(jìn)一步闡明PaCa發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并將為其治療提供新的靶點(diǎn)。

miR-497-5p定位于人染色體17p13.1區(qū)域，屬于miR-15/16/195/424/497超家族成員之一。據(jù)報(bào)道，miR-497-5p在血管肉瘤、結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要調(diào)控作用[17]。然而，miR-103在PaCa中的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在PaCa癌組織的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，這與miR-497-5p在其他腫瘤中的表達(dá)特征一致[17]，表明miR-497-5p在PaCa中表達(dá)下調(diào)。低表達(dá)miR-497-5p患者5年總體生存率顯著低于高表達(dá)miR-497-5p患者，提示低表達(dá)miR-497-5p與PaCa不良預(yù)后相關(guān)。T3+T4期癌組織中miR-497-5p的表達(dá)水平顯著低于T1+T2期癌組織，且低表達(dá)miR-497-5p與較高的T分期相關(guān)，提示miR-497-5p可能影響PaCa細(xì)胞增殖。PaCa進(jìn)展是腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的過程，也是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。本研究結(jié)果證實(shí)，過表達(dá)miR-497-5p能顯著抑制PaCa細(xì)胞增殖，該效應(yīng)主要通過增加細(xì)胞周期中G0/G1期比例，并降低S期比例而實(shí)現(xiàn)。該研究結(jié)果與miR-497-5p在其他腫瘤中的作用一致[5-7]，表明miR-497-5p具有一定的抗細(xì)胞增殖特性。

本研究發(fā)現(xiàn)，CCNE1 mRNA 3'-UTR可與miR-497-5p互補(bǔ)結(jié)合，提示CCNE1可能是miR-497-5p的靶基因。CCNE1屬于細(xì)胞周期蛋白基因家族，具有致癌因子作用，高表達(dá)CCNE1與卵巢癌、膀胱癌及乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)[18]。CCNE1可作為CDK激酶的調(diào)節(jié)劑，與CDK2的調(diào)節(jié)亞基形成復(fù)合物并磷酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因（RB）轉(zhuǎn)錄共抑制因子而促進(jìn)細(xì)胞增殖并加速G1/S轉(zhuǎn)換。CCNE1蛋白在G1/S轉(zhuǎn)換期積累，隨著細(xì)胞進(jìn)入S期而降解。目前，研究者已在多種腫瘤中觀察到CCNE1基因高表達(dá)，且過表達(dá)CCNE1導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定并促進(jìn)腫瘤發(fā)生[19]。然而，PaCa中miR-497-5p對(duì)CCNE1的調(diào)控作用仍不清楚。本研究還發(fā)現(xiàn)，CCNE1 mRNA在PaCa癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且與miR-497-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)miR-497-5p顯著抑制PaCa細(xì)胞中CCNE1的蛋白表達(dá)水平。此外，miR-497-5p中3’-ACGACGA-5’序列可直接與CCNE1 mRNA 3'-UTR中5’-UGCUGCU-3’序列互補(bǔ)結(jié)合而抑制CCNE1蛋白表達(dá)。該結(jié)果表明，CCNE1是miR-497-5p的靶基因，miR-497-5p通過下調(diào)CCNE1基因表達(dá)而抑制PaCa增殖。然而，值得注意的是，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-497-5p還可以調(diào)控其他靶基因，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SMAD3，ARL2和端粒酶亞單位（hTERT）等[9-11]。miR-497-5p是否也通過下調(diào)這些靶基因而抑制PaCa細(xì)胞的增殖有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-497-5p在PaCa中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)miR-497-5p與較高的T分期及不良預(yù)后相關(guān)。過表達(dá)miR-497-5p通過改變細(xì)胞周期而抑制PaCa細(xì)胞增殖。CCNE1是miR-497-5p的靶基因，miR-497-5p靶向調(diào)控CCNE1基因表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。miR-497-5p可能是一種新的PaCa治療靶標(biāo)。