m6A RNA甲基化在非小細胞肺癌中的研究進展

潘紅麗 李雪冰 陳琛 范亞光 周清華

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增長最迅速、對人類健康和生命活動造成最大威脅的惡性腫瘤。全球疾病負擔研究報告最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]表明僅2017年全球新增肺癌病例約220萬，肺癌死亡病例約190萬。中國國家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)[2]顯示2015年我國約有78萬例新發(fā)肺癌病例，死于肺癌者高達63萬人。按照組織類型分類，肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中85%的患者為非小細胞肺癌[3]。非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素和多基因參與的極其復雜的過程，所以深入研究非小細胞肺癌的致病機理成為亟待解決的問題。

近年的研究表明，m6A修飾在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用。m6A修飾是指RNA的腺嘌呤（A）第六號（6）氮原子上的單甲基化（m）修飾，簡稱m6A，通常發(fā)生在mRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、tRNA和rRNA等多種RNA中。研究[4]顯示，m6A修飾的位點具有高度保守性，傾向于出現(xiàn)在共有序列RRm6ACH（R=G/A,H=A/C/U）上，這些位點主要分布在RNA的3’UTR、終止密碼子或者長外顯子附近，對RNA前體的剪接、3’末端的處理、出核轉(zhuǎn)運、降解和翻譯等過程起著重要調(diào)控作用。本文總結(jié)了有關(guān)m6A修飾的研究成果，闡述了其相關(guān)蛋白的組成、作用方式、在非小細胞肺癌惡性進展中的生物學功能以及針對m6A修飾的靶向治療等方面的研究進展，為闡明非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展提供新思路，對指導非小細胞肺癌的診斷和治療提供新靶點。

1 m6A相關(guān)蛋白的組成及功能

m6A甲基化修飾最早在酵母tRNA中發(fā)現(xiàn)，tRNA發(fā)生m6A甲基化修飾后有助于維持其三葉草結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高翻譯效率[5]。隨后發(fā)現(xiàn)m6A甲基化在mRNA中是最豐富的修飾[6]，因此，越來越多的研究關(guān)注于mRNA的m6A甲基化修飾。m6A修飾是一種動態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式，受m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A writers）和去甲基化酶（m6A erasers）的共同調(diào)控，能夠被m6A識別蛋白（m6A readers）選擇性的識別結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達。

1.1 m6A writers m6A writers，是指m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，能夠催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移至腺嘌呤第6位氮原子上。m6A writers包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429（VIRMA）、RBM15、HAKAI、ZC3H13（KIAA0853）和METTL16等。Knuckles等[7]在小鼠胚胎干細胞中過表達了METTL3，期望通過TAP-LC-MS技術(shù)篩選鑒定與METTL3相互作用的蛋白。結(jié)果表明：在高鹽條件（500 mmol/L）下洗脫獲得METTL3/METTL14復合物，命名為m6A-METTL復合物；在低鹽條件（350 mmol/L）下洗脫得到WTAP/KIAA1429/RBM15/ZC3H13/HAKAI復合物，命名為m6A-METTL相關(guān)蛋白復合物。

1.1.1 m6A-METTL復合物 m6A-METTL復合物主要包括METTL3和METTL14蛋白。METTL3是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物成分之一[8]，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。早期通過結(jié)構(gòu)預測和DNA進化分析推測METTL3的功能與甲基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)[9]；后期研究[10]發(fā)現(xiàn)METTL3能夠和同源蛋白METTL14形成異源二聚體復合物，而METTL14雖能與RNA結(jié)合，但不具備催化活性；最終確定METTL3/METTL14復合物共同催化靶RNA的m6A修飾。

1.1.2 m6A-METTL相關(guān)蛋白復合物 m6A-METTL相關(guān)蛋白復合物主要是由接頭蛋白WTAP、KIAA1429、RBM15、ZC3H13和HAKAI相互結(jié)合而形成的復合物。RNA剪接因子WTAP同樣不具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性，而是作為接頭蛋白招募m6A-METTL復合物定位到核散斑上，從而影響m6A修飾的定位[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429能夠直接與WTAP結(jié)合，引導METTL3/METTL14/WTAP復合物結(jié)合于靶RNA的3’UTR和終止密碼子附近，發(fā)生位點選擇性甲基化[12]。因此，在細胞內(nèi)敲低KIAA1429的表達后，m6A甲基化水平會明顯下降[13]。后續(xù)研究[12,14]證實，接頭蛋白RBM15、HAKAI、ZC3H13等能夠與WTAP結(jié)合，決定METTL3/METTL14/WTAP復合物的正確定位。

1.1.3 METTL16 METTL16是另一具有催化活性的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，與METTL3同源，可以結(jié)合于U6 snRNA，導致U6第43位的腺嘌呤發(fā)生m6A甲基化修飾，從而影響U6 snRNP對mRNA前體的剪接[15]。METTL16也可以直接與mRNA前體結(jié)合，例如，與SAM合成酶MAT2A 3’UTR的一個保守發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合，在SAM充足或缺乏的情況下，由于停滯時間的差異，導致MAT2A的可變剪接，從而調(diào)控細胞內(nèi)SAM含量的穩(wěn)態(tài)[16]。

早期從Hela細胞中分離出的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物主要包括3個組分，分子量大小分別為30 kDa、200 kDa和875 kDa[8]。m6A-METTL復合物屬于200 kDa組分，但是METTL3/METTL14異源二聚體復合物分子量大小約為120 kDa，遠低于200 kDa。m6A-METTL相關(guān)蛋白復合物屬于875 kDa組分，但是WTAP/KIAA1429/RBM15/ZC3H13/HAKAI復合物分子量大小約為600 kDa，遠遠低于875 kDa。表明仍然有未知的蛋白作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的成員，參與m6A甲基化修飾過程，需要進一步深入探討。

1.2 m6A erasers m6A erasers，即m6A去甲基化酶，能夠“擦除”靶RNA的m6A甲基化修飾。目前僅發(fā)現(xiàn)了兩種m6A去甲基化酶，包括脂肪質(zhì)量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesityassociated protein,FTO）和alkB同源蛋白5（alkB homolog 5,ALKBH5）。

1.2.1 FTO FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，在細胞內(nèi)敲低FTO的表達能夠增加mRNA的m6A水平，相反，當過表達FTO時，胞內(nèi)mRNA的m6A水平受到抑制。FTO定位于核散斑，這與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物定位相同[17]。m6A去甲基化酶FTO的發(fā)現(xiàn)，明確了m6A修飾是一種動態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式。

然而，F(xiàn)TO作為m6A去甲基化酶還存在一些爭議：2011年，Jia等[17]研究發(fā)現(xiàn)FTO的作用底物是m6A修飾；2017年，Mauer等[18]的研究否認FTO的底物是m6A修飾，指出FTO的底物是m6Am修飾，從而影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。在隨后的研究中，Su等[19]分析了FTO催化m6A和m6Am修飾的偏好性，發(fā)現(xiàn)FTO的偏好性受FTO蛋白定位的影響，在細胞核中FTO催化m6A的去甲基化，而在細胞質(zhì)中的FTO可以同時介導m6A和m6Am的去甲基化。相比m6A修飾，m6Am修飾的RNA更加穩(wěn)定，在細胞內(nèi)敲低FTO后不影響m6Am修飾的RNA的表達，這一發(fā)現(xiàn)說明FTO主要通過介導m6A修飾的RNA的表達發(fā)揮作用。

1.2.2 ALKBH5 ALKBH5是第二個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，屬于Fe2+和α-酮戊二酸依賴的非血紅素加氧酶，能夠把m6A甲基化位點的N-甲基氧化成羥甲基，從而“擦除”mRNA的m6A甲基化。ALKBH5主要定位在核散斑，依賴其去甲基化酶活性影響mRNA的出核轉(zhuǎn)運[20]。

目前發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5均屬于AlkB家族，但是二者對m6A修飾的擦除作用是相互獨立的，互不影響的。FTO和ALKBH5主要定位在細胞核，在細胞質(zhì)中表達較低，所以細胞質(zhì)中mRNA的m6A修飾是如何被調(diào)控的，是否存在定位于細胞質(zhì)中的m6A去甲基化酶，仍需更多研究探索分析。

1.3 m6A readers m6A readers，即m6A識別蛋白，能夠選擇性識別靶RNA的m6A甲基化修飾，進而參與RNA代謝的各個階段。

1.3.1 YTH家族蛋白 目前m6A甲基識別蛋白功能研究比較明確的是YTH結(jié)構(gòu)域家族成員，包括定位于細胞質(zhì)的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2和定位于細胞核的YTHDC1，均能通過YTH結(jié)構(gòu)域選擇性識別并結(jié)合m6A修飾位點。YTHDF1與m6A修飾位點結(jié)合后，招募轉(zhuǎn)錄起始因子EIF3A及其復合物，促進翻譯的起始和多聚核糖體的形成，提高翻譯效率[21]；YTHDF2是最早被鑒定的m6A識別蛋白之一，識別m6A甲基化位點后，進而招募CCR4-NOT脫腺苷酸酶復合體或HRSP12/RNase P/MRP復合物，加速RNA的脫腺苷酸化和切割[4,22-24]。YTHDF3可與YTHDF1協(xié)同作用促進m6A修飾的mRNA翻譯，而YTHDF3與YTHDF2的協(xié)同作用會導致m6A修飾的靶RNA發(fā)生降解[25]。YTHDC1與m6A修飾位點結(jié)合后，能夠通過與剪接因子SRSF3和SRSF10的競爭性結(jié)合，介導RNA前體的可變剪接及RNA的出核過程[26,27]；而YTHDC2能夠提高靶基因的翻譯效率和介導RNA的降解[28,29]。

1.3.2 hnRNPs超家族蛋白 與m6A修飾相關(guān)的hnRNPs超家族蛋白包括HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG。RNA結(jié)合蛋白HNRNPA2B1可以與核內(nèi)m6A修飾的RNA結(jié)合，介導基因的可變剪接。同時，HNRNPA2B1也能夠與miRNA初級轉(zhuǎn)錄本的m6A位點結(jié)合，從而招募miRNA微處理復合物蛋白DGCR8，促進miRNA初級轉(zhuǎn)錄本進一步的剪接加工[30]。隨后的研究[31]發(fā)現(xiàn)，RNA發(fā)生m6A甲基化修飾后可以引起二級結(jié)構(gòu)的改變，部分m6A識別蛋白并非直接識別并結(jié)合m6A甲基化位點，而是識別構(gòu)象發(fā)生改變的RNA結(jié)構(gòu)，進而調(diào)控基因的表達，這一現(xiàn)象被稱為m6A開關(guān)（m6A-switch）。通過晶體結(jié)構(gòu)分析和生物信息學預測證實HNRNPA2B1并不含有與m6A甲基化位點結(jié)合的疏水口袋，可能是采用m6A開關(guān)機制識別m6A修飾位點[32]。核糖核蛋白HNRNPC/G對m6A修飾的識別結(jié)合也是間接性的，通過m6A開關(guān)機制參與靶mRNA的加工及成熟[31,33]。

1.3.3 其他 真核起始因子EIF3A能夠直接和mRNA 5’UTR的m6A修飾位點結(jié)合，招募43S核糖體復合物，起始帽子結(jié)構(gòu)非依賴型的蛋白翻譯[34]。IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3識別結(jié)合m6A修飾位點后，增加靶mRNA的穩(wěn)定性，促進其翻譯[35]。

總體來說，m6A識別蛋白在RNA代謝的各個階段均發(fā)揮了重要作用。

2 m6A修飾與肺癌

目前，m6A修飾在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究是腫瘤生物學研究的熱點之一。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，m6A修飾發(fā)揮著舉足輕重的作用。m6A相關(guān)蛋白表達的異常，能夠?qū)е路切〖毎伟┑膼盒栽鲋?、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等。因此，研究m6A修飾在非小細胞肺癌中的生物學功能，鑒定m6A修飾的關(guān)鍵因子改變，對闡明非小細胞肺癌發(fā)病機制具有重要意義，可以為指導肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

2.1 m6A修飾與肺癌惡性增殖 肺癌是一種由肺上皮細胞惡性增殖而形成的腫瘤。腫瘤細胞的惡性增殖與細胞的過度分裂、周期紊亂和凋亡調(diào)控失常等相關(guān)。

研究[36]表明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3處于甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的核心位置，METTL3純合敲除小鼠是早期胚胎致死的，METTL3條件性敲除鼠表現(xiàn)為體重輕、體積小和發(fā)育遲緩等特點，說明METTL3在早期胚胎發(fā)育和生存中發(fā)揮重要作用。METTL3在肝癌、宮頸癌、乳腺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達均上調(diào)，導致SOCS2[37]、HBXIP[38]和SNAI1[39]等mRNA發(fā)生甲基化，從而調(diào)控腫瘤的惡性進展。在非小細胞肺癌臨床樣本中，METTL3的表達是明顯上調(diào)的，并且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。METTL3能夠催化Hippo信號通路的核效應因子YAP發(fā)生m6A甲基化修飾，促使其翻譯，介導非小細胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[40]。此外，METTL3的第177、211、212和215位賴氨酸殘基可以發(fā)生SUMO化修飾，顯著抑制m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，導致細胞整體基因表達譜的改變，促進非小細胞肺癌的增殖和惡性轉(zhuǎn)化[41]。也有報道[42,43]指出，METTL3可以不依賴甲基化酶活性而發(fā)揮作用，即直接與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和Hippo信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TAZ的m6A甲基化位點結(jié)合后，招募真核翻譯起始因子EIF3H，介導癌蛋白EGFR和TAZ翻譯的起始與多聚核糖體的形成，促進肺腺癌細胞的惡性增殖、遷移和侵襲。此外，還有研究[44,45]表明，miR-33a和miR-600可以靶向METTL3而抑制非小細胞肺癌的惡性增殖。

m6A識別蛋白YTHDF1在非小細胞肺癌臨床樣本和細胞株中均高表達。在非小細胞肺癌細胞株中敲低YTHDF1的表達，導致肺癌細胞G0期/G1期阻滯，細胞周期蛋白CDK2、CDK4和cyclin D1的翻譯效率大大降低，顯著抑制肺癌細胞的惡性增殖[46]。Sheng等[47]研究表明YTHDF2在非小細胞肺癌組織中表達上調(diào)，通過識別結(jié)合磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶6-PGD 3’UTR的甲基化位點，促進其翻譯，加速葡萄糖通過磷酸戊糖途徑代謝，為非小細胞肺癌的惡性增殖提供原料。

m6A去甲基化酶FTO的表達在非小細胞肺癌組織和細胞系中均上調(diào)，它能夠“擦除”去泛素化酶USP7 mRNA的m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，促進肺癌細胞的惡性增殖[48]。而m6A去甲基化酶ALKBH5則可以靶向組織金屬蛋白酶抑制因子（metallopeptidase inhibitor 3,TIMP3），降低TIMP3 mRNA的穩(wěn)定性，通過抑制凋亡而促進非小細胞肺癌的增殖[49]。USP7 mRNA的m6A甲基化修飾被FTO“擦除”后穩(wěn)定性增加，然而TIMP3 mRNA的m6A修飾被“擦除”后穩(wěn)定性降低，我們推測不同基因m6A修飾發(fā)生變化后，導致轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式差異的原因是被不同的m6A識別蛋白所選擇性識別，從而導致作用方式不同。m6A識別蛋白如何選擇性識別，具體的分子機制仍需研究者們進一步探索。

2.2 m6A修飾與肺癌遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移 肺癌發(fā)展到晚期較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這也是導致肺癌死亡率居高不下的重要因素之一，所以m6A修飾與肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系需要研究者們深入探討。

在肺腺癌細胞中METTL3依賴m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，導致JUNB mRNA發(fā)生m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，從而作為轉(zhuǎn)錄因子入核開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）誘導的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發(fā)生，促進肺腺癌細胞的遷移和侵襲[50]。在肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中，METTL3被報道可以誘導miR-143-3p初級轉(zhuǎn)錄本發(fā)生m6A修飾，加速miR-143-3p的加工成熟，通過靶向血管生成抑制因子VASH1，解除對血管內(nèi)皮生長因子VEGFA的抑制作用，誘發(fā)新生血管的形成，促進肺癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移[51]。

Liu等[52]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中，高表達的m6A去甲基化酶FTO通過“擦除”癌基因MZF1 mRNA的m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，促進肺鱗癌細胞的惡性增殖、遷移和侵襲。另一m6A去甲基化酶ALKBH5在間歇性缺氧處理后的肺腺癌細胞中表達明顯上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過“擦除”癌基因FOXM1mRNA的m6A修飾，促進FOXM1的表達，從而參與肺癌細胞的增殖和侵襲[53]。近期的一項研究結(jié)果[54]表明m6A去甲基化酶ALKBH5在非小細胞肺癌中表達明顯下調(diào)，且其低表達與整體生存期呈負相關(guān)；在肺癌細胞中過表達ALKBH5能夠明顯抑制細胞增殖和遷移，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果截然相反，推測與細胞培養(yǎng)方式或處理方式的不同相關(guān)，具體機制仍需進一步探討。因此，m6A修飾在腫瘤生物學中的調(diào)控功能需要更深入、更詳細、更全面的研究和探討。

2.3 m6A修飾與肺癌耐藥性 耐藥是導致腫瘤治療失敗的關(guān)鍵因素。研究表明，多藥聯(lián)合可以緩解腫瘤耐藥。因此，深入研究耐藥的分子機制，可以為指導正確的聯(lián)合用藥和克服耐藥提供理論依據(jù)。m6A修飾相關(guān)蛋白在肺癌耐藥中也發(fā)揮重要的作用。

Shi等[46]研究發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌中高表達的YTHDF1能夠更好地識別m6A修飾的KEAP1 mRNA，促進KEAP1蛋白的表達，導致下游細胞氧化應激反應中的關(guān)鍵因子核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2,NRF2）迅速降解，介導耐藥基因AKR1C1表達的沉默，從而增加了化療敏感性。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的敲低，也能夠提高肺腺癌細胞A549對抗癌藥物JQ1的敏感性[42]，但是具體機制仍未見報道。

近期Meng等[55]深刻剖析了非小細胞肺癌中m6A修飾與阿法替尼耐藥性的關(guān)系：他們以阿法替尼敏感細胞株為對照，發(fā)現(xiàn)在阿法替尼耐藥細胞株中有更多的基因發(fā)生m6A修飾，從而導致整體基因表達譜發(fā)生了改變；通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因主要富集在細胞周期，推測m6A修飾的基因擾亂了正常的細胞周期，從而導致非小細胞肺癌產(chǎn)生阿法替尼耐藥性。

2.4 m6A修飾與肺癌診斷及預后 越來越多的研究[56,57]表明，m6A修飾可以作為診斷、藥物治療和預后判斷的潛在分子標志物。研究人員利用LC-ESI-MS/MS方法檢測肺癌單個循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell,CTC）細胞或CTC細胞簇的m6A修飾情況時發(fā)現(xiàn)，CTC細胞中的整體m6A修飾水平是增加的，這表明從CTC細胞檢測m6A修飾也許可以成為肺癌的無創(chuàng)診斷方法。未來研究方向會更加關(guān)注肺癌早期階段m6A甲基化修飾或m6A修飾相關(guān)蛋白的表達情況，從而明確m6A修飾檢測能否作為早期診斷指標。Zhang[58]的團隊對TCGA數(shù)據(jù)庫509例肺腺癌患者標本的m6A相關(guān)蛋白的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF1、YTHDF2和METTL3的表達均明顯上調(diào)，并且其高表達與總體生存率和無復發(fā)生存率呈正相關(guān)，他們推測這是通過提高化療敏感性進而延長了患者的生存期。Liu等[59]對13個m6A相關(guān)蛋白的基因表達進行一致性聚類分析，把肺腺癌患者分為了兩組，這兩組患者在年齡、種族、腫瘤大小、分期、遠端轉(zhuǎn)移方面均有明顯差異。通過表達譜分析表明，m6A相關(guān)基因的表達可以作為肺腺癌晚期患者預后的評判標準。

3 針對m6A修飾的靶向治療進展

表觀遺傳學在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及診斷治療中具有重要的作用，多個靶向DNA甲基化酶或組蛋白修飾酶的新藥已獲批用于惡性腫瘤的治療。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Azacitidine和Decitabine已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準，應用于骨髓增生異常綜合征的臨床治療[60,61]。組蛋白去乙?；敢种苿〤hidamide已獲中國食品藥品監(jiān)督管理局（China Food and Drug Administration,CFDA）批準用于外周T淋巴細胞瘤的治療[62]，目前Chidamide針對非小細胞肺癌的臨床實驗已進入III期階段。近幾年，以m6A修飾為核心內(nèi)容的靶向治療已經(jīng)成為藥物新靶標的研究熱點。主要包括：FTO抑制劑、METTL3-14/WTAP激活劑和聯(lián)合用藥。

3.1 FTO抑制劑 m6A去甲基化酶FTO是白血病、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的癌基因之一，在多種腫瘤中普遍高表達，且與預后呈負相關(guān)。因此，研究者們致力于篩選或合成FTO抑制劑，為后續(xù)抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定了基礎。

最早發(fā)現(xiàn)的FTO抑制劑是大黃酸，大黃酸是一種天然產(chǎn)物，可以與RNA競爭結(jié)合FTO活性位點，從而擾亂了FTO對已發(fā)生m6A修飾的RNA的去甲基化作用，同時大黃酸也可以抑制去甲基化酶ALKBH2的活性，說明大黃酸并非是特異性靶向FTO的抑制劑[63]。研究[64]表明用大黃酸處理非小細胞肺癌細胞系PC-9、H460和A549后，能夠明顯抑制細胞的活性及克隆形成能力，導致凋亡的發(fā)生和細胞周期的停滯。小鼠皮下荷瘤實驗證實大黃酸能夠以時間和劑量依賴的方式抑制肺癌的惡性增殖。之前的研究[65]表明大黃酸對小細胞肺癌細胞系GLC4的增殖也有一定的抑制作用，可以誘導細胞發(fā)生凋亡。但是由于大黃酸水溶性較差，因此其抗腫瘤效率受到了明顯的限制。

隨后，研究學者通過高通量熒光偏振檢測法篩選抑制FTO或ALKBH5活性的藥物，發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥MA能夠高效的特異性抑制FTO的去甲基化酶活性，并且以濃度依賴方式上調(diào)細胞內(nèi)整體m6A修飾水平，而對ALKBH5的表達及活性并未產(chǎn)生影響[66]。Demertzi等[67]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌細胞株A549對MA的敏感性較低，半數(shù)抑制率（50% inhibitory concentration,IC50）為139 μmol/L，一些MA金屬配合物對A549細胞的IC50值范圍可降至25 μmol/L-40 μmol/L，但是在生物系統(tǒng)的使用濃度仍然過高，所以進一步對MA進行改造，研究發(fā)現(xiàn)MA有機錫配合物大大提升了對A549細胞的抗增殖活性，IC50值僅為0.43 μmol/L，顯著增加了肺腺癌細胞株A549對MA有機錫配合物的敏感性[68]。MA配合物是否通過抑制FTO活性來發(fā)揮作用，MA配合物對肺鱗癌和大細胞癌的抗癌活性如何呢，有待進一步探討。

研究者們?yōu)榱双@得特異性和靶向性更強的FTO抑制劑，針對晶體結(jié)構(gòu)進行化合物設計和合成優(yōu)化，最終篩選到小分子化合物FB23及其羧酸衍生物FB23-2能夠特異性靶向FTO。研究[69]發(fā)現(xiàn)在急性髓系白血病中，羧酸衍生物FB23-2抗增殖活性要優(yōu)于FB23，能夠特異性抑制FTO去甲基化酶活性，顯著抑制細胞增殖，促進細胞分化成熟，在一定程度上阻遏了急性髓系白血病的發(fā)展。FTO抑制劑FB23及其羧酸衍生物FB23-2在非小細胞肺癌中能否特異性靶向FTO，能否有效抑制肺癌的惡性進展，尚需更多的研究進行驗證。

3.2 METTL3-14/WTAP激活劑 普遍認為m6A修飾的升高可以抑制癌癥的惡性進展。前期大量研究聚焦于FTO抑制劑的開發(fā)，然而，亦可以通過激活METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶的活性來提高m6A水平。Selberg等[70]基于METTL3/METTL14復合物晶體結(jié)構(gòu)進行了虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)4個小分子化合物能夠與METTL3/METTL14復合物結(jié)合并激活甲基轉(zhuǎn)移酶活性，這些小分子化合物能夠在細胞水平發(fā)揮作用，導致mRNA和rRNA的整體m6A水平升高。但是，當使用高濃度（10 μmol/L）小分子化合物處理細胞時，胞內(nèi)整體m6A修飾水平反而降低，我們推測這是細胞為了維持穩(wěn)態(tài)而進行的負反饋調(diào)節(jié)。在非小細胞肺癌細胞株中METTL3普遍高表達，能夠促進非小細胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[42,43]。隨后Liu等[59]分析了大量的肺腺癌和肺鱗癌臨床樣本中m6A相關(guān)基因的表達情況，結(jié)果表明在肺腺癌和肺鱗癌中METTL3的表達顯著上調(diào)，并且高表達METTL3的非小細胞肺癌患者表現(xiàn)出較好的預后[58,59,71]。綜合臨床數(shù)據(jù)來看，METTL3在非小細胞肺癌中的高表達能夠延長患者的生存期。因此，METTL3-14/WTAP激活劑對非小細胞肺癌的治療有著充分的理論可行性，相信后續(xù)的生物活性實驗及臨床實驗會進一步開展起來。

3.3 聯(lián)合用藥 研究[72]表明表觀遺傳修飾的異常能夠?qū)е履[瘤對化療藥物的耐受性，所以靶向表觀遺傳的療法對逆轉(zhuǎn)耐藥提供了可能。Pemetrexed作為晚期非小細胞肺癌的臨床藥物被廣泛使用，但是單藥的使用對改善患者的總體生存率具有一定的局限性[73]，所以開展了多項針對Pemetrexed的聯(lián)合用藥研究，Bu等[74]研究發(fā)現(xiàn)FTO抑制劑大黃酸和Pemetrexed聯(lián)合處理肺腺癌細胞系A549時，IC50由2.05 μmol/L降低為0.62 μmol/L，抗腫瘤活性得到明顯的提升。Duffy等[75]研究發(fā)現(xiàn)用阿霉素單藥處理肺腺癌細胞株A549時，細胞存活率為65%，而FTO特異性抑制劑MA與阿霉素聯(lián)用時的細胞存活率僅為16%，這一現(xiàn)象說明MA顯著增加了肺腺癌細胞對阿霉素的敏感性。

目前，免疫檢驗點阻斷療法在抗腫瘤方面取得了較好的成效，已有多個藥物獲得美國FDA批準應用于肺癌的臨床治療，如Nivolumab、Pembrolizumab和Atezolizumab等。然而，免疫檢驗點阻斷療法僅對部分肺癌患者有效，并且容易產(chǎn)生耐藥性。因此，需要多藥聯(lián)合治療來擴大應用人群或者克服耐藥。近期，Yang等[76]研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細胞中敲低FTO的表達可以增加癌細胞對γ干擾素和抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）免疫療法的敏感性。Han等[77]研究發(fā)現(xiàn)在YTHDF1敲除鼠中皮下注射黑色素瘤細胞，同時聯(lián)合程序性細胞死亡配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）免疫檢驗點阻斷療法，獲得了較好的治療效果。表明m6A相關(guān)蛋白在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要的作用。Xu等[78]分析了肺鱗癌患者中的免疫細胞類型及m6A相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果顯示濾泡輔助性T細胞的免疫特征可以作為判斷肺鱗癌總體生存期的獨立預后因素，并且ALKBH5、METTL3、HNRNPC和KIAA1429的低表達能夠增加免疫治療的敏感性。因此，我們有理由相信m6A相關(guān)蛋白的抑制劑或激活劑與免疫治療聯(lián)合用藥在非小細胞肺癌治療中能夠提高抗腫瘤效率。

m6A相關(guān)蛋白的抑制劑或激活劑的開發(fā)尚處于起步階段，現(xiàn)有在研的m6A相關(guān)蛋白抑制劑或激活劑普遍存在活性低、特異性差、在細胞內(nèi)影響的表型過于復雜以及其確切的作用機制難以闡明等問題。因此，m6A相關(guān)蛋白抑制劑或激活劑主要用于臨床前實驗研究，對癌癥患者的治療效果尚未見報道。隨著藥物合成與篩選技術(shù)的發(fā)展、藥物改良工藝的進步和多藥聯(lián)合應用的探索，相信未來針對m6A修飾的靶向藥物一定能夠廣泛應用于臨床抗腫瘤治療。

4 小結(jié)與展望

已有研究表明[79]，m6A修飾的改變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要功能。m6A修飾相關(guān)蛋白通過調(diào)控一系列重要基因的剪接、出核、降解和翻譯等，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著m6A修飾相關(guān)蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究集中在m6A修飾的潛在機制，從而推動了腫瘤生物學中m6A修飾相關(guān)信號通路的研究。

當然，關(guān)于m6A修飾仍有許多未解的謎題：①在生命活動中是否仍存在未知的m6A修飾相關(guān)蛋白，它們以何種方式參與m6A修飾的調(diào)控；②迄今為止，已鑒定的m6A相關(guān)蛋白中m6A識別蛋白種類是最多的，每種m6A識別蛋白發(fā)揮的功能也是不同的，它們是如何選擇性識別并結(jié)合靶RNA的，它們之間是相互競爭的，還是相互協(xié)同的；③m6A相關(guān)蛋白中有些蛋白具有雙重身份，同時具備促癌和抑癌的雙重作用，它是以何身份來調(diào)控腫瘤的進程，又是以何種作用方式來發(fā)揮功能；④目前，已篩選到多種FTO抑制劑及METTL3/METTL14激活劑，研究發(fā)現(xiàn)能夠明顯抑制腫瘤細胞增殖或逆轉(zhuǎn)耐藥，但是對癌癥患者的治療效果仍未見報道，所以我們期待更多的臨床研究來驗證m6A相關(guān)蛋白是否可以作為惡性腫瘤治療的新靶點。