大腸癌基因治療的研究進(jìn)展*

王 丹，周燕紅，彭 莉

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院)

在世界范圍內(nèi)，大腸癌(CRC)發(fā)病率排第三位，癌癥相關(guān)死亡率排第四[1]。隨著環(huán)境改變，由于食用紅色和加工肉類、飲酒和吸煙，以及久坐不動的生活方式，患CRC的風(fēng)險正在增加。根據(jù)其發(fā)病率，病理表現(xiàn)為三種形式：家族性、遺傳性和散發(fā)性。70%～80%的CRC是散發(fā)性的，而約20%～30%的CRC有遺傳成分。事實(shí)上，盡管診斷和治療方式有所改進(jìn)，但每年仍有100多萬人患CRC，每年有60多萬名患者死于這種疾病。此外，手術(shù)切除CRC并不總是能防止晚期CRC的復(fù)發(fā)，25%的CRC患者在初診時就有肝轉(zhuǎn)移。因此，CRC患者在手術(shù)治療后5年內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其生存率仍然很低[2]。

基因治療是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)、制藥和生物技術(shù)領(lǐng)域一種新興的研究策略，它在三十年前還是一個令人難以置信的奇跡。基因，即我們的命運(yùn)決定因素，是遺傳的功能單位，基因序列中的任何突變都是導(dǎo)致疾病的原因?；蛑委熅褪怯靡环N新的健康的、有功能的基因來替代導(dǎo)致疾病的缺陷基因。在全球范圍內(nèi)，從臨床前階段到第三階段及以后發(fā)展中的基因療法產(chǎn)品有418種。進(jìn)行基因治療臨床試驗(yàn)的國家在5大洲的36個國家開展。其中4%的試驗(yàn)同時在一個以上的國家進(jìn)行。

癌癥是最常見的基因治療指征(64.41%)，包括不同類型的癌癥：婦科、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、血液學(xué)和肉瘤等。因此，利用基因療法將遺傳物質(zhì)輸送到癌細(xì)胞似乎是一個很好的選擇[3]。本文從CRC基因治療的研究發(fā)展、基因治療存在問題和未來發(fā)展等進(jìn)行簡要綜述。

1 CRC基因治療的研究

1.1 自殺基因治療

自殺基因治療(suicide gene)又稱基因介導(dǎo)的酶前體藥物治療(gene directed enzyme prodrugtherapy，GDEPT)，其基礎(chǔ)是在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入編碼一種非哺乳動物酶的外源基因，將無毒的前藥選擇性地轉(zhuǎn)化為有毒的代謝物。它是一種在對正常組織影響最小的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合使用被動、主動和轉(zhuǎn)錄靶向策略，在腫瘤部位誘導(dǎo)抗癌活性的一種方法。這種方法優(yōu)于傳統(tǒng)的癌癥治療方法，如化療和放射治療。自殺基因治療的成功依賴于它的三個主要功能成分：酶、前體藥和基因遞送系統(tǒng)(載體)。在過去幾年中，許多酶/前藥系統(tǒng)已被探索，其中研究最廣泛的是單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)與更昔洛韋(GCV)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)與5-氟胞嘧啶(5-FC)。

1.1.1 單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)治療

HSV-TK與GCV是目前研究最廣泛的酶/前藥系統(tǒng)。更昔洛韋(GCV)在HSV-TK的作用下進(jìn)行單磷酸化，之后在內(nèi)源性激酶的幫助下產(chǎn)生三磷酸形式的GCV，GCV-三磷酸可以通過在DNA中引入鏈終止和單鏈斷裂來導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。Wu等[5]分析表明，GCV-三磷酸的旁路效應(yīng)可以通過連接蛋白32(Cx32)的表達(dá)而增強(qiáng)，連接蛋白32負(fù)責(zé)產(chǎn)生縫隙連接。為了提高TK/GCV系統(tǒng)的效率，TK/GCV系統(tǒng)也已與其他治療方案聯(lián)合使用，以提高其抗癌效果。Higashi等[6]構(gòu)建了含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列的載體，該序列結(jié)合了IL-18和HSV-tk基因，用于治療小鼠結(jié)腸癌模型，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，攜帶HSV-tk基因的IL-18可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，其治療效果優(yōu)于單基因。

1.1.2 胞嘧啶脫氨酶基因(CD/5-FC)治療

CD/5-FC是近十年來研究最多的分子化療體系之一。雖然5-FU已被用于癌癥化療，但在其治療劑量下，它會引起嚴(yán)重的副作用，如黏膜炎、骨髓抑制、皮炎和心臟毒性。由于這些副作用，在過去的幾十年里，它作為前藥以5-FC的形式和與細(xì)胞脫氨酶結(jié)合的應(yīng)用得到了發(fā)展。兩種形式的胞嘧啶脫氨酶，細(xì)菌(BCD)和酵母(YCD)，已經(jīng)在CRC癥治療的背景下進(jìn)行了研究。經(jīng)CD激活后，5-FU可被其他細(xì)胞酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為有效的嘧啶類抗代謝產(chǎn)物。5-FU可抑制胸苷酸合成酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡。

CD/5-FC系統(tǒng)已被廣泛用于治療不同類型的癌癥，包括CRC、乳腺癌、頭頸部實(shí)體瘤。前藥形式5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)與細(xì)菌酶胞嘧啶脫氨酶(CD)聯(lián)合應(yīng)用于自殺基因治療顯示出較好的治療效果。雙自殺基因聯(lián)合HSV-TK/GCV和CD/5-FC可打破對腫瘤細(xì)胞類型的依賴，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)[7]。雖然CD/5-FC系統(tǒng)的使用如上所述有幾個優(yōu)點(diǎn)，但也有一些缺點(diǎn)需要解決，例如由于腸道中存在正常的菌群，能夠?qū)?-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，從而導(dǎo)致副作用。

盡管自殺基因是一種具有良好應(yīng)用前景的腫瘤治療方法，但目前的研究仍處于探索階段。隨著自殺基因研究的不斷深入，如何提高腫瘤組織特異性調(diào)控因子的啟動子或增強(qiáng)子來驅(qū)動自殺基因在特定靶細(xì)胞中的表達(dá)？特異性殺傷的產(chǎn)生已成為自殺基因系統(tǒng)靶向調(diào)控的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

1.2 細(xì)胞因子基因治療

細(xì)胞因子基因治療是將細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞之后，使之轉(zhuǎn)移到體內(nèi)或直接將細(xì)胞因子引入腫瘤微環(huán)境，產(chǎn)生細(xì)胞因子，激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，在局部或遠(yuǎn)距離發(fā)揮增強(qiáng)或抑制抗腫瘤免疫的作用。在腫瘤的診斷和治療中，抵制腫瘤生長的細(xì)胞因子可以通過不同的作用機(jī)理達(dá)到阻礙腫瘤進(jìn)展的結(jié)果。一種類型是刺激功能性免疫細(xì)胞的表達(dá)或分化并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，例如白介素-2(interleukin-2，IL-2)。另一種是直接殺死腫瘤細(xì)胞，例如粒酶B(granzyme B，GrB)。源于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的復(fù)雜性以及細(xì)胞因子性能的復(fù)雜性，某些細(xì)胞因子，例如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)可以通過不同途徑用于腫瘤治療[8-9]。此外，IL-22在結(jié)腸癌中的作用也引起了人們的研究興趣，研究表明IL-22促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生。例如，在細(xì)菌誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠模型中，IL-17和IL-22陽性的結(jié)腸固有淋巴細(xì)胞被顯示在結(jié)腸中積聚，這些細(xì)胞的耗盡提供了對侵襲性結(jié)腸癌發(fā)展的保護(hù)。

1.3 抗腫瘤血管基因治療

早在20世紀(jì)70年代，Judah Folkman就在論文中明確闡述[10]，腫瘤血管生成理論也由此形成。在過去，絕大部分抗腫瘤治療是針對于CRC細(xì)胞的本身，但研究表明，抗腫瘤治療對血管內(nèi)皮細(xì)胞有一定的作用，兩者不僅不相互抑制，還起到相互協(xié)同的作用。

腫瘤生長依賴于新生血管的形成，其生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介導(dǎo)的血管生成是抗癌治療的常用靶點(diǎn)，已通過不同形式的干預(yù)手段阻斷腫瘤新生血管來探索。Wang等[11]通過薈萃分析評估了VEGF基因多態(tài)性在CRC患者中的預(yù)測作用，發(fā)掘VEGF-2578C→A和- 460C→T多態(tài)性是CRC患者的潛在預(yù)測因子。然而，針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體或蛋白與傳統(tǒng)化療相結(jié)合已被證明可以改善轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)的預(yù)后[12]。因此，在腫瘤基因治療中其抗血管治療是頗具潛力的基因治療措施。

抗腫瘤血管基因治療在臨床中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究和探討。例如，需要研究抗血管生成治療對正常血管生長的影響；如何實(shí)現(xiàn)個體化的抗血管生成基因治療，最大限度地造?；颊?，降低治療成本等。

1.4 抑癌基因治療

抑癌基因(tumor suppressor genes)，也稱為腫瘤抑制基因，是一類存在于正常細(xì)胞中，阻斷細(xì)胞生長并抑制癌癥的基因。抑癌基因可通過點(diǎn)突變、DNA片段缺失、移位和突變等途徑失活，失活的抑癌基因發(fā)揮其作用，使細(xì)胞不斷持續(xù)生長。當(dāng)基因功能水平失衡、突變等異?？梢饜盒赞D(zhuǎn)化產(chǎn)生腫瘤。因而，通過恢復(fù)抑癌基因的功能可以阻礙腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前與CRC密切相關(guān)的抑癌基因是p53，MCC，PTEN，p16等。

TP53是位于17號染色體短臂上的抑癌基因，編碼一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)。p53通常在DNA損傷的情況下表達(dá)，導(dǎo)致快速分裂細(xì)胞的生長停滯和凋亡(程序性細(xì)胞死亡)。TP53基因突變發(fā)生在50%～70%的CRC中，p53的丟失或突變不僅喪失抑癌作用，同時能轉(zhuǎn)變成一系列的癌基因。一項(xiàng)包括3500多名CRC患者的研究結(jié)果證實(shí)了p53突變的預(yù)后價值，這似乎是由原發(fā)腫瘤部位決定的。因此，改善P53腫瘤抑制因子的功能是治療CRC的關(guān)鍵。腺病毒介導(dǎo)的p53癌基因治療是一種很有前途的恢復(fù)野生型p53功能的抗腫瘤治療方法，因?yàn)樵S多人類癌癥由于p53基因的遺傳改變而喪失了p53功能。體外和體內(nèi)研究表明，將攜帶野生型p53基因的重組腺病毒暴露于CRC細(xì)胞中，具有一定的抗增殖作用，并能提高荷瘤裸鼠的存活率。目前，p53基因治療CRC的主要方法有兩種：①用野生型p53基因代替突變基因； ②用核酶技術(shù)或p53激活因子來逆轉(zhuǎn)p53基因的突變。

對抑癌基因的研究有助于更好地識別CRC的發(fā)病機(jī)制，對CRC的診斷和治療具有重要價值。然而，抑癌基因失活的具體機(jī)制以及抑癌基因之間的相互作用還有待進(jìn)一步研究。

1.5 CRISPR/CAS9基因編輯

CRISPR系統(tǒng)在1987年首次報道，被認(rèn)為是大腸桿菌核苷酸序列中一系列被無關(guān)的、非重復(fù)的短序列(間隔區(qū))打斷的短直接重復(fù)序列[13]。隨著簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列-CRISPR相關(guān)9(CRISPR/CAS9)系統(tǒng)的發(fā)展，基因工程方面的最新進(jìn)展是用于有機(jī)系統(tǒng)的理想選擇。用CRISPR/CAS9治療腫瘤有兩種方法，即直接攻擊癌細(xì)胞的關(guān)鍵基因和編輯免疫細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞。CRISPR/CAS9在CRC臨床治療中的應(yīng)用報道較少。Burgess等[14]利用CRISPR/CAS9技術(shù)，在HCT116細(xì)胞中敲除Survivin基因，提高細(xì)胞的凋亡率。Yoshida等[15]用CRISPR/CAS9基因敲除Snora21基因，證明抑制Snora21的表達(dá)將導(dǎo)致CRC細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，甚至凋亡和死亡。雖然CRISPR/CAS9工具近年來發(fā)展迅速，但在其效率、免疫原性，特別是非靶點(diǎn)效應(yīng)方面仍存在一些問題[16]。

2 存在的問題

雖然大多數(shù)與CRC相關(guān)的主要癌癥基因都已經(jīng)有了很好的特征，但在CRC基因治療的臨床實(shí)踐中仍有許多困難需要克服，如：①目前CRC基因治療的安全性尚未得到很好的處理，許多基因缺陷疾病的初期診斷仍然困難，靶向基因引入靶細(xì)胞技術(shù)也缺乏；②臨床前研究工具的開發(fā)也是一個關(guān)鍵的研究領(lǐng)域，例如在個體患者水平建立腫瘤模型[17]，改進(jìn)提高轉(zhuǎn)移性CRC患者存活率的臨床方法[18-21]；③基因治療應(yīng)用于臨床的成本控制；④基因治療在多系統(tǒng)基因疾病治療中的作用尚不清楚。

3 未來展望

目前正在進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)成功的共同特點(diǎn)是：①疾病是由缺乏功能蛋白引起的，突變蛋白的存在不會干擾治療；②由于表達(dá)水平不理想和特定疾病，不需要調(diào)節(jié)表達(dá)；③基因治療的表型糾正可以通過直接將基因傳遞到有絲分裂后組織或通過干細(xì)胞的基因修飾間接實(shí)現(xiàn)。因此，為了使基因治療在治療中得到更廣泛的應(yīng)用，該領(lǐng)域需要超越基因添加策略。其中一個途徑是將基因組編輯技術(shù)結(jié)合起來，要么糾正內(nèi)源性致病基因，要么將治療基因整合到一個確定的基因位點(diǎn)上。最初的工作主要集中在建立原理證明和開發(fā)用于這些基因編輯工具的試劑和動物模型上。

盡管CRC基因治療的臨床前研究結(jié)果很有希望，但臨床上顯著的抗腫瘤作用仍有待證實(shí)。為了達(dá)到臨床效果，應(yīng)在近期內(nèi)研究不同基因治療策略的結(jié)合或基因治療與常規(guī)化療或放療的結(jié)合。此外，將CRC的基因治療方法范圍擴(kuò)大，并且開發(fā)可檢測轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)及評估藥代動力學(xué)的無創(chuàng)成像系統(tǒng)將成為未來發(fā)展的主題。