RNA 結合蛋白在精子發(fā)生過程中的作用*

徐文華 牛長敏 夏蒙蒙 鄭 英**

1. 揚州大學醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室（江蘇揚州 225000）；2. 江蘇省非編碼RNA 基礎與臨床轉化重點實驗室（江蘇揚州 225000）

精子發(fā)生是精原細胞經(jīng)過高度復雜的分裂增殖、分化變形， 最終形成精子的過程。 精原干細胞（spermatogonial stem cell,SSCs）經(jīng)過一系列有絲分裂擴增產生初級精母細胞，后經(jīng)歷連續(xù)兩次的減數(shù)分裂，形成單倍體圓形精子細胞，再經(jīng)過一系列如染色質濃縮、精子尾部形成等細胞學和形態(tài)學變化， 最終形成結構完整的精子。

從分子水平看， 精子發(fā)生和成熟分化過程是一系列特定基因程序性表達的過程。 眾所周知，轉錄水平的調控在基因表達調控中發(fā)揮重要作用，隨著研究深入，科學家發(fā)現(xiàn)轉錄后調控在基因表達調控中同樣起著十分重要的作用。 基因在核內轉錄后， 新合成的前體mRNA(pre-mRNA)或核異質RNA(hnRNA)經(jīng)過加帽、選擇性剪切和合成多聚腺苷酸尾等一系列事件后成為成熟的mRNA。 成熟的mRNA 被運送到細胞質，其在細胞質中的定位、翻譯和代謝受到嚴格的調控。

RNA 結合蛋白(RNA Binding Protein，RBP)是一類伴隨RNA 的調控代謝過程， 與RNA 結合的蛋白質總稱。RBP 在轉錄后基因表達調控中起著重要作用，它參與RNA 代謝的各個方面。 RBP 和RNA 可以在細胞核結合，也可以在細胞質，但是功能有所不同。 在胞漿發(fā)生結合的RBP 參與RNA 的翻譯以及mRNA 的穩(wěn)定性保持， 而在胞核發(fā)生結合的RBP 可能與剪接或成熟相關。RBP 對目標序列的要求并不如DNA 結合蛋白一般嚴格， 一般結合在3' 非翻譯區(qū)（3'untranslated region,3'UTR），少數(shù)在5'UTR，極少見于蛋白質編碼區(qū)。

在精子發(fā)生中，RBP 的功能多樣，除了在精子發(fā)生后期mRNA 的剪切加工、運輸及翻譯等方面起作用外，還在雄性和雌性配子發(fā)生的減數(shù)分裂前期起重要作用，因此，其結構或者功能的異常往往導致疾病的發(fā)生。

本文總結了目前與哺乳動物精子發(fā)生相關的RNA結合蛋白，并按照有無RNA 識別基序(RNA recognition motif，RRM)進行分類，試圖揭示它們與不孕不育癥之間的聯(lián)系， 并為臨床上不育癥的診斷和治療提供思路及理論依據(jù)。

一、具有RRM 的RNA 結合蛋白

RRM 又被稱為RNP 基序(ribonucleoprotein motif，RNP) 或者CS-RBDs (consensus sequence RNA-binding domain)。 具有RRM 的RNA 結合蛋白在已知的RNA結合蛋白中被研究得十分深入。 這些RNA 結合蛋白參與RNA 前體的剪接、RNA 的細胞定位和維持RNA 的穩(wěn)定性等轉錄后調控過程。1976 年Tiepob 等在Y 染色體上發(fā)現(xiàn)了與精子發(fā)生相關的基因并提出了無精子因子位點假說(azoospermia factor，AZF)，后Vogt 發(fā)現(xiàn)Y染色體長臂上的缺失不是單一的位點， 而是三個非重復區(qū)域，稱之為AZFa-c，在這三個區(qū)域上克隆的多個候選基因都是具有RRM 的RNA 結合蛋白。

（一）RBM(RNA binding motif)家族

RBM 基因家族最早被發(fā)現(xiàn)時，它定位在人類Y 染色體長臂末端，該區(qū)域在一部分不育男性中缺失。 應用RBM 抗體在Y 染色體缺失的不育男性睪丸組織進行免疫細胞化學研究， 結果證明大部分或所有活性拷貝都位于AZFb區(qū)域內。目前發(fā)現(xiàn)RBM 家族有三個成員，分別是RBMY(RNA binding motif Y chromosome)、RBMX(RNA binding motif X chromosome)和hnRNPGT(an acronym of heterogeneous ribonucleoprotein G expressed in the testis)。RBMY 在人類、小鼠和有袋類動物的Y 染色體上發(fā)現(xiàn)， 在進化上高度保守。 人類RBMY 蛋白在生殖細胞的所有轉錄活性階段都有表達， 且僅在細胞核中表達, 而小鼠RBMY 只在精原細胞和早期精母細胞中表達， 這提示在小鼠中RBMY 基因可能在減數(shù)分裂過程中失活。對RBMY 功能進入深入研究時，使用的是染色體為XO 的雄性小鼠。 這些小鼠含有編碼Sry 的轉基因和一個Y 染色體編碼的RNA 結合蛋白Eif2s3y。在這些小鼠的精子發(fā)生中能夠完成第一次減數(shù)分裂，這意味著RBMY 的表達在精子發(fā)生的后期才需要。

RBMY 有一種廣泛表達的X 染色同源蛋白RBMX。 Ehrmann 等研究了RBMX 的同源蛋白RBMXL2（RNA binding motif X chromosome like 2），其基因缺失會阻礙雄性小鼠產生精子，小鼠不育，他們進一步利用RNA 測序實驗表明，RBMXL2 蛋白通過防止小鼠基因中的外顯子和內含子被重新排列來確保正確剪接[1]。 在表達RBMXL2 減數(shù)分裂及減數(shù)分裂后生殖細胞中，RBMX 和RBMY 基因在XY 異染色體結構中被轉錄失活。 因此，在第一次減數(shù)分裂中，RBMX 或RBMY 不可能產生冗余效應。分析表明，RBMXL2 蛋白是減數(shù)分裂的關鍵蛋白， 在保護減數(shù)分裂轉錄組免受染色體剪接位點異常選擇方面起著重要作用[2]。

這個基因家族的第三個重要成員是hnRNPGT，它是逆轉錄基因編碼的。 hnRNPGT 蛋白在粗線期精母細胞核和圓形精子細胞中特異性表達。 這種減數(shù)分裂特異性表達提示hnRNPGT 在XY 體內失活時可能取代RBMX 的功能，或在RNA 加工的調控中承擔了其它功能。 hnRNPGT 基因缺陷導致小鼠生育能力下降，提示該基因的遺傳缺陷可能是人類男性不育的原因。 與此假設相一致，hnRNPGT 基因突變已在精子發(fā)生受損的不育患者中發(fā)現(xiàn)[1]。

（二）DAZ(Deleted in Azoospermia)家族

DAZ 基因是從位于人類Y 染色體長臂的AZFc區(qū)域分離得到的， 此區(qū)域在精子輕度缺乏及重度缺乏的男性不育患者中廣泛缺失。DAZ 家族由三個成員組成:包括1 個Y 染色體基因DAZ 和2 個常染色體基因DAZL(deleted in azoospermia-like，DAZL)、Boule[3]。

這3 個基因的編碼蛋白均為RNA 結合蛋白，在生殖細胞中特異表達，參與調節(jié)生殖細胞的發(fā)育和分化。DAZ 只存在于靈長類動物中， 而DAZL 和BOULE 則存在于所有脊椎動物中。 DAZ 家族成員僅在生殖細胞中表達，其蛋白產物含有高度保守單一的RRM 和獨特的DAZ 重復序列。DAZ 和DAZL 蛋白已經(jīng)在原始生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)和精原細胞中表達，并定位在細胞核中。 它們持續(xù)表達于精母細胞中，其定位轉換為細胞質。 相比之下，BOULE 的表達較晚，在睪丸減數(shù)分裂前后表達。

DAZ 基因是精子生成的關鍵基因， 在減數(shù)分裂過程中起重要作用。DAZ 基因缺失，會導致精原細胞和精母細胞不能成功變形為精子， 分別表現(xiàn)為無精子癥和嚴重少精子癥而導致不育。有研究結果表明，DAZ 不僅通過連接到多個RNA 上來介導與多核糖體的聯(lián)系，而且在精子發(fā)生的第一階段起維持精原干細胞群數(shù)量的作用。 另外，DAZ 在精子發(fā)生后期RNA 代謝過程中起調節(jié)作用。

小鼠生殖細胞中DAZL 在出生后特異性缺失不影響雌性生殖能力，但可導致雄性完全不育，精原干細胞逐漸喪失，減數(shù)分裂停止。研究發(fā)現(xiàn)小鼠DAZL 在3'非翻譯區(qū)(3'UTR)與大量睪丸mRNA 轉錄物結合，并與含有ploy(A)結構的翻譯蛋白相互作用。 在缺乏DAZL 的情況下，多聚體相關的靶基因轉錄顯著減少，導致大量生精蛋白的減少，從而導致精子發(fā)育停滯[4]。 由此推斷DAZL 是精子發(fā)生必需的翻譯調節(jié)因子。

BOULE 基因表達水平的降低或缺乏、BOULE 蛋白表達的缺乏引起減數(shù)分裂阻滯 (meiotic arrest，MA)和精子生成障礙，從而導致不育。 BOULE 蛋白在轉錄后翻譯水平上起重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)，果蠅的BOULE基因通過調控twine 基因(Cdc25 磷酸酶基因)來實現(xiàn)對減數(shù)分裂過程的調控。 另外還有研究發(fā)現(xiàn)， 將人類BOULE 基因轉入BOULE 基因突變的不育果蠅中可以恢復其精子發(fā)生過程，說明在人類中BOULE 蛋白作為減數(shù)分裂調控因子可能與果蠅同源基因有相同或相似的功能。

（三）Elavl1(embryonic lethal abnormal vision Drosophila-like 1)/HuR

Elavl1 類蛋白含有3 個高度保守的RRM 結構域，其中兩個是串聯(lián)重復的， 第三個RRM 與前兩個RRM由富含堿性氨基酸的片段分開。 Elavl/Hu 家族主要由四個蛋白構成，Elavl1(又稱HuR)是其中之一，它在轉錄后調控中具有多種作用，包括mRNA 的加工、輸出、翻譯和降解[5]。 在小鼠生精細胞中，Elavl1/HuR 主要在粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達。Elavl1 缺失導致雄性小鼠不育， 其原因是減數(shù)分裂時精母細胞大量死亡以及圓形精子細胞無法分化成細長型的精子細胞。因此，Elavl1 缺失的小鼠附睪中沒有精子。有研究表明，Elavl1 缺失或高表達都會導致熱休克蛋白A2(Heat Shock Protein A2,HSPA2) 下調，Elavl1 與HSPA2 mRNA 特異性結合， 在生殖細胞翻譯水平上控制HSPA2 mRNA 的表達[6]。

（四）TIAR(TIA-1 related protein)

TIAR 蛋白在其氨基末端具有3 個RRM(RRM1、2和3)， 在羧基末端具有一個富含谷氨酰胺的結構域。TIAR 作用于真核翻譯起始因子2α (eukaryotic Initiatiion Factor 2α, eIF2α) 磷酸化的下游， 促進應激顆粒(Stress Granules,SG)的組裝，也促進應激情況下mRNA的分型。

敲除TIAR 基因的小鼠顯示出生存能力下降，只有14%的小鼠能夠成年， 且雄性、 雌性小鼠均不育的。TIAR 基因敲除小鼠的生殖腺中完全沒有生殖細胞。 在TIAR 基因敲除小鼠中，11.5 dpc(days post coitum)胚胎PGCs 到達生殖嵴，但與野生型胚胎相比，其數(shù)量明顯減少。在沒有TIAR 的情況下，PGCs 很快從發(fā)育中的睪丸中消失。 這些觀察結果表明，TIAR 在精子發(fā)生初期是必需的[7]。

（五）TDP-43(transactive response DNA-binding protein of 43 kDa)

TDP-43 是一種DNA/RNA 結合蛋白， 它參與了睪丸組織中基因表達的調控， 該基因缺失會影響男性的生育能力。 TDP-43 不僅可以參與mRNA 的剪切，而且還是一個轉錄抑制因子， 有研究發(fā)現(xiàn)TDP-43 中的RRM1 識別位點在轉錄抑制上起著重要作用[8]。

二、無RRM 結構域的RNA 結合蛋白

（一）PIWI 家族

PIWI 蛋白屬于Argonaute 家族的PIWI 家族分支，具有特征性的位于序列中間呈月牙形的PAZ 結構域（PIWI-Argonaute-Zwille domain），PIWI 家 族 在 人 類 中由HIWI、HIWI2、HIWI3 及HILI 四種蛋白組成，而在小鼠中，由MIWI、MIWI2 和MILI 三種蛋白組成。

在小鼠基因敲除實驗中，MIWI 和MILI 被證明是精子發(fā)生必不可少的[9]。 MIWI 基因敲除小鼠精子發(fā)生停滯在早期圓形精細胞階段；MILI 基因敲除可導致精子發(fā)生停滯于減數(shù)分裂偶線期和粗線期之間； 而MIWI2 基因缺失的表型類似于MILI 基因敲除小鼠，精子發(fā)生停滯在減數(shù)分裂前期[10]。

PIWI 蛋白中有許多分子具有生殖系統(tǒng)特異性，并且在生殖發(fā)育中功能保守， 它們利用生殖系統(tǒng)特異的PIWI 相互作用RNA(piRNAs)抑制轉座因子并保護生殖細胞基因組的完整性[11]。 PIWI 蛋白還可能參與前精原細胞的甲基化重建， 并且調節(jié)圓形精子中某些編碼RNA 的表達。

小鼠MIWI 與APC/C(anaphase promoting complex,cyclosome)E3 復合物相互作用， 并在晚期精子細胞中被APC/C 泛素化。有研究表明，MIWI/piRNA 機制不僅負責在精子形成后期消除mRNA， 為精子的產生做準備，而且他們意外地發(fā)現(xiàn)，同樣的機制也負責激活一部分精子mRNA 的翻譯，以協(xié)調精子形態(tài)的轉化。這種作用需要piRNAs 與靶mRNA 在其3’UTRs 中以特異性堿基配對相互作用， 通過與順式作用的富AU 序列偶聯(lián)激活翻譯， 以特定發(fā)育階段的方式形成MIWI/piRNA/eIF3f/HuR 超復合物。 這些發(fā)現(xiàn)提示piRNA 在翻譯激活中起著關鍵作用，這在精子細胞發(fā)育中是必需的[12]。

（二）STAR 家族

STAR 家族是一類參與細胞分化的進化保守型RBP。 他們的特征是具有KH(hnRNP K homology)結構域[13]。 KH 結構域及其鄰近區(qū)域被稱為STAR/GSG(GRP33、SAM68、GLD-1)。 Sam68 亞家族成員在小鼠精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用， 包括Sam68、SLM-1 和SLM-2。

Sam68 在小鼠精子發(fā)生中起著重要作用。 Sam68表達廣泛，且在精原細胞、粗線精母細胞和圓形精子細胞的核中高表達，Sam68 在精母細胞核中的保留依賴于細胞RNA 的完整性，這表明該蛋白被招募到轉錄活躍的染色質中。 小鼠Sam68 基因敲除模型的特點是精子發(fā)生的階段特異性停止，實驗用磷酸化的RNA 聚合酶II (RNA polymerase II,RNAPII) 染色確定了Sam68的表達僅局限于精子發(fā)生的轉錄活躍階段。 此外，Sam68 與生殖細胞中的剪接調控因子相關，Sam68 在體內與內含子7/外顯子8 周圍的序列結合， 從而影響磷酸化RNAPII 和一般剪接因子U2AF65 的募集。這些結果表明，Sam68 可在生殖細胞分化過程中調節(jié)轉錄活性位點的選擇性剪接[14]。

SLM-1 可能在有絲分裂過程中作為Src（sarcoma）的多功能轉接蛋白發(fā)揮作用。 SLM2(又稱T-STAR)與Sam68 高度同源， 它在精母細胞和精子以及成人大腦的特定區(qū)域高度表達。SLM2 參與組織特異性調節(jié)神經(jīng)元前mRNA 的選擇性剪接[15]。 有研究通過對睪丸cDNA 文庫進行酵母菌雙雜交篩選試驗發(fā)現(xiàn)SLM2 能與RBM 的SRGY 重復序列發(fā)生特異性結合，進一步研究發(fā)現(xiàn)SLM2 通過對RBM pre-mRNA 的加工而參與了精子發(fā)生過程。

（三）NANOS 家族

在果蠅中，Nanos 是一種編碼RNA 結合蛋白的母源效應基因，它在胚胎軸的形成和性腺中PGCs 的遷移都必不可少。 哺乳動物中的Nanos 家族由Nanos1、Nanos2 和Nanos3 三個基因組成。 小鼠Nanos1 在雄性和雌性生殖細胞中均有表達， 但其缺失并不影響生育能力。 然而Nanos2 和Nanos3 的缺失則可分別導致雄性或兩性不育。

Nanos2 蛋白主要在胚胎雄性生殖細胞從14.5～18.5 dpc 表達。 在小鼠精子發(fā)生過程中，Nanos2 結合mRNAs 形成的復合物通過雙重機制穩(wěn)定SSCs 的內環(huán)境。 其一是直接募集SSCs 分化相關的基因并且抑制其轉錄物的翻譯， 其二則是抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白敏感型復合體（mammalian Target of Rapamycin complex 1,mTORC1）信號通路[16]。 有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA) 也參與了Nanos2 基因表達的調控，miR-34c 與Nanos2 mRNA 的3’UTR 結合，在轉錄后水平抑制Nanos2 的表達，促進小鼠精原干細胞分化[17]。同時有研究表明，Dazl 的過表達會阻止雄性PGCs 性別分化， 而Nanos2 能與Dazl mRNA 的3’UTR 相互結合，抑制Dazl 基因的表達，從而促進雄性PGCs 的性別分化[18]。Nanos2 還可以抑制減數(shù)分裂誘導因子Stra8（stimulated by retinoic acid gene 8） 的表達， 阻止PGCs進入減數(shù)分裂[19]。

Nanos3 表達于9.5～14.5 dpc 的雄性和雌性胚胎生殖細胞中。 盡管Nanos3 在生殖細胞和體細胞中都可以被轉錄， 但它只在生殖細胞中被有效地翻譯。 研究發(fā)現(xiàn)， 體細胞中Nanos3 的翻譯抑制則是由3’UTR 介導的mRNA 失穩(wěn)機制引起的。 在CAG 啟動子的控制下(CAG 啟動子誘導生殖細胞和體細胞中普遍存在的強轉錄)， 在外源基因編碼區(qū)添加Nanos3-3’UTR 序列也能有效地抑制生殖細胞中的蛋白質表達[20]。

（四）PTB(Polypyrimidine Tract Binding)家族

PTB 家族包括PTBP1(通常稱為PTB)、PTBP2(又稱腦或神經(jīng)元PTB、brPTB、nPTB) 和PTBP3 (也稱為Rod1)。 在小鼠睪丸中，PTBP1 表達局限于精原細胞，而PTBP2 表達于精母細胞和精子細胞。

PTBP1 是一種高度保守的RNA 結合蛋白，是已知的選擇性剪接調控因子[21]。在體外培養(yǎng)的生殖系干細胞中，4-OHT (4-羥基他莫昔芬) 誘導生殖干細胞PTBP1基因缺失，可導致嚴重的細胞增殖停滯，并促進凋亡細胞的死亡。 這些結果表明，PTBP1 通過調節(jié)精原細胞增殖而參與精子發(fā)生[22]。 Ptbp1 基因敲除可導致小鼠胚胎致死。 在生殖細胞特異性Ptbp1 條件基因敲除(cKO)小鼠，3 周齡之前其睪丸重量與對照組相當， 但2 個月齡時cKO 小鼠的睪丸重量明顯比對照組輕[23]。

生殖細胞特異性Ptbp2 基因敲除小鼠精子細胞的延長嚴重受損[24]，這表明PTBPs 是一種高度保守的基因在精子發(fā)生中起著必要的作用。 在胚胎大腦中，PTBP2 作為沉默子調控選擇性外顯子上游和內部的剪切。 在生殖細胞中，PTBP2 是否有類似的作用尚不清楚。 PTBP2 在生殖細胞轉錄后控制中具有非剪接性作用。Xu 利用磷酸甘油酸激酶2（phosphoglycerate kinase 2,Pgk2）mRNA 的3’UTR 親和層析， 鑒定出小鼠睪丸中的RNA 結合蛋白PTBP2。 結果表明，PTBP2 與睪丸中Pgk2 mRNA 結合，并且是與Pgk2 3’UTR 的特定區(qū)域結合。在HeLa 細胞體外實驗中，Ptbp2 增加了PGK2 mRNA 的半衰期，這表明Ptbp2 在精子形成過程中穩(wěn)定了PGK2 mRNA 的表達[25]。

（五）Y-Box Proteins

Y-box 蛋白是功能保守的DNA 和RNA 結合蛋白，在生殖細胞中，對mRNA 的結合和調控發(fā)揮重要作用。 在小鼠中存在三個Y-box 基因：YBX1、YBX2 和YBX3。 YBX2 和YBX3 在減數(shù)分裂細胞和減數(shù)分裂后細胞中均有表達，對精子形成至關重要。

YBX2 基因敲除小鼠睪丸內減數(shù)分裂后的生殖細胞中存在形成缺陷，附睪中未見精子。YBX2 在細胞核中起轉錄激活作用，在細胞質中起翻譯調節(jié)作用。通過對敲除了生殖細胞的小鼠中靶mRNA 轉錄產物(如魚精蛋白和過渡蛋白)的分析發(fā)現(xiàn)，YBX2 缺失主要影響這些mRNA的多體招募[26]，表明該蛋白的基本功能是在轉錄后調控基因表達。 利用YBX3 表達延長到圓形精子細胞后的轉基因小鼠， 可以證明了YBX3 干擾了帶有3’UTR Y-box識別序列的時間控制mRNA 的翻譯激活。

三、結語

上述RNA 結合蛋白基因敲除后均影響小鼠的生育能力，還有一些RNA 結合蛋白，其基因敲除后對小鼠的生育能力沒有顯著的影響，例如TIA-1、PUM 等，它們可能與通過與其他分子共同作用調控精子發(fā)生過程。

目前，關于RNA 結合蛋白的研究取得了長足的進展，在一定程度上為男性不育的發(fā)病機制提供了依據(jù)。隨著研究技術的不斷進步和發(fā)展，對RNA 結合蛋白的作用及調控機制將會有更加清晰的認識， 也會為男性不育癥的臨床診斷和治療提供新的思路。