軍團菌檢測的研究進展

宋麗娜,令狐志宏,于珊珊

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.檢驗科;2.麻醉科，吉林 長春130033)

軍團菌感染可引起軍團菌病，該病夏、秋季多發(fā)，潛伏期一般為2-10天，主要易感人群有吸煙者、HIV/AIDS導致的免疫缺陷者、移植等免疫力、慢性肺部疾病者、集中空調冷卻塔維護人員等[1]。軍團菌肺炎是軍團菌病的主要類型,不僅見于社區(qū)獲得性肺炎[2],也是醫(yī)院感染的重要病因之一,WHO已將其列入傳染病報告范圍。由于體征和癥狀是非特異性的，軍團菌病可能難以診斷，因此快速實驗室診斷至關重要[3]。近年來,許多公共場所的水系統(tǒng)中軍團菌的污染情況嚴重[4，5]，已經(jīng)成為現(xiàn)代化城市發(fā)展中所面臨的一個重要公共衛(wèi)生問題。本文將對軍團菌檢測的最新進展做一綜述。

1 PCR技術

PCR技術是目前國內外使用最廣泛的實驗方法。很多研究團隊在傳統(tǒng)PCR法的基礎上對反應條件和體系優(yōu)化，建立了新的檢測體系，并取得了初步成果。牛莉婭[6]等人通過嗜肺軍團菌種mip基因的保守序列和軍團菌屬特異性23S rRNA基因設計引物和TaqMan探針，優(yōu)化熒光PCR反應條件和反應體系后建立的PCR雙管檢測靈敏度達10標準質粒拷貝數(shù)/反應,并可對嗜肺與非嗜肺軍團菌進行鑒別。C.Ginevra[7]團隊利用全基因組測序(WGS)數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種通過lpp1868基因的擴增來檢測屬于ST1克隆復合體的Lp1的qPCR分析法，并用于呼吸道樣本中Lp的檢測，靈敏度和特異性均高于95%。他們通過ST1 PCR檢測將三分之二培養(yǎng)陰性的軍團菌病病例篩查出來，具有較高的實用價值。于紀棉[8]等人建立了一種通過微滴發(fā)生器將樣本進行微滴化處理，再進行PCR反應的微滴式數(shù)字PCR技術(droplet digital PCR，dd PCR)，通過優(yōu)化反應條件，可有效的對嗜肺軍團菌進行鑒定。在對模擬樣品進行檢測中發(fā)現(xiàn)dd PCR與 qPCR對 DNA 模板的檢測限一致，且靈敏度高、特異性強，可用于嗜肺軍團菌檢測，且可以對基因進行絕對定量。

2 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術簡稱LAMP，能在等溫(60-65℃)條件下，短時間內進行核酸擴增，是一種簡便、快速、精確、低價的基因擴增方法。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，但不依賴任何專門的儀器設備，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，且檢測成本遠低于熒光定量PCR，目前已廣泛應用于各項研究中。Moosavian Mojtaba[9]團隊的研究通過培養(yǎng)、PCR和環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)三種方法檢測住院呼吸道癥狀患者的呼吸道標本中的嗜肺軍團菌。結果顯示，與常規(guī)方法(如PCR和培養(yǎng))相比，LAMP測定法是一種更快的方法，具有更高的靈敏度和特異性，可用于實驗室診斷軍團菌病。

3 MALDI-TOF MS法

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質譜，目前已應用于生物學、醫(yī)學研究等很多領域。Maria A.Kyritsi[10]等人通過對15個參考菌株和150個 Lp的環(huán)境分離株進行蛋白質提取，進行MALDI-TOF MS分析，將獲得的原始光譜引入到Mass-Up軟件平臺中，以進行血清標志物篩查和致病性基因的檢測，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS對Lp血清群的確定和lvh和rtxA毒力基因的檢測顯示出良好的性能。若能對該方法進行標準化并使用直接靶板蛋白譜分析代替蛋白質提取的方法，將使該方法的檢測更為準確、快速。

4 生物傳感器

生物傳感器是一種由生物敏感材料制成的識別元件(如探針)和物理化學檢測器組成的檢測裝置，可實時監(jiān)測，操作簡便廣泛應用于環(huán)境、食品、醫(yī)療等領域[11]。目前有許多研究聚焦于用生物傳感器檢測軍團菌。M.Amirul Islam[12]等通過結合帶負電荷的十二烷基硫酸鈉(SDS)來提高檢測嗜肺軍團菌的電荷感應GaAs / AlGaAs納米異質結構生物傳感器的檢測限，發(fā)現(xiàn)該方法可使Lp的zeta電位增加兩倍，將這些細菌暴露于0.02 mg/ml的SDS溶液后，在pH 7.4處可測定嗜肺軍團菌,從而建立了GaAs / AlGaAs納米異質結構生物傳感器進行嗜肺軍團菌檢測的方法。Ahlem Laribi[13]團隊將自組裝的16-氨基-1-十六烷硫醇(16-AHT)單層共價連接到金基質上，并將所得的修飾表面用于固定抗嗜肺軍團菌單克隆抗體(mAb)，使用電化學測量和顯微成像技術建立了一種新型微流體分析法，對人造水樣品中的嗜肺軍團菌sg1進行連續(xù)和定量檢測的生物傳感靜態(tài)和動態(tài)模式的線性響應范圍和檢測極限進行了比較。研究發(fā)現(xiàn)在動態(tài)條件下，低細菌濃度范圍為10至10 3 CFU / mL時，生物傳感器響應呈現(xiàn)線性關系，與靜態(tài)條件下在靜態(tài)條件下獲得的傳感信號相比，傳感信號增強了4.5倍。Ahmad Mobed[14]團隊將半胱胺(Cys A/AuNPs)支撐的金納米結構被沉積在金電極的表面上，為有效固定ssDNA提供了較大的表面積，并確定了固定化pDNA的生物活性和穩(wěn)定性，以此設計出了一種新的基于DNA的生物傳感器來檢測軍團菌，顯示出了良好的靈敏度，選擇性和穩(wěn)定性。這項研究的結果表明，在不久的將來基于核酸的生物測定可能會替代傳統(tǒng)方法進行嗜肺軍團菌的檢測。

5 結語

綜上，許多學者已關注軍團菌的檢測方法的探索，很多前沿的技術也已逐漸應用到軍團菌檢測的研究中，建立軍團菌快速檢測的方法并實現(xiàn)標準化將對軍團菌病的防控有著重要的理論和現(xiàn)實意義。