我院136株流感嗜血桿菌分離特點及耐藥性分析

王玉潔,國 霞,王曉飛

(青島市市立醫(yī)院 1.檢驗科； 2.腫瘤科， 山東 青島266001)

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza,Hi)是一種短小的革蘭陰性桿菌，分布在咽部、鼻部及鼻咽部，是條件致病菌，也是引起社區(qū)性肺炎的主要致病菌。在住院患者免疫力較低情況下容易引起肺炎及氣管炎，也可合并支氣管擴張、COPD感染。國內(nèi)有學(xué)者研究顯示，當(dāng)患者年齡在60歲以上，Hi感染并合并其他多種嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，有引起死亡可能[1]，與國外報道一致[2]。Hi是一種苛養(yǎng)菌，生長需要v因子與x因子，菌落生長緩慢、細小，與副流感桿菌混淆，容易被忽視掉，是一種需要重點關(guān)注的條件致病菌。

1 材料與方法

1.1 菌株來源回顧性整理我院2015年12月至2018年11月間分離出的Hi136株，標(biāo)本來源為痰標(biāo)本133例、傷口分泌物1例、胸腹水2例。

1.2 標(biāo)本采集清洗口腔后咳出深部痰標(biāo)本或抽取痰，無菌痰杯盛取。抽取無菌體液及膿液標(biāo)本，無菌管盛取，2 h內(nèi)送檢。

1.3 試劑5%綿羊血培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、HTM培養(yǎng)基、質(zhì)譜儀、頭孢硝噻吩試紙片為法國梅里埃公司產(chǎn)品；藥敏標(biāo)準(zhǔn)紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC25923，Hi標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC49247，由山東臨檢中心購置。

1.4 方法

1.4.1細菌鑒定 痰標(biāo)本涂片符合規(guī)范要求，上皮細胞≤10個/低倍鏡，白細胞≥25個/低倍鏡。標(biāo)本于2 h內(nèi)接種血平板、麥康凱和巧克力平板， 35℃±1℃，5%-10%CO2孵箱培養(yǎng)18-48 h。挑取圓形、濕潤、透明小菌落，金葡標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923衛(wèi)星試驗陽性，經(jīng)MS鑒定確認(rèn)為Hi。

1.4.2分組 按照季節(jié)性分離情況分為春夏秋冬4組，春季3月1日至5月31日，夏季6月1日至8月31日，秋季9月1日至11月30日，冬季12月1日至2月28日。 按科室分離情況選取前六位，分別為呼吸科、重癥監(jiān)護科、心血管、腎臟科、燒傷科、及內(nèi)分泌科。

1.4.3生物學(xué)分型 根據(jù)對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應(yīng)結(jié)果對比，對分離Hi進行生物學(xué)分型。共分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型、Ⅴ-Ⅷ型8個生物型。

1.4.4藥敏 頭孢硝噻吩試紙片法沾取菌落檢測β-內(nèi)酰胺酶，紅色為陽性，不變色為陰性，對照質(zhì)控菌株ATCC49247。藥敏試驗紙片分別有氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、阿奇霉素、四環(huán)素、氯霉素、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、頭孢噻肟、復(fù)方磺胺。標(biāo)準(zhǔn)K-B法，HTM培養(yǎng)基，準(zhǔn)確量取直徑。結(jié)果判定參照CLSIM100標(biāo)準(zhǔn)，分敏感、中介、耐藥3種結(jié)果。

1.4.5統(tǒng)計學(xué)分析 實驗室數(shù)據(jù)使用WHONET5.6軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 按季節(jié)分離分組比較冬季61株(44.9%)，春季44株(32.4%)，秋季22株(16.2%)，夏季9株(6.7%)，冬季、春季明顯增多。

2.2 按科室分離分組比較分離排名前6位科室菌株及占比：呼吸科61株(44.9%)，心臟內(nèi)科31株(22.8%)，ICU15株(11.0%)，腎臟科11株(8.1%)，燒傷科11株(8.1%)，內(nèi)分泌科7株(44.9%)，以呼吸科最多，且多數(shù)患者伴隨基礎(chǔ)疾病。

2.3 β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果經(jīng)頭孢硝噻吩試驗，β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株55株(40.4%)，其中49株氨芐西林耐藥，6株氨芐西林中介。β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株81株(59.6%)，其中氨芐西林耐藥3株，中介2株。

2.4 生物學(xué)分型情況根據(jù)對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應(yīng)結(jié)果對136株Hi進行生物學(xué)分型，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型最多，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)酶率Ⅰ型最低(10%)，見表1。

表1 136株Hi生物學(xué)分型結(jié)果及產(chǎn)酶率(%)

2.5 臨床常用抗生素的藥敏結(jié)果氨芐西林耐藥率38.2%，復(fù)方新諾明耐藥率65.38%。阿奇霉素、氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的敏感率均大于80%，頭孢呋辛、頭孢噻肟的敏感率均>90%，分離2株環(huán)丙沙星耐藥株，敏感率98.5%，見表2。

表2 136株Hi對10種抗菌藥物的藥敏結(jié)果(%)

3 結(jié)論

Hi是一種革蘭陰性小桿菌，菌落細小，無色透明，生長緩慢，臨床經(jīng)驗不足的初學(xué)者往往忽略其生長，容易漏檢，造成臨床分離率低。Hi營養(yǎng)要求高，分離需要v因子、X因子。加萬古霉素的巧克力培養(yǎng)基，不僅含有X因子，v因子在加熱過程中也被釋放出來，在培養(yǎng)基中加入萬古霉素，還可有效的抑制其他革蘭陽性球菌生長，提高分離率，必要時培養(yǎng)應(yīng)延長至48 h。挑選可疑菌落時，應(yīng)注意與副流感嗜血桿菌、溶血嗜血桿菌與副溶血嗜血桿菌相鑒別。本研究標(biāo)本全部來自我院住院患者，標(biāo)本采集按照第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》微生物標(biāo)本采集要求執(zhí)行。本實驗室對疑似Hi菌株首先用金匍標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923做衛(wèi)星試驗(同時用血平板、MH平板做副流感鑒別)。挑選衛(wèi)星試驗陽性菌落再進行質(zhì)譜鑒定確認(rèn)，最終鑒定為Hi。

本研究通過春夏秋冬4個季節(jié)對Hi菌株分布做統(tǒng)計分析，冬季分離菌株61株， (44.9%)，春季44株(32.4%)，以冬、春最多，有明顯的季節(jié)性。在患者科室統(tǒng)計中，呼吸科病人最多61例(44.9%)，心內(nèi)科31例(22.8%)次之。病種統(tǒng)計多為肺炎、支氣管炎、支擴及COPD感染。有研究顯示[1]，Hi是造成CAP和HAP主要病原菌，這些病人以老年人及重癥病人居多，多臥床不能自理，免疫力低，感染機會增加，且合并多種基礎(chǔ)疾病，嚴(yán)重者可引起死亡，與本文的研究一致(本院兒科住院患者痰標(biāo)本送檢少，獲得數(shù)據(jù)也較少，3年僅2例)。

根據(jù)對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應(yīng)結(jié)果Hi可分為Ⅰ-Ⅷ八個生物型，文獻報道，生物Ⅰ型與兒童腦膜炎有關(guān)，生物Ⅱ型、Ⅲ型主要引起肺炎和上呼道感染[3]。有研究認(rèn)為Hi在不同地區(qū)生物學(xué)分型，存在區(qū)域性差異[4]，即使在同一地區(qū)，不同醫(yī)院或年齡不同，Hi生物學(xué)分型也存在差異性[1]。也有研究證明，生物學(xué)分型與感染的不同類型、抗原性質(zhì)、抗生素耐藥類型有關(guān)[5]，有地域差別。本研究Hi生物分型主要以Ⅱ型(36.0%)、Ⅲ型(31.6%)、Ⅳ型(23.5%)為主，Ⅰ型(7.4%)、Ⅶ型(1.5%)較少，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未發(fā)現(xiàn)，與陳碧英等[6]研究不一致。而楊旭等[7]認(rèn)為Hi生物分型以Ⅳ型為主(69.5%)，與本研究不一致。本研究Hi產(chǎn)酶菌株55株，產(chǎn)酶率分別為Ⅰ型10%、Ⅱ型57.1%、Ⅲ型51.2%、Ⅳ型12.5%，總產(chǎn)酶率40.4%。有學(xué)者認(rèn)為Hi產(chǎn)酶率成人和兒童有較大不同，兒童高于成人，差異有顯著性[8]。

一直以來氨芐西林是Hi感染的首選抗生素，隨著抗菌藥物的不規(guī)范使用，耐藥菌株出現(xiàn)，使氨芐西林耐藥性逐年升高，本研究統(tǒng)計本院氨芐西林的耐藥率為38.2%，和歐洲的耐藥率16.8%[9]比較有差別，也有文獻報道某地區(qū)兒童醫(yī)院氨芐西林耐藥K-B法達49.07%，MIC法達到了82.2%[10]。本研究β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥(β-lactamase negative ampicillin resistant,BLNAR)3株，β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林中介(β-lactamase negative ampicillin intermediates,BLNAT)2株，其耐藥機制是可能是由于菌株細胞壁上一種或多種青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變，引起青霉素結(jié)合蛋白與靶位親和力降低，還可能與外膜結(jié)合蛋白改變導(dǎo)致耐藥有關(guān)[8]，應(yīng)當(dāng)引起重視。本研究Hi對復(fù)方磺胺表現(xiàn)較高耐藥性，達到65.38%，對阿奇霉素、氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星的敏感率達80%-90%。不管是β-內(nèi)酰胺酶陽性或β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株，對三代頭孢都有較好的敏感性[11]，這和國外研究證明一致。Hi對氨芐西林的耐藥機制是菌株產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，主要是TEM-I型酶，其次是ROB-1型酶[12]。國內(nèi)學(xué)者研究報道，β-內(nèi)酰胺酶檢出基因均為TEM-I型,未見ROB-1型[13,14]。國外學(xué)者研究顯示，β-內(nèi)酰胺酶TEM-I型酶占93.7%，ROB-1型酶占4.6%[12]，幾乎所有產(chǎn)ROB-1型酶菌株均出現(xiàn)在北美[15]。

綜上所述，通過本院病例分析，Hi分離有季節(jié)性差別，以春、冬兩季為主，感染者以呼吸科患者為主，其他患有基礎(chǔ)疾病的患者感染機會較多。Hi生物分型主要以Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型為主。氨芐青霉素和復(fù)方磺胺已不再作為感染的Hi首選藥物，三代頭孢、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星敏感率高。其中β-內(nèi)酰胺酶陰性，氨芐西林耐藥或中介(BLNAR或BLNAT)菌株因為細胞壁的改變導(dǎo)致對藥物的親和力降低引起耐藥應(yīng)當(dāng)引起重視。