3種不同炮制方法對白土茯苓中β-谷甾醇含量的影響

江 川 黃玉芳 章 靚 卓 實 林 雄

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建福州 350001

白 土 茯 苓（Rhizoma Heterosmilacis，RH）也被稱為白土苓或者土茯苓，作為一種傳統(tǒng)中藥材白土茯苓屬于百合科植物肖菝葜屬的華肖菝葜、短柱肖菝葜的干燥塊莖[1]。白土茯苓多生于海拔 500 ～1800m，在我國四川、陜西、安徽、甘肅、云南等地均有分布，秋、冬二季采挖，目前僅收錄于貴州省以及四川省的中藥材標(biāo)準(zhǔn)之中。臨床研究分析表明白土茯苓具有通利關(guān)節(jié)、清熱、解毒、除濕的功效，臨床上一般用于治療疥癬、濕熱淋濁、楊梅毒皰等疾病并具有突出的效果[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白土茯苓具有調(diào)節(jié)水與電解質(zhì)平衡，鎮(zhèn)靜、抗癌和降低血糖等作用。白土茯苓的主要成分是β-谷甾醇，β-谷甾醇能夠抗癌抗炎、降低膽固醇、止咳、抗氧化等作用，可作為白土茯苓及其制劑的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)之一[4-5]。本研究探討不同炮制方法對白土茯苓中3 種β-谷甾醇含量的影響。

1 資料與方法

1.1 試驗儀器

可調(diào)式移液儀（購于北京大龍生物儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；紫外分光光度計（北京瑞利儀器有限公司）；低速自動平衡離心機（北京雷勃爾儀器有限公司）； ZORBAX C18柱 色 譜 柱（Agilent，250mm×4.6mm，5μm）；1260 HPLC 色譜分析儀（Agilent）。

1.2 試藥

同一批次（批號：S02156）生白土茯苓藥材購自安徽芝神堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為百合科植物短柱肖菝葜（Heterosmilax yunnanensis Cagnep）；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究院，β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品純度均在99%以上。

1.3 檢測試劑

三氯甲烷、色譜級磷酸、乙腈均購于德國默克股份有限公司；甲醇、純無水乙醇、磷酸等試劑均購于中華試劑網(wǎng)。

1.4 方法

1.4.1 不同炮制品的制備 （1）生切品。取發(fā)汗后的新鮮茯苓凈藥材，白茯苓切成厚片，80℃烘干即可。（2）傳統(tǒng)蒸切品。將發(fā)汗后的新鮮茯苓凈藥材置于普通蒸鍋內(nèi)，隔水蒸制，武火至圓汽后改用中火蒸1h，冷卻后取出，白茯苓切制成厚片，80℃烘干即可。（3）高壓蒸切品。將發(fā)汗后的新鮮茯苓凈藥材置于高壓鍋內(nèi)，隔水蒸制，武火蒸至圓汽后改用中火蒸2h，稍冷后取出，冷卻后取出，白茯苓切制成厚片，80℃烘干即可。每個平行3 份。

1.4.2 供試品溶液的制備 不同白土茯苓炮制品，粉碎后過20 目篩，精密稱取2.0g，置具塞三角瓶中，加20mL 甲醇，精密稱定，超聲處理30min，冷卻后再精密稱定，甲醇補重，將制品通過0.45μm 微孔濾膜進行過濾，操作完成后取續(xù)濾液進樣。

1.4.3 制備對照溶液 取β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品2.0mg于10mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.2mg/mL的對照品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 色譜條件 采用HPLC 法檢測β-谷甾醇含量，流動相：乙腈（A）和0.5%磷酸水（B）；色譜柱：Agilent ZOBAX C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；梯 度 洗 脫：0 ～5min，90% ～80%A；5 ～30min，80% ～70 %A；30 ～35min，70% ～90%A；進 樣量：10μL；檢測波長：210 nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min。

1.5.2 精密度試驗方法 取5mL 供試品溶液按照色譜條件進行連續(xù)進樣，共操作6 次，操作完成后計算各化合物峰面積RSD。

1.5.3 線性回歸分析 吸取10 mL 對照品溶液于量瓶中，采用甲醇進行梯度稀釋，操作完成后獲得標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，按照色譜條件將標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液注入色譜儀，將峰面積作為縱坐標(biāo)、進樣量作為橫坐標(biāo)進行線性回歸分析。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗方法 取5mL 供試品溶液并分別在0、2、4、8 和10h 不同時間點按照色譜條件進行連續(xù)進樣，共操作6 次，操作完成后計算各化合物峰面積RSD。

1.5.5 重復(fù)性試驗方法 取白土茯苓藥材6 份，每份5g，按2.1 項下方法平行制取供試品溶液并測定，計算各化合物峰面積RSD。

1.5.6 回收率試驗方法 取白土茯苓藥材3 份，分別精密加入對照品適量，按照生切品及高壓蒸切品方法平行制取供試品溶液，操作完成后進行測定并計算各化合物回收率。

1.6 含量測定方法

取生切品及高壓蒸切品方法制作的生白土茯苓以及3 種不同炮制方法的白土茯苓樣品進行含量測定，采用計算機軟件并以峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進行計算，平行3 份得到不同有效成分含量進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對本次研究各個炮制時間樣品進行系統(tǒng)聚類分析；P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性回歸分析情況

β-谷甾醇在0.02 ～0.10mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 白土茯苓中β-谷甾醇線性回歸分析情況

2.2 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗和重復(fù)性試驗結(jié)果比較

結(jié)果顯示β-谷甾醇RSD 在5%以下，10h 內(nèi)樣品穩(wěn)定。見表2。

表2 HPLC方法檢測白土茯苓β-谷甾醇精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性

2.3 回收率試驗

β- 谷甾醇平均回收率為99.15%，RSD 為1.65%。見表3。

表3 白土茯苓中β-谷甾醇HPLC方法學(xué)考察回收率試驗結(jié)果（%）

2.4 含量測定

白土茯苓生切品中β-谷甾醇最高，其次為傳統(tǒng)蒸制品和高壓蒸制品。見表4 和圖1。

圖1 不同炮制方法對白土茯苓β-谷甾醇含量的影響

3 討論

雖然白土茯苓與《中國藥典》中收載的土茯苓藥名相近，但二者確為兩個不同屬的植物[6]?！侗静菥V目》中有記載“土茯苓分赤白二種，入藥用白者良”，其中提及的赤者就是土茯苓，白者為白土苓。在我國很多地區(qū)常把白土茯苓當(dāng)作土茯苓使用，市場上藥材品種混亂，真?zhèn)坞y辨。目前，對白土茯苓的化學(xué)成分的研究還不多見，其有效化學(xué)成分多大十幾種，如黃酮及黃酮苷類、甾體皂苷、酚及酚苷類、苯丙素類、有機酸類等[7-10]。白土茯苓具有廣泛的藥理作用，如抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、調(diào)節(jié)血脂和β-受體阻滯樣作用等[11-12]。

表4 不同炮制方法對白土茯苓β-谷甾醇含量的影響（%，n=3）

β-谷甾醇是白土茯苓的主要化學(xué)成分之一，臨床上一般將β-谷甾醇作為評價白土茯苓及炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，另外β-谷甾醇具有抗癌、抗高血脂、抗氧化、抗炎、防治高血壓作用。臨床研究顯示，β-谷甾醇可通過抑制膽汁和膳食中的膽固醇的吸收發(fā)揮降膽固醇的作用，有動物實驗證實其可顯著降低高血脂大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制脂質(zhì)過氧化，預(yù)防動脈粥樣硬化過程。此外，β-谷甾醇還具有十分明顯的抗炎作用[13-14]。β-谷甾醇被證實可明顯降低經(jīng)組胺誘導(dǎo)所致的皮膚毛細血管通透性增加小鼠的血管通透性水平，表現(xiàn)出良好的抗炎的活性[15]。有動物實驗證實，β-谷甾醇能夠抑制腫瘤細胞的增殖、分化與增生，同時還可誘發(fā)腫瘤細胞凋亡[16-18]。由此可見，β-谷甾醇是白土茯苓中的主要有效成分之一，研究其含量對于規(guī)范化白土茯苓的炮制標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的意義。

目前，關(guān)于白土茯苓炮制工藝的研究還十分有限，楊武德等[19]為了明確不同炮制方法對患者機體中茯苓總糖含量的影響，對不同茯苓生品及不同炮制品多糖含量的變化情況進行分析和考察，結(jié)果表明不同的炮制方法對茯苓多糖含量有顯著性的增加作用，多糖含量從高到低順序依次為米湯制、明礬米湯制、朱砂制生品、土炒。本研究采用HPLC 法檢測土茯苓中β-谷甾醇的含量，并進行了方法學(xué)驗證，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠，只需要在常溫下進行，操作簡便、快速，是監(jiān)測白土茯苓中且β-谷甾醇的含量的可靠依據(jù)。同時，本研究對白土茯苓的生切品、傳統(tǒng)蒸制品和高壓蒸制品中β-谷甾醇含量采用上述方法進行檢測，結(jié)果表明，白土茯苓3 種炮制品中含有的 β-谷甾醇含量不同，其中白土茯苓生切品中最高，其次為傳統(tǒng)蒸制品和高壓蒸制品。由此可見，生切品中β-谷甾醇含量保留程度最高，本次實驗中白土茯苓炮制品的分析為研究白土茯苓組方提供了一定的實驗基礎(chǔ)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是由于白土茯苓經(jīng)過蒸制后，由于β-谷甾醇對熱壓不穩(wěn)定，且熱壓越大，β-谷甾醇含量越低。

綜上所述，白土茯苓生切品對β-谷甾醇含量最為有利，本研究可為白土茯苓飲片的規(guī)范化加工和質(zhì)量控制提供參考。但由于本研究只是針對β-谷甾醇一種有效成分進行測定，該研究結(jié)論尚需綜合評價方法的驗證。