H5亞型禽流感病毒DAS- ELISA檢測方法的建立

黃 璐 林 一 王厚照 王生育 陳美玉

1.中國人民解放軍陸軍第七十三集團軍醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361000；2.廈門大學(xué)抗癌研究中心，福建 廈門 361005

禽流感是一種人獸共患傳染病，屬于A類傳染病，由A型流感病毒引起，主要威脅養(yǎng)禽業(yè)和人類健康安全，人類患者常伴有呼吸道感染，嚴(yán)重患者可危及生命[1]。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)感染是一類重大養(yǎng)禽類疫病，其病毒亞型多，變異度高，宿主廣泛，各亞型之間無交叉，導(dǎo)致疫情頻繁發(fā)生，以H5亞型禽流感病毒(H5 subtype avian influenza virus，AIV- H5)的致病性最高、危害性最嚴(yán)重[2]。AIV- H5不僅常導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟損失嚴(yán)重，還可跨越宿主屏障直接感染人，從而危及人類安全[3]。因此，對AIV- H5的快速檢測，在控制養(yǎng)禽業(yè)疫情及保障人類健康方面至關(guān)重要。

目前，檢測AIV有瓊脂糖擴散試驗、免疫熒光試驗、實時定量RT- PCR等多種檢測方法[4]。然而，上述方法均存在實驗周期長，所需儀器復(fù)雜等不同類型的缺點，不能滿足基層快速準(zhǔn)確診斷的需求。因此，研發(fā)快速、簡便、準(zhǔn)確的AIV- H5檢測方法具有重要意義。已有研究利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)檢測H5、H7亞型的禽流感病毒相關(guān)的檢測試劑盒，但是禽流感病毒在進化和傳播過程中易發(fā)生頻繁且不可預(yù)測的突變，變異重組的病毒可能具有新的抗原性和致病性，可逃逸人群中已形成的免疫屏障，引起季節(jié)性或大規(guī)模的流感暴發(fā)[5]。目前，已有的檢測方法尚不能有效地識別不斷出現(xiàn)的新毒株，因此探討更有效的廣譜的檢測方法具有重要意義。本研究擬通過混合多種AIV- H5免疫動物，制備通用的單克隆抗體(monoclonal antibodies, McAb)，在此基礎(chǔ)上酶標(biāo)抗體，篩選配對單抗，建立抗AIV- H5雙抗體夾心ELISA方法(DAS- ELISA)，檢測方法體系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，旨在為禽流感疫情防控提供一種高效檢測手段，并為H5亞型禽流感病毒監(jiān)測、后續(xù)研究提供有效工具。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級BALB/c小鼠由廈門大學(xué)實驗動物中心提供；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞由本實驗室保存；A/Environment/Yunnan/01455/2015(H5N1)、A/Chicken/Hebei/3/2013(H5N2)、A/Duck/Jiangsu/S1665/2015(H5N3)、A/Environment/Jiangxi/10645/2014(H5N8)禽流感病毒及其他病毒的擴增與滅活由深圳出入境檢驗檢疫局完成。弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG、HAT、HT、HRP和rProtein A均為Sigma公司(USA)產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司(USA)產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1抗原制備 將種毒稀釋1×106倍后接種9～11日齡SPF雞胚，37℃孵育48 h，收集尿囊液，利用β- 丙內(nèi)酯滅活尿囊液，通過28 000 r/min超速離心2 h濃縮純化病毒。沉淀的病毒使用適量的PBS進行稀釋，濃度調(diào)整到1 mg/mL作為母液，分裝保存于-80℃冰箱備用，避免反復(fù)凍融。

1.2.2動物免疫 選擇6～7周齡的雌性BALB/c小鼠作為免疫動物，動物免疫及飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心的ABSL- 2動物生物安全實驗室中進行(實驗室備案編號：20142149012)。具體操作流程如下：將H5N1病毒與弗氏完全佐劑乳化均勻，經(jīng)皮下多點注射進行動物初免，將H5N2、H5N3病毒分別與弗氏不完全佐劑乳化均勻，在第15天和第30天分別進行二免和三免。尾靜脈采血，用間接ELISA法測定血清效價，選取效價高的小鼠用于后續(xù)細胞融合。細胞融合前第3天，用H5N8病毒對小鼠進行脾臟注射加強免疫。

1.2.3細胞融合和雜交瘤細胞株篩選 將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在PEG2000的作用下進行細胞融合后，加入HAT培養(yǎng)基及飼養(yǎng)細胞，種植于96孔中，在37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。在融合后第3天用HT選擇培養(yǎng)液換液，待克隆孔長至1/3～1/2時，開始進行雜交瘤細胞株篩選。篩選程序如下：首先以H5N1為包被抗原對克隆孔的培養(yǎng)上清進行大規(guī)模初次篩選，初篩獲得的陽性孔繼而用H5N2、H5N3和H5N8為包被抗原進行再次篩選。4次篩選均為陽性的克隆，進行下一步的“剔除篩選”，即以H9N2、H7N9為包被抗原進行篩選，剔除篩選過程中保留陰性反應(yīng)的克隆孔。以上綜合篩選獲得的克隆株用有限稀釋法進行3次亞克隆，最終獲得穩(wěn)定分泌抗H5亞型禽流感病毒抗體(anti- AIV- H5 McAb)的雜交瘤細胞，進行再擴大培養(yǎng)、凍存。

1.2.4腹水抗體的制備與純化 取8～10周齡的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射石蠟油(0.5 mL/只)，致敏1周后腹腔注射雜交瘤細胞(1×106個/只)。待小鼠腹腔明顯膨大后收集腹水，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液即為小鼠腹水單克隆抗體。通過rProteinA純化腹水抗體，用超濾管濃縮純化的抗體，用紫外吸收法測定抗體濃度。

1.2.5Anti- AIV- H5抗體的鑒定 采用SDS- PAGE鑒定抗體純度，抗體亞類鑒定試劑盒測定McAb的Ig亞類，間接ELISA法測定抗體效價，并與H9和H7亞型(H9N2和H7N9)進行交叉反應(yīng)試驗，檢測抗體的特異性。

1.2.6單克隆抗體的酶標(biāo)記 采用改良的過碘酸鈉法，以辣根過氧酶標(biāo)記已純化的抗體。具體方法如下：取10 mg HRP溶解于2 mL蒸餾水，加入0.4 mL新配的0.1 M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 min。利用1 mM pH 4.4的醋酸鈉緩沖液，在4℃環(huán)境下透析過夜。將溶液pH調(diào)到9.0～9.5時立即加入5 mg anti- AIV- H5抗體，室溫避光輕輕攪拌2 h。然后，加入0.2 mL新配的4 mg/mL NaBH4液，混勻，置4℃ 2 h。接著，于0.15 M pH 7.4 PBS中4℃透析過夜，即可獲得HRP標(biāo)記的抗體溶液。檢測并調(diào)整抗體溶液濃度，分裝，-20℃保存。直接ELISA檢測標(biāo)記的抗體的效價。以1∶1的比例加入甘油，分裝后儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7DAS- ELISA體系抗體組合及工作濃度確定 棋盤滴定法[6]用于篩選捕獲抗體、檢測抗體的最佳組合及最佳工作濃度。具體方法如下：①以2.5、5、10、20 μg/mL，100 μL/well將 3C9、6F5于37℃分別包被于酶標(biāo)板上1 h，作為捕獲抗體；②用5%BSA于37℃封閉1 h；③加入0.2 μg/mL，100μL/well的病毒液于37℃反應(yīng)1 h；④分別以HRP- 3C9和HRP- 6F5作為檢測抗體，從起始稀釋濃度1∶2 000做倍比稀釋，OPD顯色，H2SO4終止，測OD490nm。依據(jù)反應(yīng)線性及P/N值，確定最佳抗體組合、包被抗體及檢測抗體工作稀釋濃度。

1.2.8DAS- ELISA體系最佳工作條件的確定 根據(jù)抗體最佳工作濃度，在不同反應(yīng)條件下，采用棋盤法篩選適宜的條件。包被條件：包被液設(shè)有0.01、0.05、0.1mol/L碳酸鹽緩沖液，包被時間設(shè)有4℃12 h、37℃2 h和37℃ 2 h+4℃ 12 h。封閉條件：封閉液設(shè)有2%明膠、5%BSA、5%馬血清和5%脫脂奶粉，作用時間設(shè)有37℃1 h、37℃2 h、4℃12 h。酶標(biāo)二抗條件：稀釋度從1∶2 000做倍比稀釋到1∶10 000，作用時間37℃ 30 min、1 h、1.5 h、2 h。以上各組實驗，組成方陣進行ELISA試驗，根據(jù)OD490nm值以及S/N值的分析確定最佳條件。

1.2.9DAS- ELISA體系檢測AIV- H5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)已建立好的DAS- ELISA體系，對AIV- H5病毒液從1 200 ng開始做2倍系列稀釋，設(shè)陰性對照和空白對照孔進行檢測，反應(yīng)完畢后測定OD490nm值。以病毒稀釋濃度為橫坐標(biāo)，OD490nm值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.2.10DAS- ELISA體系檢測AIV- H5特異性試驗 在優(yōu)化的條件下，使用AIV- H5的DAS- ELISA系統(tǒng)檢測AIV- H5病毒及相應(yīng)的21～27稀釋液，同時設(shè)有多種對照組，即交叉實驗對照組：滅活后的人的其他亞型禽流感病毒(如AIV- H2、AIV- H7、AIV- H9和AIV- H13)，滅活后的癥狀相似的其他禽類病毒如新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(egg drop syndrome virus, EDSV)；陽性對照組：AIV- H5陽性免疫小鼠血清和陽性雜交瘤細胞上清；陰性對照：SP2/0細胞上清、未免疫的小鼠血清和SPF雞胚尿囊液原液。根據(jù)結(jié)果分析評價DAS- ELISA系統(tǒng)的特異性。

1.2.11DAS- ELISA體系檢測AIV- H5敏感性試驗 同時用已建立的AIV- H5的DAS- ELISA系統(tǒng)和商品化的人禽流感(H5N1)ELISA試劑盒對AIV- H5病毒雞胚尿囊液及SPF雞胚尿囊液倍比系列稀釋液進行檢測。敏感度以檢測結(jié)果為陽性的最大稀釋倍數(shù)表示。

1.2.12陰陽性臨界值的確定 用AIV- H5標(biāo)準(zhǔn)抗原和其他亞型病毒，以PBS制成待檢陰性抗原，然后按已建立的DAS- ELISA系統(tǒng)進行檢測。在符合正態(tài)分布的前提下計算OD值的平均數(shù)(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，按公式計算出陰、陽性抗原的臨界值=X+3×SD。當(dāng)OD值大于臨界值時，可以99.9%的可信度判定為陽性。

1.2.13臨床樣本檢測 用已建立的AIV- H5的DAS- ELISA系統(tǒng)對來自疫區(qū)的30份滅活后的禽類雞棉拭子樣品進行檢測，并與商品化ELISA試劑盒相比較，對系統(tǒng)的敏感性、特異性和實用性進行評價。

2 結(jié) 果

2.1 雜交瘤細胞株篩選與anti- AIV- H5抗體制備

免疫小鼠尾靜脈采血，間接ELISA法測定血清效價，以P/N≥2.1的血清稀釋度判定有效血清效價。結(jié)果3只免疫鼠血清抗體效價均達1∶32 000以上(圖1)，均可用于后續(xù)的細胞融合。

利用ELISA篩選多重篩選融合后的陽性雜交瘤細胞，有限稀釋法克隆純化，直到獲得McAb的雜交瘤細胞株，分別命名為3C9和6F5。ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)液上清的效價都可達1∶103以上。雜交瘤細胞腹腔注射小鼠，制備腹水抗體，經(jīng)檢測效價均達到1∶107。

圖1 免疫小鼠血清稀釋倍數(shù)抗體效價測定

2.2 抗體的純化及抗體亞類分析

利用rProtein A柱純化腹水抗體，通過SDS- PAGE檢測抗體純度。蛋白凝膠結(jié)果(圖2)顯示的2條蛋白帶分別為重鏈(相對分子量55 000)、輕鏈(相對分子量25 000)，電泳純度可達95%。經(jīng)超濾管濃縮后，測量純化抗體濃度約為2 mg/mL?？贵w亞類試劑盒測定結(jié)果顯示3C9和6F5重鏈均為IgG2a，輕鏈均為κ鏈。ELISA檢測純化抗體效價3C9和6F5分別為1∶107和1∶108，辣根過氧化酶標(biāo)記抗體后效價皆為1∶106。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1.純化抗體(3C9)； 2.腹水抗體(3C9)； 3.純化抗體(6F5)；4.腹水抗體(6F5)。

2.3 捕獲抗體、檢測抗體的組合

分別用濃度梯度的3C9和6F5包被酶標(biāo)板，梯度稀釋的HRP- 3C9、HRP- 6F5做檢測抗體。結(jié)果表明(圖3)當(dāng)包被抗體濃度為10 μg/mL時，抗原抗體反應(yīng)呈線性，且2個包被濃度線性接近。以6F5包被，以HRP- 3C9檢測，曲線斜率較好，檢測抗體HRP- 3C9稀釋度為1∶8 000時，P/N值較高。確定最佳抗體組合為包被抗體6F5、檢測抗體HRP- 3C9。

2.4 DAS- ELISA檢測條件的優(yōu)化

經(jīng)試驗，以O(shè)D490nm值和P/N值為標(biāo)準(zhǔn)，確定最適包被條件為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液37℃包被1 h；最適封閉條件為5%馬血清37℃封閉1 h；酶標(biāo)抗體的最適工作條件為1∶8 000反應(yīng)1 h。

將AIV- H5病毒標(biāo)準(zhǔn)液做DAS- ELISA檢測，重復(fù)3次，以O(shè)D490 nm值為縱坐標(biāo)，病毒液稀釋度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線在18～1 200 ng/mL范圍內(nèi)趨近直線，線性關(guān)系佳，R2=0.9944(圖4)。

圖3 DAS- ELISA單克隆抗體組合的確定

圖4 DAS- ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 DAS- ELISA檢測AIV- H5的特異性和敏感性

DAS- ELISA系統(tǒng)特異性測定見表1，結(jié)果顯示AIV- H5實驗組和陽性對照組為陽性反應(yīng)；其他亞型人禽流感 AIV- H2、AIV- H7、AIV- H9、AIV- H13和其他禽類病毒NDV、IBV、EDSV交叉反應(yīng)實驗組為陰性反應(yīng)；SP2/0細胞上清、未免疫的小鼠血清和SPF雞胚尿囊液陰性對照組也為陰性反應(yīng)，說明該DAS- ELISA系統(tǒng)無法檢測其他病毒，對AIV- H5病毒檢測具有特異性。

以AIV- H5雞胚尿囊液原液及其1/21～1/27稀釋液為樣本，利用DAS- ELISA系統(tǒng)進行檢測，結(jié)果均為陽性，商品化人禽流感(H5N1)ELISA試劑盒陽性反應(yīng)滴度到1/25；以SPF雞胚尿囊液原液及其1/21～1/28稀釋液為對照樣本，檢測結(jié)果均為陰性。表明該DAS- ELISA系統(tǒng)檢測對AIV- H5雞胚尿囊液的靈敏度可達到1/27，且比商品化ELISA試劑盒高4倍。

制備的待檢陰性抗原經(jīng)檢驗為陰性后，利用DAS- ELISA系統(tǒng)進行檢測，結(jié)果見圖5，20份樣本的OD值介于0.037和0.220之間，平均數(shù)(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)分別為0.110和0.052。根據(jù)公式計算陰性樣品臨界值=X+3×SD即0.266。當(dāng)OD值>0.266時，可在99.9%的可信度上判定為陽性結(jié)果，并可作為檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)。

表1 DAS- ELISA系統(tǒng)特異性檢測

圖5 DAS- ELISA系統(tǒng)對20份陰性樣品的檢測結(jié)果

2.6 臨床樣本的檢測

檢測來自疫區(qū)的禽類雞的臨床棉拭子樣本30份，結(jié)果顯示10份為陰性，20份為陽性。同時，使用武漢賽培生物科技有限公司提供的H5N1 ELISA試劑盒做平行檢測，結(jié)果與本研究DAS- ELISA檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果相一致，證實該DAS- ELISA系統(tǒng)可應(yīng)用于AIV- H5病毒感染檢測。

3 討 論

禽流感病毒表面的抗原蛋白與流感病毒的致病性密切相關(guān)[7]。根據(jù)蛋白表達和存在位置不同可分為8個病毒的組成成分(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)，2個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)[8]。其中，HA為血凝素，NA為神經(jīng)氨酸，決定了流感病毒的抗原性。與NA相比較，HA基因的突變率較高。當(dāng)前研究大多數(shù)針對HA蛋白，采用基因克隆、蛋白重組等手段，來制備相應(yīng)的抗體，但是該方法獲取的抗體可能無法識別天然的抗原。本研究使用全病毒作為抗原并通過多重篩選，獲得能夠識別天然病毒的抗體，使抗體更具有應(yīng)用性。

隨著HA基因的不斷進化和變異，HA和NA亞型組合愈加豐富，以H5亞型為例，在自然界中可分離到H5N1、H5N2、H5N3、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9等[9- 10]。禽流感病毒一般僅感染禽類，如果病毒在復(fù)制過程中發(fā)生基因重配，致使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，則獲得感染人的能力，從而使得人被感染禽流感。當(dāng)前能直接感染人的禽流感病毒亞型主要有：H5N1、H7NK H7N2>H7N3、H7N7、H9N2和H7N9等，其中H5N1的致死率最高。低致病性AIV如H5N3感染宿主后不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，對養(yǎng)禽業(yè)和人類健康的威脅很容易被忽視，并且可能通過各種機制發(fā)生改變而成為高致病性AIV。已有研究證實，多種亞型的低致病性AIV具有同時結(jié)合禽型受體和人型受體的能力[11- 12]。但是，當(dāng)前研究廣泛的抗體均相對單一，難以覆蓋所有的毒株。本研究在抗原免疫階段首次聯(lián)用多種AIV- H5毒株進行動物免疫，利用雜交瘤技術(shù)獲取配對的針對AIV- H5的McAb，具有反應(yīng)活性高、對AIV- H5覆蓋性好的優(yōu)點。即獲得可同時識別多種AIV- H5的單克隆抗體anti- AIV- H5 McAb，包含高致病性和低致病性的AIV- H5。

魏泉德等[13]的病毒分離鑒定法是現(xiàn)行最經(jīng)典的AIV診斷方法，診斷結(jié)果準(zhǔn)確，但該方法操作復(fù)雜，耗時費力，費用昂貴，難以在AIV疫情爆發(fā)時實現(xiàn)快速診斷。血清學(xué)診斷技術(shù)中的常規(guī)方法(瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗)鑒定病毒，操作簡單易行，但是整體敏感性較差。熒光抗體技術(shù)用于病毒鑒定快速簡便、費用低，但是容易出現(xiàn)假陽性[14]。RT- PCR等分子生物學(xué)診斷技術(shù)快捷、簡便、靈敏，但所需的儀器昂貴[15]。以上各種方法均不適于現(xiàn)場適時診斷AIV感染樣品，在現(xiàn)實應(yīng)用過程容易受到限制。然而，ELISA具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優(yōu)點。其中，抗體的親和力和純度是DAS- ELISA檢測方法建立的成敗因素，本研究通過rProteinA純化腹水抗體，獲取高純度的McAb，用于構(gòu)建性能良好的雙抗體夾心ELISA(DAS- ELISA)檢測系統(tǒng)。

本研究建立的DAS- ELISA檢測系統(tǒng)，在保留ELISA的特異性、敏感性的基礎(chǔ)上，又可縮短診斷時間，結(jié)果不需要特殊儀器分析、甚至肉眼判定即可，為AIV- H5的檢測以及防疫提供了一種方便、快捷、準(zhǔn)確的方法。