大黃花蝦脊蘭種子特性及無菌播種

劉海平, 陳秀萍, 李 珺, 吳沙沙, 何碧珠, 蘭思仁, 翟俊文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護(hù)與利用國家林業(yè)和草原局 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.廣東市林業(yè)和園林科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405)

大黃花蝦脊蘭(CalanthestriataR.Br.，常用異名C.sieboldii)隸屬于蘭科(Orchidaceae)蝦脊蘭屬(Calanthe)，臺灣地區(qū)稱其黃根節(jié)蘭[1-2].大黃花蝦脊蘭花開時花香淡雅，花色純黃，具有極高的觀賞價值，是優(yōu)良的育種親本，因而受到園藝育種界的廣泛追捧.目前在英國皇家園藝學(xué)會(RHS)已登錄的蝦脊蘭新品種約有449個，其中約28個品種是以大黃花蝦脊蘭作為親本，幾乎涵蓋所有黃色品種，大黃花蝦脊蘭的育種潛力巨大，具有良好的商業(yè)開發(fā)價值.

大黃花蝦脊蘭野生個體數(shù)目極少，并且分布狹窄，屬于典型的大陸—島嶼間斷分布，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道主要分布于中國南部(湖南新寧艮山、永州陽明山、江西井岡山、安徽涇縣)[3-6]、日本南部(本州、四國島、九州島，其中，琉球群島為模式標(biāo)本產(chǎn)地)以及韓國南部一些島嶼(郁陵、Heuksan、Gageo、Hong、濟(jì)州島)[7].正是由于野生個體極少，分布狹窄，因此被列入《中國高等植物紅色名錄》極危類群，又被國家林業(yè)和草原局列為“極小種群保護(hù)物種”[8-9].不僅在中國，世界范圍內(nèi)大黃花蝦脊蘭的形勢同樣不容樂觀，日本已將大黃花蝦脊蘭列入日本瀕危植物紅色名錄，瀕危等級定位EN[10]；韓國在1997年也將其列入稀有植物[11].因此，大黃花蝦脊蘭被形象地稱為“植物界的金絲猴”.

基于大黃花蝦脊蘭的觀賞價值、育種潛力以及生存現(xiàn)狀，亟需建立大規(guī)模繁殖技術(shù)和科學(xué)有效的保護(hù)方法.本試驗(yàn)以大黃花蝦脊蘭成熟未開裂的蒴果為研究材料，探討種子特性并對無菌播種過程進(jìn)行觀察，建立其初步的繁殖體系.用無菌播種快繁技術(shù)，可以在保持比無性繁殖更可變的基因庫的同時，產(chǎn)生大量的種苗[12]，為今后的育種工作和重新引入自然棲息地提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

于2016年4—5月每天對安徽野生大黃花蝦脊蘭居群花期進(jìn)行觀察和記錄，以柱頭上有花粉塊為標(biāo)準(zhǔn)確定自然授粉日期，用自然授粉后120～150 d成熟未開裂的蒴果作為研究材料.

1.2 方法

1.2.1 自然授粉有胚率統(tǒng)計(jì)及種子活力觀察 隨機(jī)選取授粉后120～150 d成熟未開裂的蒴果56個，解剖取出粉末狀種子，在Nikon-SMZ18型體視顯微鏡(日本Nikon公司)下統(tǒng)計(jì)一個視野內(nèi)的種子總數(shù)和有胚種子數(shù)(觀察到種子中部有黑色圓點(diǎn)的，即為有胚)，計(jì)算種子有胚率.取視野內(nèi)種子總數(shù)大于50的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)，6個重復(fù).

分別從120、130、140和150 d(花開放時掛牌記錄時間)的蒴果中隨機(jī)取出3個，取出種子，用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)進(jìn)行染色處理.染色過程中用錫紙包裹種子，于30 ℃避光條件下放置3 d，體視顯微鏡下隨機(jī)選取6個有效數(shù)據(jù)視野，對種子活力進(jìn)行觀察.在觀察種子活力時，將被TTC染色的種子分為無色、淺黃色、橙紅色和紅色4個范圍，將橙紅色和紅色確定為有活力的種子.

用Excel 2013和SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，分別統(tǒng)計(jì)蒴果有胚率和種子活力.有胚率和種子活力/%=有胚數(shù)(有活力種子數(shù))/種子總數(shù)×100.

1.2.2 種子表面滅菌、播種與培養(yǎng) 將篩選出的最佳活力的種子，即140 d的蒴果作為研究對象.蒴果用洗衣粉清洗5 min后置自來水下沖洗30 min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75%酒精表面消毒30 s，再用10%次氯酸鈉消毒15 min，最后用無菌水漂洗3次后放在無菌濾紙上吸干表面水分.縱向切開果莢，將種子均勻播種在萌發(fā)培養(yǎng)基表面，在黑暗條件下培養(yǎng)，記錄種子萌發(fā)時間，至種胚明顯膨大為白色透明圓球體后轉(zhuǎn)至光照度為1 000～1 500 lx的日光燈下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(24±2) ℃，平均光照時間為12 h·d-1.

表1 大黃花蝦脊蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)B系列配方 L9(34)正交設(shè)計(jì)1)Table 1 Orthogonal design scheme L9(34) for series B media used for the seed germination of C.striata

1)其他培養(yǎng)基成分為：2 g·L-1Hyponex 1+1/2 MS+0.37 mg·L-1MgSO4·7H2O+25 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1瓊脂粉+1.5 g·L-1活性炭+2 g·L-1牛肉粉蛋白胨，pH 5.7～5.8.

1.2.3 萌發(fā)培養(yǎng)基的配制 以6-BA(1.0、2.0、3.0 mg·L-1)、NAA(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)、KT(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)和有機(jī)添加物(50 g·L-1玉米、50 g·L-1土豆、50 g·L-1洋蔥)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)(表1)，以篩選較適合的培養(yǎng)基.為保證萌發(fā)培養(yǎng)基上種子基本特性一致，排除不同蒴果的種子有胚率和種子活力的差異對萌發(fā)試驗(yàn)的影響，故保證每一個果莢接種到9個處理的培養(yǎng)基中，同一個果莢每個處理接種3瓶，共用10個果莢，接種270瓶，每個處理30瓶.接種后放置在同樣條件下培養(yǎng)，每5 d觀測并記錄萌發(fā)情況.

1.2.4 種子萌發(fā)的觀察與統(tǒng)計(jì) 取樣：于無菌環(huán)境下隨機(jī)刮取一定量含已萌發(fā)種子的培養(yǎng)基于載玻片上，在體視顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì).

萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)：采用宏觀觀察法和微觀觀察法進(jìn)行萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì).先進(jìn)行表觀評估，比較萌發(fā)培養(yǎng)基不同組別生長狀況的差異，再進(jìn)行微觀觀察，在體視顯微鏡下進(jìn)行取樣和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì).統(tǒng)計(jì)出一個視野內(nèi)的種子總數(shù)、萌發(fā)種子數(shù)(以原球莖的形成視為萌發(fā)成功)，并觀察胚的發(fā)育情況，計(jì)算每個培養(yǎng)基的種子萌發(fā)率.每個種子每種培養(yǎng)基統(tǒng)計(jì)6個有效數(shù)據(jù)，用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.種子萌發(fā)率/%=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100.

1.2.5 轉(zhuǎn)接 待種苗葉片長至1 cm左右時，將其轉(zhuǎn)接至預(yù)試驗(yàn)中篩選出的較優(yōu)增殖壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng).因大黃花蝦脊蘭無菌播種的難點(diǎn)在于萌發(fā)，故專門設(shè)計(jì)萌發(fā)培養(yǎng)基，而增殖壯苗只需使用普通增殖壯苗培養(yǎng)基即可生長，配方為：1/2MS+1.0～3.0 mg·L-16-BA+0.5～1.0 mg·L-1KT+0.2～0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1瓊脂粉+1.5 g·L-1活性炭+50 g·L-1土豆泥+3 g·L-1牛肉粉蛋白胨.

1.2.6 移栽 于2018年4月3日篩選出苗高7 cm 以上的組培苗，將裝有組培苗的培養(yǎng)瓶放置在有遮蔭條件的溫室(溫度20～28 ℃)中煉苗，15 d后打開蓋子再煉苗2～3 d.移栽時，將取出的組培苗用自來水洗凈培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)中，移栽基質(zhì)中的火燒土∶樹皮為3∶1(體積比)，移栽前將移栽基質(zhì)浸泡于1 000倍的多菌靈中消毒滅菌15 min，保持基質(zhì)濕度，40 d后統(tǒng)計(jì)成活率.成活率/%=成活組培苗數(shù)/總數(shù)×100.

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的有胚率和活力

體視顯微鏡下觀測顯示，大黃花蝦脊蘭種子呈兩端稍尖的紡錘狀，種皮呈白色透明狀有內(nèi)外兩層，種皮細(xì)胞呈近長條狀四邊形，種子中間有一個細(xì)小圓球形種胚(圖1A).自然授粉后120～150 d的蒴果56個，有胚率為15.57%～95.66%，平均值為45.15%±2.68%(圖2).生長120 d的蒴果未完全成熟，87%的種胚呈半透明狀，無活性(圖1B)；130 d的蒴果有51%的種子有活性能被TTC染紅；140 d的蒴果基本成熟，76%的種子有活性能被TTC染紅，部分無活性，胚細(xì)小，在種腔中所占體積較小，完全成熟且有氣囊(圖1C)；150 d的蒴果種子形態(tài)與140 d的種子無明顯差別，但僅有63%的種子有活性能被TTC染紅，較140 d種子活性有所降低.

2.2 種子無菌萌發(fā)過程

觀測顯示，種子經(jīng)過120 d左右的培養(yǎng)，種胚吸水并膨脹變大，呈無色透明的圓球體，此時轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，一周后種皮一端脹破(圖1D、3A).140 d左右時胚由白色變成淡綠色球狀物，繼而形成原球莖，原球莖生出大量白色透明絨毛(圖3B)，150 d頂端分生出明顯的芽生長點(diǎn)，底部生出肉質(zhì)的不定根(圖3C、3D)，此時轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，180 d原球莖大量增殖，210 d后長成幼苗(圖3E、3F).

2.3 萌發(fā)結(jié)果

主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果表明：6-BA對種子萌發(fā)的影響顯著(P=0.001 2)；NAA、KT和有機(jī)添加物均對種子萌發(fā)的影響極顯著(P=0.000，P=0.000，P=0.000).表2顯示，在9組處理中，第3組的萌發(fā)率最高，為39.64%.對各因素R值進(jìn)行比較的結(jié)果表明，對種子萌發(fā)的影響程度從大到小排序?yàn)椋河袡C(jī)添加物、NAA、KT、6-BA.通過極差分析篩選出該系列的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為：2 g·L-1Hyponex 1+1/2 MS+0.37 mg·L-1MgSO4·7H2O+25 g·L-1蔗糖+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+5.5 g·L-1瓊脂粉+1.5 g·L-1活性炭+2 g·L-1牛肉粉蛋白胨+50 g·L-1洋蔥，pH 5.7～5.8.

培養(yǎng)基編號6-BA/(mg·L-1)(A)NAA/(mg·L-1)(B)KT/(mg·L-1)(C)有機(jī)添加物(D)萌發(fā)率/%11.00.20.250 g·L-1玉米12.61±2.57DEc21.00.50.550 g·L-1土豆4.26±0.06Ed31.01.01.050 g·L-1洋蔥39.64±3.34Aa42.00.20.550 g·L-1洋蔥24.78±0.85Bb52.00.51.050 g·L-1玉米5.11±0.31Ed62.01.00.250 g·L-1土豆11.12±0.65DEc73.00.21.050 g·L-1土豆22.56±1.09BCb83.00.50.250 g·L-1洋蔥15.47±0.20CDc93.01.00.550 g·L-1玉米6.01±0.28EdK156.5159.9539.2023.73D>B>C>AK241.0124.8435.0537.94最優(yōu)水平:A1B1C3D3K344.0456.7767.3179.89k118.8419.9813.077.91k213.678.2811.6812.65k314.6818.9222.4426.63R5.1711.7010.7518.72

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=5)；同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同小寫字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.4 組培苗移栽

大黃花蝦脊蘭喜溫暖濕潤的環(huán)境，較耐寒，不耐高溫和干旱.在2018年4月3日進(jìn)行移栽，移栽后遮蔭以避免強(qiáng)光直射，每隔一天澆透水一次并覆蓋透氣薄膜，保持土壤濕潤和空氣濕度，溫室大棚內(nèi)的溫度保持在20～28 ℃.移栽40 d后的成活率為95%(圖4).

3 討論

3.1 種子活力

種子活力是種子萌發(fā)的前提因素.隨機(jī)選取自然授粉不同成熟度的蒴果56個，有胚率為15.57%～95.66%，平均值為45.15%±2.68%，說明不同成熟度果實(shí)的有胚率存在差異.生長120 d的蒴果種子在TTC染色劑下部分胚呈白色透明狀，無活性；140 d的蒴果種子能被TTC染紅有活性，且活性最高，為76%；150 d的蒴果種子活性為63%.徐剛等[13]測定并比較蝦脊蘭屬9種植物種子的形態(tài)和大小，發(fā)現(xiàn)種子完全成熟需5個月以上；曾宋君等[14]對銀帶蝦脊蘭(Calantheargenteo-striata)進(jìn)行無菌播種研究，發(fā)現(xiàn)授粉90 d的種子還未發(fā)育成球形胚，尚不能萌發(fā)，授粉120 d的種子成熟度不高，萌發(fā)率低，授粉150 d的種子，萌發(fā)較好，說明種子成熟時間過長或過短都會影響種子的萌發(fā)，此結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相同.

3.2 激素和有機(jī)添加物對種子萌發(fā)的影響

一般來說，NAA和KT的主要作用是誘導(dǎo)根和愈傷組織的形成，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，與細(xì)胞分裂素一起應(yīng)用于誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長.6-BA主要是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長高，打破頂端優(yōu)勢，促進(jìn)叢生芽的形成和增殖，抑制根的生長.植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)添加物有椰汁、香蕉泥、土豆泥、洋蔥汁和玉米汁等，都是復(fù)雜的營養(yǎng)混合物，所含的化學(xué)成分不完全清楚，且成分不固定，但往往對培養(yǎng)的植物器官組織有一定的調(diào)節(jié)作用[15].有機(jī)添加物由于含有許多復(fù)雜、有效的成分而被廣泛應(yīng)用于蘭科植物的離體培養(yǎng)[16].不同含量NAA、6-BA、KT的組合產(chǎn)生的作用不同[17].曾宋君等[18]研究表明，低含量的NAA可以促進(jìn)墨蘭(Cymbidiumsinense)種子的萌發(fā)，而當(dāng)NAA和6-BA的含量大于0.5 mg·L-1時會對墨蘭種子非共生萌發(fā)起抑制作用.鐘雨薇[19]研究表明，6-BA對春蘭(C.goeringii)種子具有減輕抑制物質(zhì)抑制的作用，可打破種子休眠.張菊野等[20]研究表明，NAA有利于原球莖增殖與根的形成.一些有機(jī)添加物也有利于種子萌發(fā)和原球莖的生長.彭曉明等[21]曾報道，洋蔥汁和土豆泥能促進(jìn)墨蘭種子的萌發(fā)；也有研究表明，玉米汁有助于垂花蕙蘭原球莖根的形成[22].

本試驗(yàn)在大黃花蝦脊蘭種子萌發(fā)時使用了較高含量的6-BA(1.0～3.0 mg·L-1)和較低含量的NAA、KT(0.2～0.5 mg·L-1)，結(jié)果顯示，在6-BA含量為1.0 mg·L-1，NAA含量為1.0 mg·L-1，KT含量為1.0 mg·L-1時，種子萌發(fā)率最高，可達(dá)39.64%.不同有機(jī)添加物與不同配比的激素對種子萌發(fā)的影響存在一定差異，但不管與哪種激素配比，加洋蔥都明顯提高種子萌發(fā)率并促進(jìn)原球莖生長，且洋蔥具有緩沖培養(yǎng)基pH的作用.本試驗(yàn)篩選出相對較佳的培養(yǎng)基組合為：2 g·L-1Hyponex 1+1/2 MS+0.37 mg·L-1MgSO4·7H2O+25 g·L-1蔗糖+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+5.5 g·L-1瓊脂粉+1.5 g·L-1活性炭+2 g·L-1牛肉粉蛋白胨+50 g·L-1洋蔥，pH 5.7～5.8.玉米、洋蔥和土豆等有機(jī)添加物營養(yǎng)豐富，在一定程度上維持培養(yǎng)基的酸堿度，有利于蘭科植物的增殖和分化，但其營養(yǎng)成分復(fù)雜，影響種子萌發(fā)的機(jī)制和具體因素值得進(jìn)一步研究.

大黃花蝦脊蘭無菌播種的研究為離體保存提供參考，可為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持，還可以進(jìn)行原生地移栽以適度恢復(fù)種群規(guī)模.研究過程中發(fā)現(xiàn)的難點(diǎn)在于種子的萌發(fā)，無菌播種120 d后種胚突破種皮，光照下逐漸轉(zhuǎn)綠時將其轉(zhuǎn)接，20 d左右種胚即可正常發(fā)育成為原球莖，長葉生根.因此，種子萌發(fā)是重點(diǎn)要解決的問題，特別是在縮短種子萌發(fā)周期和提高萌發(fā)率上值得更進(jìn)一步的深入研究.

4 結(jié)論

大黃花蝦脊蘭種子的有胚率為15.57%～95.66%，平均值為45.15%±2.68%，授粉后140 d的蒴果種子活性最佳；種子萌發(fā)120、140 d后種胚突破種皮生長為原球莖，150 d頂端分生出明顯的芽生長點(diǎn)，底部長出肉質(zhì)的不定根；相對較佳的培養(yǎng)基組合為：2 g·L-1Hyponex 1+1/2 MS+0.37 mg·L-1MgSO4·7H2O+25 g·L-1蔗糖+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+5.5 g·L-1瓊脂粉+1.5 g·L-1活性炭+2 g·L-1牛肉粉蛋白胨+50 g·L-1洋蔥，pH 5.7～5.8，種子萌發(fā)率達(dá)39.64%±3.34%，褐化少，出苗率高.