基于UPLC- Q- TOF- MS對(duì)野馬追內(nèi)酯F在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析

秦偉瀚，劉 翔，王云紅，宋小仙，陽(yáng) 勇，李 卿

重慶市中藥研究院，重慶 400065

野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(EupatoriumlindleyanumDC.)的干燥地上部分[1]。又名白鼓釘、化食草等。除新疆以外廣泛分布于全國(guó)各地，其中江蘇省盱眙縣為該藥材的道地產(chǎn)區(qū)[2,3]。早在1988年江蘇省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)就已有收載，現(xiàn)收錄于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[4]。本品味苦、性平，歸肺經(jīng)，具有化痰、止咳、平喘之功效，常用于治療痰多、咳嗽、氣喘等病癥[5,6]。隨著對(duì)野馬追藥材研究的不斷深入，新近藥理報(bào)道還指出其具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[7- 13]。課題組前期通過(guò)對(duì)野馬追提取物研究發(fā)現(xiàn)，其降血脂效果與辛伐他汀相當(dāng)，部分藥理檢測(cè)指標(biāo)還優(yōu)于辛伐他汀，但起效物質(zhì)和起效過(guò)程尚不明確，阻礙了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

隨著高分辨質(zhì)譜在中藥化學(xué)領(lǐng)域的快速普及和發(fā)展，多重質(zhì)量虧損過(guò)濾(MMDF)技術(shù)在海量數(shù)據(jù)挖掘過(guò)程中優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)，對(duì)于目標(biāo)化合物篩查、藥物代謝及天然產(chǎn)物鑒定等方面具有越來(lái)越大的應(yīng)用空間。借助超高效液相色譜- 飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC- Q- TOF- MS)技術(shù)，分析中藥復(fù)雜成分和中藥代謝[14]，能夠省略分離純化過(guò)程的同時(shí)鑒定痕量的藥物及其代謝產(chǎn)物；同時(shí)，在藥物代謝物篩選與表征過(guò)程中，具有去除背景離子干擾，排除假陽(yáng)性，提高分析效率等諸多明顯優(yōu)勢(shì)。倍半萜內(nèi)酯是野馬追的主要特征性成分，野馬追內(nèi)酯F(eupalinolide F)在倍半萜成分中含量較高，故本研究以探究大鼠血漿中野馬追內(nèi)酯F的代謝產(chǎn)物為目標(biāo)，采用高分辨質(zhì)譜，基于多重質(zhì)量虧損和動(dòng)態(tài)背景扣除技術(shù)，系統(tǒng)分析了野馬追內(nèi)酯F在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，為明確野馬追藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及深入開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

1.1.1 儀器

LC- 30A型超高效液相色譜儀(日本，島津公司)：二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;Triple TOFTM4600型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB公司)：Analyst 1.6工作站、PeakView 1.2.0.3數(shù)據(jù)處理軟件、MetabolitePilot 1.5.0.8532代謝產(chǎn)物鑒定軟件;DW- 86L486型超低溫冰箱(中國(guó)，中科美菱公司)；Microfuge 20R型超高速離心機(jī)(美國(guó)，貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，10只，雄性，體重200±20 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2012- 0006，動(dòng)物合格證號(hào)0003054。動(dòng)物飼養(yǎng)于重慶市中藥研究院藥化所，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境(溫度20～25 °C，濕度50%～65%)，自由攝食和飲水；并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷。

1.1.3 藥材與試劑

野馬追內(nèi)酯F對(duì)照品為自制，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)歸一化法測(cè)定，純度>95%。乙腈、甲醇、水(色譜純級(jí)，德國(guó)Merck公司)；甲酸(色譜純級(jí)，美國(guó)ACS公司)；乙醇(分析純，重慶川東化工公司)。

1.2 野馬追內(nèi)酯F灌胃給藥

取SPF級(jí)SD大鼠10只，飼養(yǎng)3天后禁食12 h，自由飲水。按照10 mg/kg體重劑量灌胃，分別于給藥后30、60、90、120、180、240 min眼眶靜脈叢取血0.5 mL于裝有肝素鈉的EP管中，于10 625×g離心10 min取上層血漿，- 80 °C冰箱保存，備用。

1.3 樣品采集與處理

按照采血時(shí)間點(diǎn)，精密吸取10只大鼠血漿樣品各50 μL于1.5 mL EP管中，加入色譜甲醇600 μL后渦旋混勻2 min，于10 625×g離心10 min，分別吸取上清液和空白對(duì)照液2 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC- Q- TOF- MS分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna- C18(2 mm×100 mm,3 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度程序：0～2.0 min，6%B；2.0～10.0 min，6%～80%B；10.0～12.0 min，80%B；12.0～12.1 min，80%～6%B；12.1～15.0 min，6%B；流速：0.2 mL/min，柱溫：30 °C，進(jìn)樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓(IS)：- 4 500 V；霧化氣壓力(GS1)：50 Psi；氣簾氣壓力(CUR)：15 Psi；輔助氣壓力(GS2)：45 Psi；離子源溫度(TEMP)：600 oC；簇裂解電壓(DP)：55 V；碰撞能量(CE)：40 V；碰撞能量滾動(dòng)區(qū)間(CES)：15 V；檢測(cè)模式為IDA(信息關(guān)聯(lián)采集模式)，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級(jí)的條件，滿足該條件優(yōu)先進(jìn)行二級(jí)掃描。

1.5 代謝產(chǎn)物分析鑒定

查閱野馬追化學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)，采用ChemDraw軟件建立野馬追內(nèi)酯F的mol格式文件，導(dǎo)入PeakView軟件，結(jié)合Formula Finder、Mass Calculators等功能，對(duì)野馬追內(nèi)酯F標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品進(jìn)行定性分析，并將上述結(jié)果代入MetabolitePilot軟件，對(duì)該化合物產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 野馬追內(nèi)酯F質(zhì)譜鑒定分析

采用UPLC- Q- TOF- MS對(duì)野馬追內(nèi)酯F標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品進(jìn)行分析。如圖1B、圖2所示，野馬追內(nèi)酯F在ESI負(fù)離子模式中的母離子[M- H]-的質(zhì)荷比為m/z419.173 4，經(jīng)質(zhì)譜電離裂解作用分別脫去116.051 7、176.072 3、220.063 4、264.089 1、304.133 3 Da生成質(zhì)荷比為m/z303.121 7、243.101 1、199.110 0、155.083 4、115.040 1的碎片離子，利用PeakView軟件的Mass Calculators功能計(jì)算出C5H8O3、C7H12O5、C12H12O4、C14H16O5、C17H20O的理論值分別為116.046 8、176.067 9、220.073 0、264.099 2、304.130 5 Da，與脫去碎片的實(shí)際值之差均小于0.01 Da。通過(guò)上述對(duì)二級(jí)碎片裂解規(guī)律的分析并結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，判定該化合物應(yīng)為野馬追內(nèi)酯F。

將野馬追內(nèi)酯F分子式(C22H28O8)代入PeakView軟件的XIC Manager篩查表中對(duì)該化合物保留時(shí)間、強(qiáng)度等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行提取處理；由圖1A、1C可知，有效部位在5.872 min處有超過(guò)200 000 cps響應(yīng)，而血漿樣品在5.888 min處有接近10 000 cps響應(yīng)，進(jìn)一步對(duì)其MS/MS碎片進(jìn)行比較分析(如圖1B、1D)，發(fā)現(xiàn)兩者的裂解碎片質(zhì)荷比基本一致，據(jù)此判斷血漿樣品中含有野馬追內(nèi)脂F(xiàn)。由初步的量時(shí)曲線(圖3)可以看出，采血時(shí)間為灌胃后30 min時(shí)，血漿樣品中野馬追內(nèi)酯F離子強(qiáng)度為8 773 cps；

圖1 野馬追內(nèi)酯F的提取離子圖和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Extraction ionogram and secondary mass spectrogram of eupalinolide F注：A.對(duì)照品提取離子圖；B.對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖；C.血漿樣品提取離子圖；D.血漿樣品二級(jí)質(zhì)譜圖。Note:A.XIC of effective fraction;B.MS/MS of effective fraction;C.XIC of plasma;D.MS/MS of plasma.

圖2 野馬追內(nèi)酯F裂解規(guī)律圖Fig.2 Pyrolysis chart of eupalinolide F

圖3 野馬追內(nèi)酯F量時(shí)曲線圖Fig.3 Mass spectrometric response intensity and time curve of eupalinolide F

當(dāng)采血時(shí)間為60 min時(shí)，野馬追內(nèi)酯F的血藥濃度達(dá)到最大值；之后直到240 min，血漿樣品中野馬追內(nèi)酯F離子強(qiáng)度逐漸降低。由上述數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，入血后野馬追內(nèi)酯F的離子強(qiáng)度可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的1/20，可能與該藥物吸收代謝特性以及血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)等因素相關(guān)。

2.2 野馬追內(nèi)酯F在大鼠體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化分析

采用ChemDraw軟件建立野馬追內(nèi)酯F的mol格式文件，導(dǎo)入MetabolitePilot軟件中，獲取該化合物理論裂解參數(shù)，再將標(biāo)準(zhǔn)品的Q- TOF數(shù)據(jù)作為血漿樣品的參比對(duì)照導(dǎo)入該軟件，以2.2項(xiàng)下的保留時(shí)間、二級(jí)碎片等分析結(jié)果對(duì)野馬追內(nèi)酯F實(shí)際質(zhì)譜信息進(jìn)行篩選匹配，建立該化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)；MetabolitePilot軟件會(huì)自動(dòng)對(duì)以野馬追內(nèi)酯F為母核的所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析處理，再結(jié)合相應(yīng)代謝產(chǎn)物的二級(jí)碎片裂解規(guī)律進(jìn)行補(bǔ)充鑒定，代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果見(jiàn)表1、圖4。

通過(guò)大鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化分析研究，以野馬追內(nèi)酯F為原型共鑒定出了55個(gè)代謝產(chǎn)物，其中I相代謝包括氫化、氧化、酯鍵水解、成酮、脫氧、甲基化、去甲基等12種反應(yīng)類型；II相代謝包括葡萄糖苷結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合、乙酰化、磷酸酯化、硫酸酯化、谷胱甘肽結(jié)合、半胱氨酸結(jié)合、谷氨酰胺結(jié)合、硫磺酸結(jié)合等10種反應(yīng)類型；發(fā)生兩次以上代謝過(guò)程均包含水解反應(yīng)，與化合物原型含有兩個(gè)酯鍵和一個(gè)內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)特征相符；I相代謝中氧化反應(yīng)較多，可以是單純加氧或成酮，而還原反應(yīng)以不飽和雙鍵加氫為主；單獨(dú)的II相反應(yīng)只有谷胱甘肽結(jié)合(M9)、葡萄糖醛酸結(jié)合(M10)和乙酰化(M12)，其余17個(gè)發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)的II相代謝產(chǎn)物均伴隨了I相水解反應(yīng)。由此可見(jiàn)I相反應(yīng)過(guò)程通過(guò)氧化、還原、水解在野馬追內(nèi)酯F分子結(jié)構(gòu)中引入或脫去功能基團(tuán)從而發(fā)揮藥效活性或失去活性；II相反應(yīng)則通過(guò)與內(nèi)源性物質(zhì)經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合，生成極性大、水溶性高的結(jié)合物，經(jīng)尿液排泄。

表1 野馬追內(nèi)酯F代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號(hào)No.保留時(shí)間tR(min)代謝過(guò)程Metabolic reaction分子式Formula測(cè)量值Measurde mass (m/z)偏差Deviation(ppm)峰面積Peak Area得分Score(%)M415.36Loss of C2H2O2C20H26O6361.163 8-4.1136 00087.0M425.40Demethylation and HydrogenationC21H28O8407.170 3-2.192 70077.4M435.48Loss of C2H2O and C5H6O3C15H20O4263.125 5-2.887 60077.6M445.58Loss of C2H2O2+Bis-DemethylationC18H22O6333.134 81.4115 00075.0M455.74Loss of C5H6O2C17H22O6321.131 0-0.367 80081.8M465.81Loss of C17H20O5+Glutamine ConjugationC10H16N2O5243.098 70.295 60059.3Parent5.88Metabolite prototype C22H28O8419.169 7-3.456 90093.8M475.91Loss of C2H2O+Loss of WaterC20H24O6359.147 6-1.757 90093.1M485.96Loss of C5H6O3 and O+Demethylation and Methylene to KetoneC16H18O5289.107 9-0.9136 00076.6M496.08MethylationC23H30O8433.189 31.8127 00073.4M506.08Loss of C2H2O and C5H6O3+Sulfate ConjugationC15H20O7S343.083 2-0.4126 00047.8M516.29Loss of O and C2H2O2+Demethylation and Glucuronide ConjugationC25H32O11507.188 32.289 70050.7M526.34Loss of O and C2H2O2+AcetylationC22H28O6387.191 82.1170 00064.7M536.83Loss of C2H2O and C5H6O3+MethylationC16H22O4277.141 3-1.675 60071.0M547.04Loss of C2H2O2 and C5H6O3+Di-HydrogenationC15H24O3251.161 4-1.5119 00044.4M557.57Loss of O and C2H2O2+MethylationC21H28O5359.169 3-4.6106 00056.7

圖4 野馬追內(nèi)酯F代謝過(guò)程圖Fig.4 Metabolic process diagram of eupalinolide F

3 結(jié)論

本研究進(jìn)行了野馬追內(nèi)酯F的大鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化分析，共鑒定出了55個(gè)代謝產(chǎn)物，其中I相水解反應(yīng)是主要代謝過(guò)程；在血漿中檢出的野馬追內(nèi)酯F離子強(qiáng)度可以達(dá)到灌胃標(biāo)準(zhǔn)品的1/20，表明該化合物的吸收程度較高，但該化合物起效過(guò)程和起效機(jī)制尚不明確，課題組擬后續(xù)通過(guò)血漿蛋白結(jié)合率、藥代動(dòng)力學(xué)、P450酶體外代謝等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討。野馬追的主要化學(xué)成分包括黃酮、萜、生物堿、甾醇等類成分[15,16]，其中野馬追內(nèi)酯F是屬于吉馬烷型倍半萜類的一種，是野馬追主要特征有效成分，據(jù)筆者統(tǒng)計(jì)，野馬追萜類成分包括二萜、倍半萜和三萜，該類化合物共計(jì)38種之多[17]，而市面上銷售的純品僅野馬追內(nèi)酯A、野馬追內(nèi)酯B和野馬追內(nèi)酯H，想要對(duì)該類化合物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行逐一分析鑒定，存在著較大困難，本研究基于前期對(duì)野馬追內(nèi)酯F進(jìn)行的分離、純化工作，在利用高分辨質(zhì)譜對(duì)野馬追內(nèi)酯F化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性解析基礎(chǔ)上，采用MetabolitePilot軟件對(duì)野馬追內(nèi)酯F的所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速分析鑒定，為明確野馬追的體內(nèi)起效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新思路，也為野馬追的新藥開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用等提供科學(xué)參考。