阿爾茨海默病早期診斷的生物標志物研究進展

謝文然 ，丁旭科 ，李遇春，傅 攀，王志敏，龔莎莎 *

（1.臺州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.臺州市第一人民醫(yī)院，浙江 臺州 318000）

0 引言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性記憶減退、認知功能障礙以及其他神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。AD是癡呆中最常見的類型，并且在老年人中的發(fā)病率隨著年齡的增長而升高。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的一項報告顯示，全球現(xiàn)有約5 000萬癡呆患者，其中AD患者占60%～70%。根據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測，2050年全球AD患者可能超過1.52億［1］。

美國國家衰老研究院和阿爾茨海默病協(xié)會（NIA-AA）共同發(fā)布的AD最新診斷指南將AD分成了三個階段，即臨床前AD階段、輕度認知損害（MCI）階段和癡呆階段［2］。AD病因未明，尚無良好的預(yù)防手段，目前僅有針對該病癥的緩解藥物，沒有有效的治療途徑來阻止甚至延緩癡呆病程的進展［3］。因此，AD的早期診斷已成為AD防治工作的重點。AD的臨床診斷耗時繁瑣，需要結(jié)合臨床評估、心理測試、影像學(xué)檢查等，以排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病［4］。最新指南明確將生物標記物作為AD臨床診斷的指標［5］，尤其在AD發(fā)病早期，幾乎是唯一手段［6］。

因此，尋找高敏感性和特異性的生物標志物用于早期診斷是目前AD研究領(lǐng)域的重要目標。本文利用 Pubmed、Medline、CNKI、萬方等中英文數(shù)據(jù)庫，通過對“阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease）、早期診斷（Early diagnosis）、生物標志物（Biomarkers）”等關(guān)鍵詞的檢索，收集了2010年1月到2019年10月期間的相關(guān)文獻資料，就目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用或處于研發(fā)階段的AD生物標志物研究進展情況展開綜述。

1 AD早期診斷的生物標志物

Aβ沉積形成的老年斑（senile plaques，SPs）和Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）是AD的主要病理變化［7］。AD具體致病機制尚未明確，目前被國內(nèi)外公認的主要學(xué)說包括：β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）異常沉積學(xué)說、Tau蛋白過度磷酸化學(xué)說、免疫炎性反應(yīng)學(xué)說、線粒體功能紊亂學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等［8］329［9］?；贏D分子致病機制的研究，越來越多的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，如表1所示：

1.1 前β淀粉樣蛋白代謝標志物

Aβ由前β淀粉樣蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）水解產(chǎn)生，APP是一種跨膜神經(jīng)元蛋白，當(dāng)APP代謝異常時，Aβ生成增多或清除減少均會造成其大量沉積［22］，隨后引起膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增強、線粒體功能障礙、細胞凋亡以及膽堿神經(jīng)元末梢異常等連鎖反應(yīng)［9］。Aβ在體內(nèi)主要以Aβ42、Aβ40兩種形式存在［22］。在臨床癥狀出現(xiàn)前，AD患者腦脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）中的Aβ42濃度就已下降，而Aβ40水平略微增加或不變［11］656［23］。也有研究者認為，由于神經(jīng)退行性疾病的復(fù)雜性及個體間Aβ水平差異，單一CSF的Aβ42測定并不完全適用于AD早期診斷［11］656［24］，計算CSF的Aβ42/Aβ40比值能更好地提高AD早期診斷靈敏度與精確度，以區(qū)別其他神經(jīng)退行性疾病［11］656［25］。AD患者大腦的APP代謝異常也可反映在血小板中，血小板含有中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)APP代謝所需的酶，是外周血循環(huán)中Aβ的重要來源［26］。APP130kDa/APP110kDa即血小板前β淀粉樣蛋白亞型比（amyloid precursor protein forms ratio，APPr）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種有望用于AD早期診斷的生物標志物［27］。AD患者血小板的APPr與非癡呆老年人相比顯著下降［13］1042。APPr預(yù)測MCI進展為AD的靈敏度及特異度均為75%，但APPr最終是否可以作為AD早期診斷的生物標志物仍需要大量樣本試驗［27］。

Aβ以單體、寡聚體和纖維等不同狀態(tài)存在于人體中，其中寡聚體Aβ是導(dǎo)致AD中認知功能障礙和神經(jīng)退變的重要因素［28］。Aβ寡聚體按分子量和聚集狀態(tài)不同可分為二聚體、三聚體、四聚體、Aβ*56、球狀結(jié)構(gòu)寡聚體以及鏈狀結(jié)構(gòu)寡聚體，然而具體何種Aβ寡聚體對AD造成的神經(jīng)元毒性最強仍沒有定論［28］。研究發(fā)現(xiàn)，AD及MCI期患者CSF中的Aβ高分子寡聚體濃度顯著高于非癡呆老年人，Aβ高分子寡聚體既可以作為AD診斷的標志物，也可以作為反應(yīng)疾病進展程度的潛在生物標志物［14］2716。

1.2 病理纏結(jié)標志物

Tau蛋白是由MAPT編碼的微管相關(guān)蛋白，可結(jié)合并穩(wěn)定神經(jīng)元中的微管，降低微管蛋白分子的解離，并誘導(dǎo)微管成束［29］5。Tau發(fā)生過度磷酸化時，缺乏對微管的親和力，自身締合成成對的螺旋絲結(jié)構(gòu)，最終形成NFTs，造成神經(jīng)元損傷，使患者認知功能下降［7］。AD及臨床前期AD患者CSF的總Tau蛋白（Total Tau protein，T-tau）濃度較非癡呆老年人顯著升高，AD患者CSF的T-tau平均濃度增加1.5倍［30］。高濃度的CSF T-tau可反映神經(jīng)元變性的強度及MCI向AD的進展程度［31］。但在其他神經(jīng)退行性疾病如克雅氏病、腦中風(fēng)中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的CSF T-tau，其中克雅氏病CSF T-tau濃度較AD高10～20倍［32］830。應(yīng)用CSF T-tau/Aβ42比值區(qū)分AD與其他類型癡呆也具有高度的準確性，診斷AD的靈敏度達95%，特異度超過84%［33］。

NFTs的主要成分是過度磷酸化Tau蛋白（phosphorylated tau protein，P-tau）及其聚集物，AD患者腦中蛋白磷酸酯酶（PP2A）活性受抑制，Tau蛋白的多個位點受GSK-3β、CDK-5及其活性亞基P25調(diào)控發(fā)生磷酸化，形成P-tau［29］7［34-35］。AD患者CSF的P-tau濃度升高較T-tau濃度升高更具特異性，可反映NFTs負荷程度及Tau蛋白磷酸化狀態(tài)，更適合作為AD早期診斷的生物標志物［36］。由于磷酸化位點差異，目前已報道的P-tau主要有P-tau181、P-tau231、P-tau199、P-tau235等，其中CSF的P-tau181、P-tau231、P-tau199有助于鑒別AD與其他神經(jīng)退行性疾病及非癡呆疾?。?7］。此外，也有將CSF的P-tau181濃度升高聯(lián)合Aβ42濃度降低用于預(yù)測MCI進展為AD［38］。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關(guān)標志物

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病通常存在蛋白質(zhì)的異常沉積，軸突和神經(jīng)元的損傷以及膠質(zhì)細胞增生等變化。AD患者CSF中神經(jīng)絲蛋白（AD7c-NTP）、神經(jīng)絲輕鏈蛋白（NFL）、類視錐蛋白1（VLP-1）、心型脂肪酸結(jié)合蛋白（hFABP）等不同程度的升高被認為可能與AD的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)［10］673。AD7c-NTP是一種跨膜磷蛋白，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AD7c-NTP的過表達可導(dǎo)致神經(jīng)炎及神經(jīng)元損傷［15］1498。已有研究顯示AD組尿液AD7C-NTP濃度高于正常對照組，尿液AD7c-NTP水平在預(yù)測AD和MCI中β淀粉樣蛋白沉積方面具有高靈敏度和特異性［15］1498［39］93。

VLP-1是一種神經(jīng)元鈣傳感蛋白，參與突觸塑造相關(guān)的信號通路。Ca2+穩(wěn)態(tài)改變，可引起CSF中VLP-1濃度增加，導(dǎo)致含VLP-1的神經(jīng)元損傷［40］。NFL是構(gòu)成神經(jīng)細胞軸突中間絲的蛋白，其為軸突提供結(jié)構(gòu)支持并調(diào)節(jié)軸突直徑，影響神經(jīng)傳導(dǎo)的速度。當(dāng)神經(jīng)元或軸突損傷時，NFL釋放到CSF及血液中［41］。Olsson等的meta分析顯示AD患者CSF中的VLP-1濃度及NFL濃度均高于非癡呆老年人［10］681。此外CSF VLP-1，血漿NFL已被證明可用于預(yù)測MCI向AD進展，然而這些標志物是否可用于AD患者的早期診斷及預(yù)后監(jiān)測還需進一步的研究來證實［32］836。

hFABP在大腦中高度表達，其參與軸突的形成與突觸塑造［42］。一項meta分析［10］676表明AD患者CSF的hFABP濃度顯著高于非癡呆老年人。此外，Guo等人［42］發(fā)現(xiàn)MCI與AD患者CSF中的hFABP沒有顯著差別，他們推斷CSF中的hFABP濃度可能在AD早期就已增加，hFABP水平可能具有早期診斷AD的潛力。

1.4 膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)相關(guān)標志物

免疫炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，大量積蓄的Aβ激活小膠質(zhì)細胞釋放炎性因子如白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）以及人類軟骨糖蛋白-39（YKL-40）［43］，持續(xù)暴露于細胞因子的神經(jīng)元發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化［8］329［43］。另有一項 Meta 分析表明，AD 患者CSF的TGF-β和YKL-40水平與對照組相比顯著升高，而CSF IL-6、LI-8、IL-1β水平與AD則無顯著相關(guān)性［16］。

1.5 氧化應(yīng)激反應(yīng)生物標志物

氧化應(yīng)激被認為參與AD的發(fā)病過程，且與Aβ的存在密切相關(guān)。Aβ可通過多種途徑誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，損傷線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)，大量Ca2+進入胞質(zhì)，使細胞Ca2+超載，引起細胞器受損，神經(jīng)元凋亡［8］337-338。有研究表明AD病人富含Aβ的大腦區(qū)域，存在高濃度蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的氧化產(chǎn)物［44］。García-Blanco等通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法分析來自MCI和AD患者的尿液樣品，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、異前列腺素（Isporostanes，IsoPs）等在病例組和對照組之間存在差異，揭示上述過氧化物可能是潛在的早期AD生物標志物［17］。

1.6 遺傳易感標志物

遺傳易感標志物（基因）檢測可以識別遺傳缺陷，早期預(yù)測和發(fā)現(xiàn)AD。迄今為止已定位數(shù)百個與AD發(fā)病相關(guān)的基因突變位點，其中位于21號染色體（21q21.1）的APP基因突變、位于14號染色體（14q24.3）的早老素-1（PSEN1）基因突變、位于1號（1q42.1）的早老素-2（PSEN2）基因突變顯性遺傳AD早發(fā)的主要因素。三種易感基因在人群中的突變率較低，致病性突變大多發(fā)生在重要的功能域［45］。利用PiB-PET、FDG-PET和MRI等影像學(xué)技術(shù)掃描上述三個基因突變攜帶者的腦部特定區(qū)域，評估腦部空間變化，可以初步估算平均發(fā)病年齡［46］。

1.7 其他標志物

MiRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達，主要參與神經(jīng)元的形成、分化和突觸塑造。已發(fā)現(xiàn)多種血清miRNAs在AD中差異表達，對AD的臨床分期起著重要作用［47］，其中miRNA-342-3p區(qū)分AD與非癡呆老年對照的敏感度和特異度分別為81.5%和70.1%［18］。

微量元素對于大腦發(fā)揮正常功能具有重要作用［32］835［20］353。Ferritin是人體主要的鐵儲存蛋白。分析ADNI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)AD、MCI及非癡呆對照人群CSF的Ferritin濃度無顯著差異，而Ferritin濃度增加與認知功能下降有關(guān)，并且可用于預(yù)測MCI向AD進展［19］。慢性鉛（Pb）暴露易對神經(jīng)產(chǎn)生毒性，是造成人類認知功能下降和死亡率增加的重要原因之一［20］353-354。已有研究利用單色X射線熒光法（M-XRF）檢測尿液Pb濃度探究尿鉛與AD的相關(guān)性，但實驗結(jié)果顯示，AD患者尿液Pb濃度與正常對照無顯著性差異［21］。

2 AD生物標志物的樣本來源及臨床應(yīng)用

2.1 腦脊液（CSF）

CSF充滿在各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)，具有緩沖、保護、運輸代謝產(chǎn)物和維持顱內(nèi)壓的作用。若中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變，神經(jīng)細胞代謝紊亂，將使腦脊液的性狀和成分發(fā)生改變，因此腦脊液是AD生物標志物的豐富來源，如圖1所示。目前，絕大部分的AD生物標志物研究都集中在CSF樣本來源，尤其是核心生物標志物T-tau、P-tau以及Aβ42已經(jīng)在AD患者鑒定中顯示了高敏感性和特異性［10］673［11］654，在尸檢確診的AD病人中也得到相同的結(jié)果［48］。有研究將CSF Tau/Aβ42比值與MRI檢查結(jié)果相結(jié)合，預(yù)測MCI轉(zhuǎn)化為AD的敏感性和特異性分別達到85%和96%［49］。然而，CSF的采集是一種侵入性的采樣方式，受試者順應(yīng)性較差，可能引起部分人群偶爾的不適或副作用，限制了其在AD早期人群中的推廣應(yīng)用［12］。

2.2 血液

AD病因復(fù)雜，AD患者大腦中Aβ、Tau蛋白的積聚總是伴隨著其他組織的病理生理變化［50］653。血液含有蛋白質(zhì)、多肽、核酸、脂質(zhì)和其他代謝物，且血液標本獲取方便、侵入性小，因此基于血液的生物標志物將有助于闡明AD的復(fù)雜性和異質(zhì)性，并且能提供一種快速、非侵入性且成本低廉的早期檢測策略［51］。隨著免疫沉淀、質(zhì)譜分析、單分子陣列等高靈敏技術(shù)的應(yīng)用，已有研究表明AD病人血漿Aβ42相較于正常對照及MCI期患者有下降的趨勢，Tau水平與正常對照相比升高且可能與AD病人認知功能下降相關(guān)［50］656-657。然而血液成分復(fù)雜，潛在的AD生物標志物以低濃度形式存在于血液中，發(fā)生于外周循環(huán)的系列生理反應(yīng)都可能限制基于血液的AD生物標志物的臨床應(yīng)用。

2.3 尿液

與受體內(nèi)平衡機制調(diào)節(jié)而穩(wěn)定的血液不同，尿液可以更早積累多種與疾病相關(guān)的代謝變化［52］。一項對腦部疾病的尿液生物標志物研究表明，尿液是腦部疾病生物標志物的潛在來源［53］。此外，尿液獲取無創(chuàng)便捷且可重復(fù)，有利于監(jiān)測疾病進展，是疾病早期生物標志物檢測的理想體液標本。已有研究顯示尿液AD7c-NTP水平在預(yù)測認知功能障礙患者的Aβ沉積方面具有高特異性和中度敏感性［39］91-93。然而，尿液組分代謝快，穩(wěn)定性不高，尿液生物標志物的檢測技術(shù)對設(shè)備和技術(shù)人員操作要求高限制了其在臨床的推廣。

2.4 唾液和鼻黏膜

唾液由唾液腺和黏液膜分泌，Tau蛋白在唾液腺中高度表達，APP和Aβ42在人唾液上皮細胞中表達［54］。唾液作為體液易于獲得，已有科研人員通過唾液來尋找AD相關(guān)生物標志物［55］。另外嗅覺功能障礙是各種神經(jīng)退行性疾病的早期和常見征兆，大約90%的AD患者存在嗅覺障礙［56］。有證據(jù)顯示，嗅覺障礙程度可用于預(yù)測患者從MCI轉(zhuǎn)化成AD的可能性［57］。在正常老年人中具有嗅覺障礙的患者認知下降得更快，并且與癡呆和神經(jīng)變性疾病的發(fā)病相關(guān)。因此，鼻黏膜可以成為AD生物標志物檢測的潛在樣本來源［58］。

3 展望

隨著人口老齡化的加劇，AD已成為影響人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。AD致病機制研究不斷深入，使得越來越多的生物標記物被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床。但是AD致病機制的研究仍有待深入，從SPs和NFTs的形成到神經(jīng)元的變性、死亡是一個極其復(fù)雜的過程，其中包含多種因素的相互影響。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等高通量組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，加速了新型生物標志物的研發(fā)。尤其是代謝組學(xué)，通過磁共振波譜和質(zhì)譜等技術(shù)，監(jiān)測代謝產(chǎn)物圖譜的動態(tài)變化，在篩選疾病相關(guān)生物標志物上顯示出較大優(yōu)勢，在闡明AD的分子致病機制及其導(dǎo)致的病理生理變化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

CSF是AD診斷的重要樣本來源，具有高特異性和敏感性。而血液、尿液、唾液和鼻黏膜等樣本來源的深入研究，將提高AD早期診斷的可操作性，利于臨床推廣應(yīng)用。針對現(xiàn)有生物標志物，開發(fā)AD新型診斷技術(shù)，建立標準化檢測方法，提高AD的鑒別診斷效率是AD研究仍需努力的方向。