RAG基因與B細(xì)胞淋巴瘤

朱 威，洪旭林，余佳偉，付 琴，毛崢嶸*

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.臨床一系;2.臨床二系，浙江杭州310029;3.病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江杭州310058)

B 淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟中，重組活化基因(recombination activating gene，RAG)在介導(dǎo)抗原受體決定區(qū)復(fù)雜多樣的DNA 重組中發(fā)揮著核心作用［1］。RAG1 和RAG2 基因在祖B 細(xì)胞和前B 細(xì)胞階段被激活，B 細(xì)胞成熟后失去功能。由RAG1 和RAG2蛋白組成的RAG 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定的重組基因片段，并將雙鏈DNA 切斷為兩條重組基因片段和兩條編碼序列，通過(guò)非同源性末端重組(non-homologous end joining，NHEJ)的方式互相結(jié)合［2］。重組過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)位、缺失或嵌入，與淋巴瘤的發(fā)生有密切相關(guān)［3－4］。本文綜合最新研究進(jìn)展，著重闡述這其中可能存在的一些機(jī)制。

1 RAG 基因、蛋白結(jié)構(gòu)及功能

RAG 基因包括RAG1 和RAG2。在人的基因組中，它們以尾對(duì)尾的結(jié)構(gòu)形式定位于11 號(hào)染色體短臂1 區(qū)3 帶(11p13)，其編碼區(qū)位于單獨(dú)的一個(gè)外顯子。兩個(gè)RAG 都有一個(gè)非編碼的外顯子，這可能是起源轉(zhuǎn)座子整合的宿主細(xì)胞序列，此外顯子后來(lái)進(jìn)化為淋巴系統(tǒng)特異性表達(dá)調(diào)控序列。在人的RAG2 中，有兩個(gè)變異剪切外顯子，分別是外顯子1A和1B。外顯子1A 構(gòu)成主要的起始位點(diǎn)，外顯子1B為次要起始位點(diǎn)。RAG1 蛋白包含核心區(qū)域和非核心區(qū)域。N 端非核心區(qū)域還包鋅結(jié)合二聚域(zincbinding dimerization domain，ZDD)，核心區(qū)域可分為3 部分:1)九聚體結(jié)合域(nonamer binding domain，NBD);2)中央域;3)C 端(C-term domain，CTD)。RAG2 已被鑒定的區(qū)域主要有3 個(gè):1)RAG2 核心組成的N 端，包含6 個(gè)杯狀二級(jí)結(jié)構(gòu)(Kelch-like motif;%96%94s);2)可變動(dòng)的鉸鏈區(qū);3)C 端非經(jīng)典種植同源域(plant homeodomain，PHD)。各部分結(jié)構(gòu)的功能如圖1 所示［4－5］。

由RAG1、RAG2 以及高遷移率族蛋白(high mobility group 1，HMG1)構(gòu)成的RAG 綜合體［6］，能特異性識(shí)別Ig 胚系基因中V、D、J 基因片段兩側(cè)的重組信號(hào)序列(recombination signal sequences，RSS)，這些信號(hào)序列由一個(gè)具有回文結(jié)構(gòu)的七聚物和一個(gè)富含A/T 的九聚物構(gòu)成，其間間隔12 或23 bp，正好能允許DNA 螺旋繞成一圈或兩圈，從而使七聚體和九聚體緊靠在一起。一次重組過(guò)程則由RAG 綜合體和分別間隔12 和23 bp的一對(duì)信號(hào)序列相互作用完成。在DNA 雙鏈斷裂后，七聚物和胚系基因片段被切斷，形成4 條DNA 末端:一個(gè)12 信號(hào)的末端，一個(gè)23 信號(hào)的末端還有兩條編碼末端。通過(guò)非同源性末端重組的方式，兩條信號(hào)末端結(jié)合在一起，兩條編碼序列結(jié)合在一起［4－5］。在NHEJ 過(guò)程中，Ku 蛋白先于DNA 末端結(jié)合，并吸引artemis-DNA-PKcs 核酸酶綜合體。由此打開(kāi)在RAG 斷裂過(guò)程中兩個(gè)編碼序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)［5］。由于遵守“12/23”規(guī)則，從而保證了基因片段連接的正確性。人類Ig 重鏈可變區(qū)基因大約有100 個(gè)V 片段，9 個(gè)J 片段，10 ～20 個(gè)D 片段，這些片段在胚系基因組染色體上是線性不連續(xù)的排列。在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，發(fā)生V(D)J 基因重排，產(chǎn)生具有功能的基因，是T 和B淋巴細(xì)胞成熟必不可少的［7］。

Ku80 通過(guò)NHEJ 方式修復(fù)DNA 雙鏈斷裂(DNA double-stranded breaks，DSBs)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中Ku80 單獨(dú)缺失不會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率的增加，但是當(dāng)Ku80 和P53 同時(shí)缺乏使RAG1 蛋白介導(dǎo)的DSBs 非同源性末端重組修復(fù)缺陷，導(dǎo)致IgH/c-Myc 基因易位，極大促進(jìn)了祖B細(xì)胞來(lái)源淋巴瘤的發(fā)生［8］。越來(lái)越多的研究表明，RAG 基因及其蛋白可通過(guò)RAG 綜合體在某些淋巴瘤的發(fā)生中起著重要的作用。

圖1 RAG1 和RAG2 蛋白的結(jié)構(gòu)及功能Fig 1 Structure and function of RAG1 and RAG2 protein

2 RAG 蛋白導(dǎo)致淋巴瘤的可能機(jī)制

2.1 RAG 綜合體直接作用于BCL-2 基因主要斷裂區(qū)的非一致性DNA 構(gòu)造

90%的濾泡性淋巴瘤存在14 號(hào)和18 號(hào)染色體之間的易位:14 號(hào)染色體的斷裂點(diǎn)位于免疫球蛋白重鏈區(qū)內(nèi)，故V(D)J 基因正常重組過(guò)程也隨之停止，18 號(hào)染色體上的斷裂點(diǎn)則位于BCL-2 基因上的一個(gè)150 bp 大小的特定的區(qū)域，稱作主要斷裂區(qū)(Major break point region，Mbr)［9］。Mbr 在第18 號(hào)染色體上是一個(gè)脆弱區(qū)域，為一種非一致性DNA 的構(gòu)造，這個(gè)非一致性DNA 的構(gòu)造在生物體內(nèi)是RAG 綜合體的靶位，很容易被RAG 綜合體切斷。免疫球蛋白12 和23 信號(hào)基因在BCL-2 主要斷裂點(diǎn)區(qū)域的下游。在免疫球蛋白重鏈基因V(D)J 重組的過(guò)程中，14 號(hào)染色體斷裂的兩條鏈的任一條鏈的末端都可以與BCL-2 主要斷裂點(diǎn)區(qū)域的任一鏈的末端接合，造成14 號(hào)和18 號(hào)染色體的易位，此重新聚合的過(guò)程完全依賴于DNA 連接酶Ⅳ［9－10］。

隨著對(duì)細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，BCL-2 基因的表達(dá)與調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵因素之一。由于染色體t(14:18)(q32:q21)易位，導(dǎo)致BCL-2 基因在細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)。BCL-2 蛋白借助其C 末端的疏水區(qū)域固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體外膜以及細(xì)胞核膜上，其N 端的跨膜區(qū)則參與抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程。BCL-2 蛋白抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore，PTP)開(kāi)放，阻斷細(xì)胞色素C 從線粒體釋放;可能阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中流動(dòng)，使依賴鈣離子的核酸內(nèi)切酶活性降低;亦可通過(guò)抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生［11］，最終抑制細(xì)胞凋亡，與濾泡性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

2.2 RAG1/2 和AID 協(xié)同作用引起染色體易位

目前已知的淋巴細(xì)胞成熟過(guò)程中雙鏈DNA 斷裂(DSB)主要有4 種方式:1)V(D)J 型:在B 淋巴細(xì)胞分化早期，其免疫球蛋白鏈VH(D)JH 基因要實(shí)現(xiàn)重組，首先需要RAG 核酸內(nèi)切酶切割DNA 特定位點(diǎn)的重組信號(hào)序列(RSS)［2］。2)類別轉(zhuǎn)換重組(class switch recombination，CSR):活化誘導(dǎo)脫氨酶(activation-induced deaminase，AID)存在于免疫球蛋白基因的體細(xì)胞高突變(somatic hypermutation，SHM)和CSR 中，它能作用于Ig 轉(zhuǎn)換區(qū)的R 環(huán)，導(dǎo)致活化的B 細(xì)胞發(fā)生DSBs［12］;3)隨機(jī)型［13］。4)CpG型40% ～70%的祖B/前B 細(xì)胞重組區(qū)的斷裂通過(guò)此種形式，特別是靠近BCL-2、BCL-1 和E2A基因的區(qū)域［14］。

AID 在次級(jí)淋巴器官的生發(fā)中心中特異性表達(dá)［15］，高度調(diào)節(jié)正常B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育，生發(fā)中心來(lái)源的B 細(xì)胞非霍杰金淋巴瘤(B-NHL)表達(dá)AID，AID 可促進(jìn)B-NHL 中異常DNA 重排和體細(xì)胞超突變［16］。濾泡性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤B 細(xì)胞分化中，先表達(dá)細(xì)胞內(nèi)初始階段末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)和人類重組激活基因RAG1 與RAG2，進(jìn)而表達(dá)AID，提示RAG可能與AID 相互作用導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)RAG 的靶效應(yīng)識(shí)別位點(diǎn)(off-target recognition)是由AID 經(jīng)序列修飾后產(chǎn)生的［14］:部分淋巴瘤的斷裂點(diǎn)富含CpG 二核苷酸，CpG 的胞嘧啶是甲基化的靶點(diǎn)，甲基化的C 去氨基轉(zhuǎn)變?yōu)門，非甲基化的C 去氨基轉(zhuǎn)變?yōu)閁，但T∶G 錯(cuò)配比U∶G錯(cuò)配更穩(wěn)定。T∶G錯(cuò)配后產(chǎn)生被RAG 蛋白識(shí)別的DNA 結(jié)構(gòu)。故AID 酶可能通過(guò)修飾甲基化CpG 序列，引起T∶G錯(cuò)配，從而為RAG 蛋白提供作用位點(diǎn)。但前提是B 細(xì)胞同時(shí)表達(dá)RAG 蛋白和AID 酶，故與CpG 有關(guān)的易位多發(fā)于祖B/前B 細(xì)胞來(lái)源的惡性淋巴瘤。發(fā)育中的B 細(xì)胞也是否同時(shí)表達(dá)AID 酶和RAG 蛋白有待進(jìn)一步研究。但值得一提的是，從骨髓中釋放出來(lái)的B細(xì)胞一旦被激活，可再次表達(dá)AID 酶和RAG 蛋白［17］，XRCC4 缺失的B 細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體易位:RAG蛋白作用在IgLλ 產(chǎn)生的DSBs 和AID 酶作用在IgH產(chǎn)生的DSBs 相互連接［18］。如果RAG 蛋白在活化的成熟B 細(xì)胞中能再次表達(dá)，同樣會(huì)導(dǎo)致AID 酶和RAG 蛋白的共同存在和相互作用。

2.3 RAG2 蛋白降解異常

哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過(guò)同源重組(HR)和非同源重組(NHEJ)兩種方式修復(fù)斷裂DNA 雙鏈(DSBs)。V(D)J 的重排是一種由RAG1/RAG2 蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的NHEJ。RAG 蛋白優(yōu)先通過(guò)經(jīng)典途徑介導(dǎo)V(D)J 的連接，當(dāng)RAG 突變導(dǎo)致重組能力減弱時(shí)，則通過(guò)替代途徑連接非同源末端(作用很小)或同源末端連接途徑［19］。在整個(gè)細(xì)胞周期中，RAG2 蛋白的含量不是一成不變的，而是在G0和G1時(shí)富集，并在G1向S 期轉(zhuǎn)變的過(guò)程中被迅速降解。因此，重組中間產(chǎn)物和RAG 信號(hào)末端復(fù)合物的作用被限制在G0和G1期。G1期向S 期轉(zhuǎn)變時(shí)，細(xì)胞周期蛋白A-Cdk2會(huì)使RAG2 蛋白的蘇氨酸490 磷酸化［4］，為泛素連接酶Skp2-SCF 提供結(jié)合位點(diǎn)［20］，從而使RAG2 蛋白被蛋白酶體降解。當(dāng)RAG2 蛋白的蘇氨酸490 位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，A-Cdk2 則不能起作用，Skp2-SCF 失去結(jié)合位點(diǎn)，此時(shí)RAG2(T490A)不僅在G0-G1期起作用，還會(huì)使S 期DNA 斷裂，而DNA的修復(fù)主要依靠HR 途徑，容易產(chǎn)生易位。因而Skp2 缺乏，RAG2 蛋白在G1-S 期不能被降解也會(huì)導(dǎo)致易位的發(fā)生［21］。故RAG2 的致瘤機(jī)制可能與其在錯(cuò)誤的時(shí)間表達(dá)，而這些異常和持續(xù)存在的RAG2 蛋白會(huì)導(dǎo)致V(D)J 的異常重排，加之P53 等抑癌基因的缺失，造成B 細(xì)胞異常增生，從而導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生［21］。

2.4 EB 病毒(Epstein-barr virus，EBV)的感染與RAG 的再表達(dá)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在B 細(xì)胞表達(dá)EB 病毒核抗原-1(EBNA-1)的轉(zhuǎn)基因小鼠易發(fā)生淋巴瘤［10］:在表達(dá)EBNA-1 小鼠的腫瘤前期樣本中BCL-xl 和RAG1、RAG2 基因被誘導(dǎo)表達(dá)，但是在EμEBNA-1 的轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤樣本中，RAG 蛋白并沒(méi)有增高表達(dá)。推測(cè)RAG 蛋白的表達(dá)調(diào)控失常增加了基因重組事件發(fā)生的概率，進(jìn)而導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定并最終引起腫瘤的發(fā)生。而B(niǎo)CL-xl 的誘導(dǎo)表達(dá)可能會(huì)是EBNA-1和BCL-2 轉(zhuǎn)基因中高發(fā)淋巴瘤的原因。同時(shí)BCL-xl 的表達(dá)又是IL-2 所引起。故為EBNA-1導(dǎo)致與EBV 相關(guān)的腫瘤發(fā)生提供線索及潛在的治療路線［10］。

總之，RAG 基因及其蛋白在淋巴瘤的發(fā)病中扮演著重要角色，特別是在濾泡性淋巴瘤中。RAG 基因和淋巴瘤相關(guān)性的深入研究，不僅為揭示淋巴瘤的分子發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，也在一定程度上為臨床靶向治療提供線索。

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