心肌細胞再生基礎(chǔ)研究與中醫(yī)藥探索

史建偉，惠逸帆，蔣寶平，李建萍，余 黎

心臟損傷基本功能與結(jié)構(gòu)單位發(fā)生改變并伴隨心肌細胞損害、流失、凋亡甚至壞死。臨床通過β受體阻滯劑等藥物及經(jīng)皮冠狀動脈支架植入術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)等方式延緩損傷、恢復正常血供是主要治療方法。中醫(yī)學認為這類疾病是由于心失所養(yǎng)、心氣不足、氣滯血瘀、心脈痹阻直至心陽虧虛，從而引起“心悸”“胸痹”“心衰”等各類心系疾病。臨床治療采用補益心肺、活血化瘀、益氣溫陽利水方法調(diào)暢氣血保護心臟。關(guān)于心肌細胞再生途徑、改善心臟病預(yù)后是這類疾病研究的熱點和難點，現(xiàn)綜述心肌細胞再生的研究現(xiàn)狀及相關(guān)動物模型，并探討中醫(yī)藥在心肌細胞再生的應(yīng)用和可能發(fā)揮的作用。

1 心肌細胞再生的可行性

傳統(tǒng)理論認為，心肌細胞在人類與大部分哺乳動物成年后處于終末分化狀態(tài)，無法對損傷進行自我修復。有研究表明心肌細胞再生有可能實現(xiàn)，包括人類在內(nèi)的哺乳動物心臟在正常衰老與疾病進程的損傷中具有一定程度的再生能力[1]。由于14C可結(jié)合分裂細胞DNA，有研究利用核爆后大氣中產(chǎn)生的14C整合至植物內(nèi)，被人類以食物鏈方式攝入，跟蹤標記14C的DNA，在檢測尸體中14C標記的心肌細胞后發(fā)現(xiàn)，人類心肌細胞自我更新率隨年齡遞減，一生中再生的心肌達45%，體現(xiàn)了人類心肌自我更新的巨大潛能[2]。Ieda等[3]通過心臟轉(zhuǎn)錄因子組合GMT(Gat、Mef2c與Tbx5)共轉(zhuǎn)染成功使心臟和皮膚中成纖維細胞重新分化為心肌細胞。有關(guān)新生兒心肌梗死[4]與胎兒心臟矯正手術(shù)[5]研究表明，新生兒心臟損傷后可實現(xiàn)功能性恢復并具有較高的再生潛能。人類心肌細胞的分化再生并非難以實現(xiàn)，在年齡與外界因素等影響下導致其生長更新速度相對緩慢，短期難以彌補心肌損傷導致的心功能不全，但在某些疾病的長期康復過程中具有現(xiàn)實意義。除再生進程緩慢外，纖維化、過度炎癥反應(yīng)和血管再生不足是再生過程的三大障礙[6]。

2 心肌再生的常用動物模型

通過生物模型模擬人類心臟功能是可行的方法，其過程需綜合考慮動物來源、價格、操作、實驗要求及與人類心肌分化生長方式相仿程度等因素。以心肌細胞壞死為主要病理表現(xiàn)的心肌梗死為例，大鼠是相關(guān)研究中應(yīng)用最廣泛的動物模型，其次是兔、雜種犬與小鼠[7]。斑馬魚與蠑螈作為脊椎動物，其卓越的再生本領(lǐng)為人類心肌再生提供了研究平臺；同時，斑馬魚作為已有15年心肌再生研究歷史的載體，具有通量高、價格適中、易于養(yǎng)殖、研究周期短、易操作等優(yōu)點，在相應(yīng)的研究中發(fā)揮了巨大的作用。現(xiàn)將不同種類的動物模型基礎(chǔ)研究進行概述。

2.1 哺乳動物的基礎(chǔ)研究 19世紀60年代，有學者在出生后的鼠類動物心肌細胞中觀察到較低程度的有絲分裂現(xiàn)象[8]。目前認為，哺乳動物發(fā)育過程及心肌損傷后的干細胞與原有心肌細胞是較確切的心肌來源，有研究者曾成功將體外分離的鼠源性胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分化為竇房結(jié)細胞、心房細胞、浦肯野細胞等不同的心肌細胞[9]。Porrello等[10]切除出生1 d的小鼠約15%的左室心尖后，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟基本功能在8周內(nèi)完全恢復，然而同樣的損傷模型在出生1周小鼠無法誘導出相同的結(jié)果。有研究認為，新生乳鼠心室部分切除后再生能力有限且主要以纖維化瘢痕形成為主，認為不同范圍的心尖損傷可能造成心臟再生差異[11]。由此可見，哺乳動物出生前后心肌分化作用最強，之后若通過人為干預(yù)可實現(xiàn)心肌再生能力的提高。

通過結(jié)扎某些哺乳動物冠狀動脈以阻斷血流可誘導相應(yīng)區(qū)域的心肌細胞缺血缺氧壞死，此時哺乳動物心臟組織以纖維瘢痕形成為主的炎癥免疫反應(yīng)和人類心肌損傷過程中的表現(xiàn)類似，研究者可進行直觀比較。

2.2 斑馬魚的基礎(chǔ)研究 Poss等[12]首先發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚的心臟再生能力。斑馬魚心臟雖然是兩腔室，但在細胞分子生物學方面與哺乳動物具有諸多相似之處，其基因組與人類基因組有高達87%的同源性，較多與人類基因功能相似的同源基因[13]。易于操作的遺傳分子及全生命周期的心肌再生能力使斑馬魚成為目前研究心臟再生的優(yōu)秀模型。

小鼠幼體心臟大范圍損傷后，心臟組織特異性因子失活而較快死亡，而切除20%左心室后的成年斑馬魚心臟損傷部位并非由瘢痕組織替代，首先出現(xiàn)血凝塊之后發(fā)生纖維沉積，心尖切除7 d后可在損傷區(qū)域檢測到增殖的心肌細胞，新生的心肌細胞逐漸生長并于14 d達到峰值，最終在60 d后達到心臟完全再生水平，心肌功能得到恢復[14]。斑馬魚心臟再生過程是心肌早期激活并發(fā)育的過程，斑馬魚的心肌再生能力有助于較好地了解和探索哺乳動物心臟再生機制。

2.2.1 心外膜研究 Cai等[15]發(fā)現(xiàn)T-box家族中tbx18標記的心外膜干細胞可轉(zhuǎn)化為心肌細胞。Kikuchi等[16]在電耦合切除斑馬魚心室壁后發(fā)現(xiàn)，再生過程中具備分裂能力的心肌細胞大量表達鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，而鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子受T-box家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，支持來自斑馬魚心肌再生研究中心外膜在修復心肌損傷中起到的作用。與小鼠類似，斑馬魚新生心臟中發(fā)現(xiàn)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)標記基因snail及twist，體現(xiàn)了斑馬魚損傷后新生心臟中心外膜來源細胞通過EMT形成冠狀動脈血管的過程[17]?？傊?，心外膜激活后可能不直接誘導心肌再生，而是以促進新生血管生長等方式間接發(fā)揮作用。

2.2.2 心內(nèi)膜研究 心肌再生過程中，毗鄰心肌層的心內(nèi)膜與心外膜同時被激活。切除斑馬魚心尖1～3 h后，原有的貼壁扁平細胞從心肌層脫落，轉(zhuǎn)化為圓形細胞并開始表達視黃醛脫氫酶2(retinal dehydrogenase 2，raldh2)，這種變化首先出現(xiàn)于全心，1 d后主要局限于損傷區(qū)域并持續(xù)約14 d，而心外膜raldh2的表達遲于心內(nèi)膜[18]。有研究表明，炎癥反應(yīng)導致的心肌細胞損傷可增加心內(nèi)膜細胞的滲透性，在raldh2作用下維A酸表達增加，切斷維A酸表達途徑后心肌無法再生[18]。有研究表明，心內(nèi)膜在嵌入心肌層或離心培養(yǎng)后具有分化為冠狀血管內(nèi)皮細胞的潛能[19]，值得持續(xù)關(guān)注。

3 心肌再生的相關(guān)機制

心肌再生受到多種因素與復雜機制的影響。目前研究方向雖然較多集中于干細胞的誘導分化，但同時開始拓展到其他方面。

3.1 干細胞的研究 有研究證實，通過干細胞移植與誘導分化提高心肌再生水平和心臟功能治療心臟疾病是可行且充滿前景的途徑[20-21]。其中，多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)包括誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)，骨髓源干細胞包括骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)等均在體外分化為心肌細胞[22-23]。利用干細胞進行心肌再生途徑主要包括經(jīng)典的外源性干細胞注射導入局部損傷區(qū)域和采取局部刺激以誘導自身內(nèi)源性心臟干細胞生長兩種方式。

3.2 細胞因子的調(diào)控 干細胞的誘導分化主要在各類細胞因子及通路信號調(diào)控中完成?？箟难?ascorbic acid，AA)誘導iPSCs向心肌細胞分化的作用強大[24]；在胎肝、腎臟和骨髓分化活躍的造血細胞中常有較高水平的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，而TGF-βⅡ可促進ESCs轉(zhuǎn)化為心肌細胞[25]；存在于心腦血管中的堿性成纖維細胞生長因子可調(diào)控細胞增殖、分化并激活心肌細胞，在BMSCs向心肌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[26]?？聜チ嫉萚27]分離出人外周血中的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，培養(yǎng)3 d后與大鼠心肌細胞共同培養(yǎng)，在血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等外源性細胞因子動員下，6 d后EPCs表現(xiàn)出心肌細胞特征與功能。一些與干細胞轉(zhuǎn)移分化有關(guān)的細胞生長因子如TGF-β、VEGF、肝細胞生長因子等均可激活與調(diào)控心臟干細胞生成心肌細胞[28-29]。

3.3 涉及的相關(guān)信號通路 Hippo-Yap信號通路對胚胎時期組織器官發(fā)育起著重要的作用，成年小鼠心肌細胞損傷時，通過Hippo-Yap通路再激活可使心肌細胞進入新的細胞周期，促進心肌細胞增殖，且不會對心臟功能造成有害影響[30]。有研究顯示，心臟發(fā)育過程中的Notch信號發(fā)揮促進心臟干細胞增殖分化與心肌修復再生作用，激活Notch信號通路可促進CSCs分化為心肌細胞，而Notch通路被阻斷后原有基礎(chǔ)心臟病病人極易并發(fā)擴張型心肌病[31]。此外，Wnt、骨形態(tài)形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等通路均不同程度參與心肌細胞的分化過程。除基因因素，心肌細胞修復與再生還受低氧環(huán)境、力學刺激等其他因素的影響。

4 中醫(yī)藥在心肌組織再生領(lǐng)域中作用的研究

現(xiàn)代醫(yī)學中各種原發(fā)性或繼發(fā)性心臟病在急性發(fā)作期或終末期歸屬于中醫(yī)學“心衰”范疇，病因分為先天不足(如先心病或遺傳性心臟病)、久病體衰(如老年病人心臟的退行性病變)、感受外邪(如病毒性心肌炎、感染性心內(nèi)膜炎)、飲食起居(如糖尿病心臟病)、七情所傷(如高血壓心臟病)、勞倦內(nèi)傷(如機體免疫力下降)等，這些因素相互影響夾雜，最終導致心臟損傷。治療各類心臟疾病除了應(yīng)用藥物治療以外，消除危險因素、接受健康教育與調(diào)節(jié)飲食起居同樣重要，中醫(yī)藥治療在這些方面發(fā)揮了一定的作用。

4.1 針灸的作用 手少陰心經(jīng)分布于兩臂上肢掌側(cè)面的尺側(cè)緣與小指的橈側(cè)端，起于極泉止于少沖，通過針灸手少陰心經(jīng)發(fā)揮治療心胸疾病的作用。李夢等[32]建立大鼠心肌梗死模型后發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的心肌壞死組織過量表達CD40配體與基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)，其中CD40配體導致MMP-9過表達，從而誘發(fā)急性冠脈綜合征，針刺預(yù)處理或治療性模擬針刺大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”后可降低CD40表達。已有大量臨床研究證實針灸治療心臟病的確切療效，可作為心肌梗死的輔助治療，但在疾病過程中減少心肌壞死、促進心肌再生作用的具體機制尚不明確。

4.2 中藥的研究 目前，中藥及其復方的藥理作用機制復雜，對促進心肌細胞分化具體作用靶點的認識不全面，傳統(tǒng)的養(yǎng)心方藥用于心臟損傷類疾病的治療和恢復具有悠久的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗，可能從中尋找合適的藥物?，F(xiàn)對部分相關(guān)中藥的研究進行概述并對其作用靶點進行討論。

4.2.1 調(diào)控T-box家族亞型的表達 Brachyury(T)基因作為一類獨特的轉(zhuǎn)錄因子于1927年首次被人們發(fā)現(xiàn)，T-box家族是一類具有同源DNA結(jié)構(gòu)域的基因匯總，其中tbx1、tbx2、tbx3、tbx5、tbx18與tbx20這6個亞型均參與心肌分化[33]。較成熟的tbx5在早期心臟發(fā)育過程中主要表達于胚胎中層，在心房、心室發(fā)育及心傳導系統(tǒng)的形成中發(fā)揮重要的作用。一定濃度的女貞子提取物齊墩果酸可增加tbx20的表達并降低氧化型低密度脂蛋白對細胞的損傷，對心肌再生作用有明顯影響[34]。中藥對T-box這類重要的心臟發(fā)育調(diào)控因子的研究值得深入開展。

4.2.2 影響TGF-β的表達 TGF-β是一類具有生物活性的多肽，傳統(tǒng)認為TGF-β在心肌細胞纖維化、肥大與心臟重構(gòu)過程中均發(fā)揮了作用。TGF-β1與TGF-β3均具有較強的致纖維化作用，而TGF-β2證實參與誘導心肌再生，對血管內(nèi)皮細胞和造血祖細胞的生長抑制作用僅為前兩者的1%左右，且致纖維化作用不強。臨床研究表明，具有溫陽益氣活血的中藥與制劑可抑制甚至逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。有研究將黃芪、丹參、三七、降香組成的芪參益氣滴丸以10-3g/L濃度干預(yù)心肌梗死大鼠發(fā)現(xiàn)，該制劑通過抑制TGF-β1激活的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，下調(diào)磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular regulated kinase，p-ERK1/2)水平，從而抑制成纖維細胞生長，但對經(jīng)典Smad通路影響不大[35]。巴戟天寡糖可上調(diào)TGF-β2表達，誘導成肌細胞向心肌樣細胞分化，其作用受劑量影響呈雙向調(diào)節(jié)[36]。早期心肌梗死過程中TGF-β具有一定的保護作用，通過中藥多靶點作用針對性地調(diào)控TGF-β，在心肌保護與再生方面具有重要作用。

4.2.3 刺激VEGF的分泌 VEGF可促進心肌微血管生成，為心肌再生提供物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥對VEGF的作用是多方面的。全反式維A酸作為維A酸的一類活性形式，不僅參與調(diào)控VEGF，并且減少大鼠成熟心肌母細胞株H9C2凋亡[37-38]。瓜蔞薤白半夏湯加入黃芪后具有化痰補氣之功效，通過增加心肌VEGF 蛋白與mRNA表達可明顯改善心肌壞死區(qū)供血[39]。有研究者將濃度為10-7mol/L的淫羊藿苷(Icariin，ICA)與MSCs體外共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該濃度ICA不僅引起MSCs高度表達心肌細胞分化過程中需要的一些特定基因，還可增加新生血管VEGF的分泌[40]。

4.2.4 活血化瘀療法 冠心病屬心肌缺血類疾病，中國古代多稱為“胸痹”，《諸病源候論》將其描述為“傷之而痛者，則朝發(fā)夕死，夕發(fā)朝死”，針對這類疾病中醫(yī)常采用活血化瘀療法[41]。

5 小 結(jié)

心肌細胞再生具有可行性與復雜性兼?zhèn)涞奶攸c：心肌細胞再生存在與功能不同步的矛盾性，不同生物個體之間心臟結(jié)構(gòu)與成分的差異性，時間與損傷部位不同步，具體機制的變化性等。心肌細胞再生效率有限，如何將損傷后的炎癥反應(yīng)限制在可控范圍，減少瘢痕生成或逆轉(zhuǎn)瘢痕，提高心肌再生率等問題是目前研究的難點?！暗雷枨议L，行則將至”，心肌再生應(yīng)用前景廣闊，將中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學進行有機結(jié)合，多角度、深層次探索，以期為心肌細胞丟失的心臟病病人尋找有效的治療途徑。