6株H9N2亞型禽流感病毒廈門分離株全基因序列測定與分析

蔡振鴻，趙 冉，陳 瓊，楊 濤，張丹英，陳永鋒，何揚州

（1.廈門市思明區(qū)市政管理中心，廈門 361005；2.廈門市動物疫病預(yù)防控制中心，廈門 361009）

禽流感（avian influenza，AI）流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近幾年H9N2亞型流感病毒（Avian influenza virus，AIV）檢出率居高不下。雖仍為低致病流感病毒特征，但宿主范圍廣，不僅可以感染家禽野禽，還突破種間屏障感染人和多種哺乳動物。早在1998年，就從豬體內(nèi)分離到H9N2亞型病毒[1]，1998～1999年香港、廣州出現(xiàn)4例人感染H9N2病例報道。不僅如此H9N2病毒還在流感病毒的進(jìn)化中扮演重要角色，1997年香港暴發(fā)的感染人H5N1、2013年國內(nèi)暴發(fā)的感染人H7N9及2014年感染人H10N8等亞型流感病毒，其內(nèi)部基因均來源于H9N2[2-4]。這種基因重組現(xiàn)象在H9N2亞型很普遍，很有可能形成新型流感病毒，成為下個流行的隱患。

2017年福建省廈門地區(qū)活禽屠宰場監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，H9N2亞型AIV檢出率位居首位。為掌握現(xiàn)行流行毒株的遺傳進(jìn)化特點，本研究將分離到的6株H9N2病毒進(jìn)行全基因測序、遺傳進(jìn)化及關(guān)鍵基因位點分析，旨在進(jìn)一步了解當(dāng)?shù)豀9N2流行株毒力特點，并為今后的禽流感防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 分離毒株6株分離株，其中5株分離自健康雞群，包括2015年9月分離自某活禽交易市場的A/Chicken/Xiamen/09/2015（H9N2）（簡稱XM09），2015年10月分離自某養(yǎng)殖場的A/Chicken/Xiamen/10/2015（H9N2）（簡稱XM10），以及2017年分離自某活禽屠宰場A/Chicken/Fujian/SD037/2017（H9N2）（簡稱FJ37）、A/Chicken/Fujian/SD056/2017（H9N2）（簡稱FJ56）和A/Chicken/Fujian/SD070/2017（H9N2）（簡稱FJ70）；1株分離自環(huán)境，為A/Environment/Fujian/S1XA35/ 2017（H9N2）（簡稱XA35）。

1.2 主要試劑與儀器HA禽流感病毒通用診斷試劑盒購自QIAGEN，H1-H16亞型分型診斷試劑盒購自碩世生物科技有限公司和深圳澳東檢驗檢測科技有限公司，核酸提取試劑（MagMAXTM-97Viral RNA）購自Thermo Fisher Scientific。熒光定量PCR儀購自RoCho，全自動核酸提取儀購自TECAN，SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，特異性引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 病毒的分離與測序2015年分離株XM09和XM10由本研究室熒光定量PCR分型檢測、雞胚分離純化，全基因擴(kuò)增，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。2017年分離株FJ37、FJ56、FJ70、XA35由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、分離純化及測序。

1.4 遺傳進(jìn)化分析利用Lasergene MegAlign軟件對同源性及關(guān)鍵位點進(jìn)行分析；采用MEGA5.2軟件對8個基因片段的遺傳分類進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的鑒定經(jīng)熒光PCR分型檢測及測序分析，6株分離株均為AIV H9N2亞型，全基因序列已上傳GenBank，其登錄號分別為MG204043～MG204058、MG192148～MG192178。

2.2 HA基因序列分析6株分離株的HA裂解位點位于氨基酸序列第333～338位，序列PSRSSRGL，符合低致病性禽流感病毒特征。受體結(jié)合位點分別位于氨基酸序列第109、161、163、191、198、202、203位，依次是Y、W、T、N、T、L、Y。這6株分離株與2000年以前的4個亞群代表株和2個疫苗代表株比較，存在多個位點的氨基酸突變，其中裂解位點第334位的氨基酸由非極性氨基酸A突變成極性氨基酸S；受體結(jié)合位點第198位氨基酸由A/E/V突變?yōu)門；受體結(jié)合位點左側(cè)緣第234位氨基酸（相當(dāng)于H3 第226位氨基酸）由Q突變?yōu)長，第235位氨基酸由Q突變?yōu)镸，這種突變有向人類感染的嗜性；右側(cè)緣第149位點均有突變，3株由K（R）突變?yōu)門，另外3株由K（R）突變?yōu)锳，見表1。

糖基化位點見表2，可見29、141、298、305、492、551位點高度保守，表中的12株H9N2亞型HA均具有這6個糖基化位點，而105、206、313位點容易發(fā)生突變。6株分離株均有7個潛在糖基化位點，且完全相同，與2000年以前的6株參考毒株比較，均缺失218位點，增加了313位點。

抗原位點分析見表3，2017年的4株分離株與2015年的2株分離株的7個抗原位點完全相同，但與目前疫苗株的抗原位點比較發(fā)現(xiàn)，位于第234（相當(dāng)于H3亞型第216位）、285、334位的抗原位點發(fā)生突變。

表1 HA裂解位點和受體結(jié)合位點的比較分析Table 1 Comparison of HA cleavage sites and receptor binding sites

表2 HA潛在糖基化位點的比較分析Table 2 Comparison of HA potential glycosylation sites

2.3 NA基因序列分析6株分離株NA基因編碼區(qū)全長均為1401 bp ，共編碼467個氨基酸，頸部均缺失9個核苷酸，分別編碼 63、64、65位T、E、I，屬于高致病性NA標(biāo)志。糖基化位點見表4，可見86、146、200、234位的糖基化位點高度保守，表中的12株H9N2亞型的NA均具有這4個糖基化位點；而61、69、70、264、306、368、402位的糖基化位點容易發(fā)生突變。本地的6株分離株與2000年前的參考毒株比較，均缺失61位的糖基化位點，增加了368位的糖基化位點。6株分離株之間的糖基化位點存在差異。2015年XM09株與2017年XA株35位糖基化位點相同，共6個糖基化位點；2017年FJ37、FJ56、FJ70株位糖基化位點相同，共7個糖基化位點，多出402位糖基化位點；而2015年XM10株有8個糖基化位點，缺失402位糖基化位點，多出70和264位糖基化位點。

表3 HA抗原位點的分析Table 3 Analysis of HA antigenic sites

表4 NA潛在糖基化位點分析Table 4 Analysis of NA potential glycosylation sites

2.4 分離株毒力相關(guān)位點的分析PB2、PB1-F2、PA、M1、NS1、NP基因與AIV的致病性相關(guān)，其中某些特定位點的突變，可提高H9N2亞型AIV的毒力及哺乳動物嗜性。通過對分離株這些位點分析發(fā)現(xiàn)，M1基因N30D、T215A突變，NS1基因P42S突變，PB1-F2基因僅FJ37和FJ56出現(xiàn)N66S突變，見表5。

表5 分離株毒力相關(guān)位點分析Table 5 Analysis of virulence related sites

2.5 分離株耐藥性相關(guān)位點的分析M2發(fā)揮離子通道的作用，與病毒的耐藥性相關(guān)，26、27、30、31、34位點的突變可使病毒產(chǎn)生金剛烷胺類藥物的耐藥性。分離株耐藥性位點中均出現(xiàn)S31N位點突變，見表6。

表6 分離株耐藥性相關(guān)位點分析Table 6 Analysis of drug resistance related sites

2.6 分離株基因之間同源性分析6株分離株HA同源性95.9%～99.9%；NA同源性96.9%～100%；M同源性97.1%～100%；NP同源性95.2%～100%；NS同源性98%～100%；PA同源性在97.1%～100%；PB1同源性在93.1%～99.6%；PB2同源性在98.3%～100%。2017年分離株FJ37、FJ56和FJ70間同源性高，其中前2株NA、M、NP、NS、PA、PB2基因同源性100%，環(huán)境分離株XA35雖然也是2017年分離但與同年其他3株同源性關(guān)系較遠(yuǎn)，其中PB1基因同源性低至93.1%。2015年2株分離株之間同源性較遠(yuǎn)，其中NP基因同源性低至95.7%。2017年與2015年分離株之間同源性較遠(yuǎn)，其中HA、NP、PB1同源性低至95.9%、95.2%、93.1%。

2.7 與分離株同源性最高的毒株6株分離株與近兩年周邊省份的H9N2分離株高度同源，其內(nèi)部基因與2016年浙江雞（NS）、2015年上海雞（M、NP）、2015年日本鴨（PA、PB1、PB2）H9N2亞型毒株同源性最高，同時部分內(nèi)部基因還與H7N9、H10N8、H10N6、H5N6、H4N2、H7N3，H3N2、H6N2亞型AIV高度同源（同源性高達(dá)99%），詳見表7。推測這些高同源性基因可能最初來源于同一毒株，也可能是基因重組的結(jié)果。

表7 與分離株核苷酸序列同源性最高的GenBank中的毒株Table 7 The strains with highest nucleotide sequence homology with isolates in GenBank

（續(xù)上表）

（續(xù)上表）

2.8 全基因的遺傳進(jìn)化分析6株分離株均屬于歐亞分支。遺傳進(jìn)化表現(xiàn)為多樣性，其中HA屬于Y280-like分支；M和PB2屬于G1-like分支；NA屬于SD/96-like分支；其余4個內(nèi)部基因均屬于F/98-like分支，詳見圖1～8。6株分離株主要與近兩年吉林省、山東省、廣西壯族自治區(qū)、浙江省等地流行的H9N2亞型AIV毒株同源性近，與2005年以前各地的分離株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與福建分離株A/Duck/Fujian/MH/2003、A/Duck/Fujian/FQ107/2007和野生水禽A/Wild/Waterfowl/ Dongting/ C2203/ 2011、A/Wild/Waterfowl/Dongting/PC2562/2012親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 HA基因的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene

圖2 NA基因的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene

圖3 M基因的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of M gene

圖4 NP基因的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of NP gene

圖5 NS基因的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of NS gene

圖6 PA基因的進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of PA gene

圖7 PB1基因的進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of PB1 gene

圖8 PB2基因的進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of PB2 gene

3 討論

H9N2亞型AIV最早于1966年分離自北美火雞[5]，我國最早于1994年分離自廣東省雞群[6]。1998～2000年在我國家禽中出現(xiàn)H9N2第一次大流行，以BJ/94亞群為主，隨著H9N2疫苗的推廣使用疫情得以控制。2008年出現(xiàn)第二次大流行，此時H9N2亞型以Y280亞群為主。目前H9N2 在國內(nèi)的檢出率居高不下，多為隱性感染[7]。2017年廈門市活禽屠宰場流行病學(xué)調(diào)查顯示，H9N2亞型的檢出率位居首位，主要分離自雞，在鴨群常與H6等亞型混合感染。

H9N2亞型在遺傳進(jìn)化上可分為北美和歐亞 2個分支。歐亞分支中又可分為A/Duck/HongKong/Y280/97（Y280-Like）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1-Like）、A/Duck/ HongKong/ Y439/97（Y439-Like）3個亞分支[8]。2017年的4株H9N2 亞型分離株與2015年廈門分離到的2株H9N2亞型位于同一進(jìn)化分支，HA屬于Y280-like分支；M和PB2屬于G1-like分支；NA屬于SD/96-like分支；其余4個內(nèi)部基因均屬于F/98-like分支，表現(xiàn)為遺傳多樣性。

同源性分析顯示，2017年禽源分離的FJ37、FJ56和FJ70與同年環(huán)境分離株XA35之間同源性關(guān)系較遠(yuǎn)，其中PB1基因同源性低至93.1%；2017年與2015年分離株之間同源性較遠(yuǎn)，其中HA、NP、PB1同源性分別低至95.9%、95.2%、93.1%。提示HA、NP、PB1這3個基因在進(jìn)化中更為活躍。分離株的內(nèi)部基因與2010年前福建流行的H9N2亞型毒株差異顯著，卻與H7N9、H10N8、H10N6、H5N6、H4N2、H7N3，H3N2、H6N2亞型高度同源（同源性高達(dá)99%），提示目前流行的毒株是多種亞型基因重組的結(jié)果。

基因序列分析發(fā)現(xiàn)，6株分離株HA第234位氨基酸（相當(dāng)于H3第226位氨基酸）由Q突變?yōu)長，與2012年報道的上海發(fā)病雞群中分離的3株H9N2亞型AIV毒株變異情況相符[9]，這種突變有向人類感染的嗜性[10]；HA的7個抗原位點與疫苗株比較，3個位點發(fā)生突變，提示免疫壓力促進(jìn)毒株的突變；NA基因頸部均出現(xiàn)9個核苷酸的缺失，這種分子特征屬于高致病性NA標(biāo)志；內(nèi)部基因均同時出現(xiàn)M2基因S31N突變，M1基因N30D、T215A突變，NS1基因P42S的突變；FJ37和FJ56毒株還出現(xiàn)PB1-F2基因N66S的突變，這些內(nèi)部基因關(guān)鍵位點的突變，提示當(dāng)前分離株已出現(xiàn)耐藥性、致病性增強的變化[11-14]。

文中針對H9N2亞型的主要毒力突變位點進(jìn)行分析，除了這些位點外，有學(xué)者在其他亞型流感病毒中證實PB2基因中M147L、E158G、D253N、T271A、I504V、T588I、G590S、Q591R、S714R位點[15-23]，PA基因中T85I、S224P、L336M、N383D、I550L、T552S、K615N位點[23-29]以及20、55、100、225、268、85、186、336位點[30-31]，PB1基因中13、113、198、317、678位點[32-33]，NP基因中184位點[34]，NS基因中39、70、71、86位點的突變亦與毒株毒力增強相關(guān)[35]。除了M2基因相關(guān)位點突變，可以使毒株出現(xiàn)對金剛烷胺類藥物耐藥性外，有學(xué)者證實H5N1亞型NA蛋白中V116A、I117V、E119A、Y252H、H274Y和N294S的突變與達(dá)菲類流感病毒藥物耐藥性相關(guān)[36-39]。這些位點的突變是否在H9N2亞型中發(fā)揮同樣作用，有待于進(jìn)一步研究。

H9N2一直被定義為弱毒株，但越來越多的動物實驗和臨床實驗證明該亞型具備潛在的感染哺乳動物和人的能力，加上其高檢出率和在流感病毒進(jìn)化中的重要地位，該亞型的防疫工作中應(yīng)引起足夠的重視，有必要定期開展監(jiān)測及分子生物學(xué)分析工作。