遵義地區(qū)H3N2亞型犬流感病毒血清學(xué)調(diào)查

高麗麗，代 軍，馬曉春

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遵義 563000）

犬流感（canine influenza，CI）是由正粘病毒科A型流感病毒屬犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）引起的一種犬屬動(dòng)物急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，患犬以咳嗽、噴嚏、流鼻涕、發(fā)熱和呼吸困難等為主要臨床癥狀[1]。在犬體內(nèi)已檢測(cè)到多種亞型流感病毒抗體，包括H3N8亞型、H3N2亞型、H5N1亞型、H1N1亞型以及H5N2亞型[2]。目前在犬中流行最主要的兩種流感病毒是2004年在美國(guó)分離到的馬源H3N8亞型CIV以及2007年在韓國(guó)分離的禽源H3N2亞型CIV[3-4]。2009年，我國(guó)首次從華南地區(qū)犬體內(nèi)分離得到H3N2亞型CIV。該病毒與韓國(guó)分離的H3N2亞型CIV親緣關(guān)系很近[5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)目前主要流行的是H3N2亞型CIV[6-7]。H3N2亞型CIV可通過(guò)空氣傳播方式感染犬，且可引起其他哺乳動(dòng)物的感染[8]。作為一種重要的伴侶動(dòng)物，犬與人類接觸密切，這使得H3N2亞型CIV對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在的威脅。因此，對(duì)犬流感群體水平的監(jiān)測(cè)與防控顯得尤為重要。

目前，檢測(cè)CIV方法主要有血凝抑制、病毒分離、RT-PCR等[9]，但均存在一定的缺陷。由于ELISA 檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡(jiǎn)易的特點(diǎn)，并可同時(shí)檢測(cè)大量樣本，是流行病學(xué)檢測(cè)的主要手段。為了解遵義地區(qū)犬禽源H3N2亞型CIV的流行狀況，本研究對(duì)遵義地區(qū)周邊鄉(xiāng)鎮(zhèn)及市區(qū)寵物醫(yī)院采集的320份血清樣本進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采用ELISA方法檢測(cè)CIV抗體水平，本研究結(jié)果對(duì)深入研究遵義地區(qū)CIV的發(fā)生及流行規(guī)律具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 樣品收集時(shí)間2017年3月～2017年12月。

1.2 樣品收集及制備從遵義市區(qū)3家寵物門診及遵義周邊農(nóng)村地區(qū)收集犬只血液樣品共計(jì)320份，1000×g離心10 min，取上清液于1.5 mL 滅菌離心管中，統(tǒng)一編號(hào)。處理好的血清均置-20℃冰箱保存，備用待檢。

1.3 試劑犬H3N2亞型流感病毒抗體（CIV Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4 主要試驗(yàn)器材352型酶標(biāo)儀，芬蘭 Labsystems Multiskan MS公司；5165040型洗板機(jī)，Thermo ScientificTMWellwashTM公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏公司；WH-2漩渦混合儀，金壇新航公司；MM-1低頻振蕩器，金壇國(guó)旺公司；100～500 μL加液器（排槍），德國(guó)Eppendorf公司。

1.5 方法按照H3N2亞型犬流感病毒抗體（CIV Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判定，試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00；陰性對(duì)照平均值≤0.10； 臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15；陰性判定：樣品OD值＜ 臨界值（Cut off）者為H3N2亞型CIV抗體(CIV Ab)陰性；陽(yáng)性判定：樣品OD值≥ 臨界值（Cut off）者為H3N2亞型CIV抗體(CIV Ab)陽(yáng)性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，通過(guò)x2檢驗(yàn)分析差異顯著性，P＜0.05時(shí)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遵義地區(qū)H3N2亞型CIV總體感染情況2017年3月～2017年12月，共在3家寵物診療機(jī)構(gòu)及周邊農(nóng)村田園犬收集到血液樣品320份。采用ELISA方法檢測(cè)H3N2亞型CIV抗體。結(jié)果顯示，總體陽(yáng)性率為8.44%（27/320）。陽(yáng)性對(duì)照孔平均值為1.767≥1.00，陰性對(duì)照平均值0.061≤0.10，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

2.2 不同來(lái)源H3N2亞型CIV感染情況從表1可以看出，不同來(lái)源H3N2亞型CIV抗體陽(yáng)性率有變化，市區(qū)寵物犬為7.96%，農(nóng)村田園犬為9.24%，X2檢驗(yàn)分析，P＞0.05，即不同來(lái)源H3N2亞型CIV抗體陽(yáng)性率差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同來(lái)源H3N2亞型CIV抗體檢測(cè)情況Table 1 CIV seropositivity rates in farmed and pet dogs

2.3 不同性別H3N2亞型CIV感染情況從表2可以看出，雄性犬H3N2亞型CIV抗體陽(yáng)性率為8.79%，略高于雌性的7.97%，但差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 不同性別H3N2亞型CIV抗體檢測(cè)情況Table 2 CIV seropositivity rates in male and female dogs

2.4 不同年齡段H3N2亞型CIV感染情況從表3可見，各年齡段的犬均可感染CIV，其中，1～3歲的犬陽(yáng)性率最高，達(dá)到9.63%，1歲以內(nèi)次之，為8.26%，3歲以上最低，為6.25%。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行X2檢驗(yàn)分析顯示，各個(gè)年齡段間抗體陽(yáng)性率差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同年齡H3N2亞型CIV抗體檢測(cè)情況Table 3 CIV seropositivity rates in dogs of different ages

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于犬流感的血清學(xué)調(diào)查多集中在東北、華北、華東和華南地區(qū)，西南地區(qū)CIV流行情況目前未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用ELISA方法，對(duì)遵義地區(qū)3家寵物診療機(jī)構(gòu)及周邊農(nóng)村地區(qū)收集到的320份血液樣品進(jìn)行H3N2亞型CIV抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示遵義地區(qū)總體陽(yáng)性率為8.44%（27/320），證實(shí)遵義地區(qū)存在H3N2亞型CIV的感染。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在寵物犬和田園犬中都有H3N2亞型CIV的血清抗體，且農(nóng)村田園犬抗體陽(yáng)性率（9.24%）高于市區(qū)寵物犬（7.96%）。雄性犬的抗體陽(yáng)性率（8.79%）高于雌性（7.97%）；從不同年齡段犬CIV抗體檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，0～1歲、1～3歲和3歲以上犬均有CIV陽(yáng)性抗體的檢出，說(shuō)明不同年齡段的犬均能感染CIV，其中1～3歲的青年犬CIV抗體陽(yáng)性率最高，為9.63%，3歲以上犬CIV抗體陽(yáng)性率最低，為6.25%，說(shuō)明青年更易感染CIV，推測(cè)可能跟青年犬的生活習(xí)性及活動(dòng)范圍有關(guān)。本次調(diào)查與廣東地區(qū)[10]的調(diào)查結(jié)果相似。

自2004年以來(lái)，世界各地均有流感病毒感染犬的報(bào)道，在我國(guó)犬群中存在著不同亞型流感病毒共感染的現(xiàn)象。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)流行的CIV主要是H3N2亞型。Yang等[11]用HI方法檢測(cè)了遼寧地區(qū)具有呼吸道癥狀犬的血清，發(fā)現(xiàn)H3亞型抗體陽(yáng)性率為10.8%（17/158），并且分離到2株流感毒株，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)與中國(guó)和泰國(guó)分離的鳥源H3N2亞型CIV相近。Zhang等[12]調(diào)查了黑龍江省、吉林省部分地區(qū)的CIV流行情況，結(jié)果顯示田園犬H3N2亞型CIV抗體陽(yáng)性率為20.2%（45/223），寵物犬為33.2%（166/500），高于我國(guó)南方地區(qū)。Sun等[6]從北京市、天津市、河北省、遼寧省、河南省和山東省等地收集寵物犬血清進(jìn)行了檢測(cè)，顯示這些地區(qū)H3N2亞型CIV總體陽(yáng)性率為3.5%（31/882），其中2～5歲的犬陽(yáng)性率最高，H1N1/09陽(yáng)性率為1.5%（13/882），人季節(jié)性H3N2流感病毒陽(yáng)性率為1.2%（11/882），并且存在共感染現(xiàn)象。Zhou等[7]從廣州、上海、北京和深圳收集600份血清，H3N2亞型CIV抗體陽(yáng)性率為8.66%（52/600），H3N8亞型為0.83%（5/600）。Su等[13]調(diào)查顯示，廣東地區(qū)田園犬和寵物犬H3N2亞型CIV陽(yáng)性率分別為12.22%和5.3%，并且從鼻拭子中分離到2株H3N2亞型CIV，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)與韓國(guó)和中國(guó)新分離到的H3N2亞型CIV相近。廣西地區(qū)2013～2015年間犬總體陽(yáng)性率14.38%（110/765），個(gè)別地區(qū)達(dá)到40%，青年階段（6月齡～2歲）的犬最為易感[14]。

流感病毒可以突破種間屏障，感染異種動(dòng)物。犬是人類重要的伴侶動(dòng)物，與人類接觸十分密切，犬感染CIV后可能通過(guò)人-犬的親密接觸對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，且可作為中間宿主成為新型流感病毒產(chǎn)生的“發(fā)生器”，其公共衛(wèi)生意義值得高度重視[15]。目前對(duì)于CIV的研究，主要集中在流行病學(xué)調(diào)查、病毒基因測(cè)序、動(dòng)物感染性或傳播性試驗(yàn)。段旭彤等[16]建立了H3N2亞型CIV的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過(guò)分子手段研究其致病機(jī)制，今后還要從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面進(jìn)一步對(duì)該病毒的流行狀況、致病機(jī)制進(jìn)行深入研究?，F(xiàn)階段要加大對(duì)CIV的血清學(xué)監(jiān)測(cè)力度，加強(qiáng)犬的飼養(yǎng)管理，避免健康犬與發(fā)病犬接觸，并及時(shí)對(duì)犬進(jìn)行衛(wèi)生消毒和免疫預(yù)防，同時(shí)要加快相關(guān)疫苗的研究和開發(fā)。