豬流行性腹瀉病毒變異毒株與傳統(tǒng)毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立

趙攀登，趙勝杰，王 巖，鄧同煒，盧建洲，劉靜靜，朱文龍，冀夢瑤，陳 益

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，鄭州450046；2.河南省動物疫病預(yù)防控制中心，鄭州450000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水甚至死亡[1]。1978年，英國和比利時首次暴發(fā)PED，之后PED在全世界廣泛流行[2]。我國南方地區(qū)在2010年10月暴發(fā)PED，疫情迅速蔓延至全國，對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。隨后，泰國、韓國、日本、美國、加拿大和葡萄牙等國均有PED暴發(fā)[3-8]。

豬流行性腹瀉病毒屬于I型冠狀病毒，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組全長約28 kb，依次包括5'非編碼區(qū)、7個開放閱讀框和3'非編碼區(qū)，7個開放閱讀框編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白和4個結(jié)構(gòu)蛋白，基因組從5'到3'依次為5'UTR- replicase（1a/1b）-S-ORF3-E-M-N-3'UTR。我國自2010年10月暴發(fā)PED，引起了國內(nèi)外研究人員的高度重視，流行病學(xué)結(jié)果表明，引起此次PED暴發(fā)的毒株與以往毒株在基因上出現(xiàn)明顯變化，尤其是S基因，存在多處點突變、堿基的插入和缺失，并且與美國、韓國、越南等國近年來出現(xiàn)的毒株有較高的同源性[9-11]。

目前有多種PEDV抗原檢測方法，比如針對S基因、M基因、N基因和ORF3基因的RT-PCR方法、real-time PCR方法、免疫組織化學(xué)和病毒分離等方法。但這些方法均不能區(qū)分PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株。本研究根據(jù)目前已發(fā)表的PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株S基因序列分別設(shè)計鑒別檢測引物，在同時檢測PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株的同時能夠?qū)烧邊^(qū)分。試驗結(jié)果表明，該方法能夠快速、簡便、有效的鑒別檢測PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株，為PEDV鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼腸孤病毒、豬瘟病毒、豬腦心肌炎病毒、輪狀病毒由本實驗室保存。

1.2 主要試劑pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Trizol Plus、Oligod(T)18購自TaKaRa公司；Plasmid Miniprep Kit、DNA回收試劑盒購自BIOMEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 病料腸道樣品ZJ120101經(jīng)基因測序為PEDV變異毒株；腸道樣品JS120103經(jīng)基因測序為傳統(tǒng)毒株。其他腸道樣品來源于中國9省市出現(xiàn)腹瀉癥狀的豬場。

1.4 引物的設(shè)計與合成利用BioEdit軟件比對GenBank發(fā)布的PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株的S基因序列，分別設(shè)計用于克隆變異毒株和傳統(tǒng)毒株部分S基因引物和常規(guī)RT-PCR引物。Rev-F/Rev-R用于制備變異毒株和傳統(tǒng)毒株標(biāo)準(zhǔn)品；F-V/R為變異毒株的鑒別檢測引物；F-C/R為傳統(tǒng)毒株鑒別檢測引物。引物序列及在S基因中的位置詳見表1。所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 變異毒株和傳統(tǒng)毒株標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建分別提取ZJ120101和JS120103腸道樣品中RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以ZJ120101和JS120103腸道樣品cDNA為模板，引物Rev-F/Rev-R經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因，將兩種目的基因連接至pMD18-T載體，構(gòu)建變異毒株的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-SV和傳統(tǒng)毒株的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-SC，經(jīng)酶切鑒定并送測序驗證。

1.6 RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化以標(biāo)準(zhǔn)品pMD-SV和pMD-SC為模板，用引物F-V/R、F-C/R進(jìn)行優(yōu)化RT-PCR條件。分別對引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和退火溫度進(jìn)行梯度篩選。經(jīng)過優(yōu)化后的RTPCR反應(yīng)體系：Taq酶0.5 μL，PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL，上游引物F-V和F-C各1.0 μL，下游引物R為2.0 μL，模板pMD-SV和pMD-SC各2 μL，補ddH2O至25 μL。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性5 min；95℃變性 45 s，53℃退火45 s，72℃延伸80 s，35個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。

1.7 RT-PCR特異性試驗以pMD-SV和pMD-SC為陽性對照，水為陰性對照，以豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼腸孤病毒、豬瘟病毒、豬腦心肌炎病毒、輪狀病毒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，驗證常規(guī)RT-PCR的特異性。

1.8 RT-PCR敏感性試驗利用標(biāo)準(zhǔn)品pMD-SV和pMD-SC為模板，分別進(jìn)行10倍倍比稀釋（1×107copies/μL～1×101copies/μL），進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，確定該方法的敏感性。

1.9 RT-PCR臨床樣品檢測試驗按照建立的RT-PCR方法分別對具有腹瀉癥狀仔豬的腸道樣品進(jìn)行檢測。

表1 本研究引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 變異毒株和傳統(tǒng)毒株標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-SV和pMD-SC經(jīng)酶切鑒定，兩種目的基因大小與預(yù)期一致（圖1）。經(jīng)測序驗證分別是PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株序列。

2.2 RT-PCR特異性檢測以pMD-SV和pMD-SC為陽性對照，水為陰性對照，其他毒株的cDNA為模板驗證RT-PCR方法特異性。電泳結(jié)果顯示：兩個陽性對照在相應(yīng)大小的位置出現(xiàn)條帶，變異毒株條帶大小為442 bp，傳統(tǒng)毒株條帶大小為270 bp，其他毒株和陰性對照均沒有條帶產(chǎn)生（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids by enzymedigestion

2.3 RT-PCR敏感性檢測10倍倍比稀釋pMD-SV質(zhì)粒，以各稀釋度為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)為4×103沒有條帶產(chǎn)生，判定該方法檢測PEDV變異毒株靈敏度是4×104拷貝（圖3A）。以連續(xù)稀釋的pMD-SC質(zhì)粒為模板，同樣的方法檢測傳統(tǒng)毒株靈敏度是4×104拷貝（圖3B）。利用該方法對5份陽性腸道樣品3次重復(fù)檢測，結(jié)果一致，表明該方法具有較好的重復(fù)性。Kubota等[12]根據(jù)PEDV N基因設(shè)計一對引物擴(kuò)增540 bp片段，用以檢測PEDV，結(jié)果顯示該方法在糞便中能檢測到PEDV最低含量為100TCID50。Kweon[13]和Ishikawa[14]先后建立了檢測PEDV M基因的RT-PCR方法。Song等[15]建立檢測PEDV ORF3基因的RT-PCR方法用于區(qū)分疫苗毒和野毒。但是上述方法均不能區(qū)分PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株。秦毅斌等[16]根據(jù)PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株S基因的差異，建立了PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株鑒別檢測方法。但是該方法僅能擴(kuò)增PEDV變異毒株S基因序列，若是PEDV傳統(tǒng)毒株感染則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本研究能夠同時檢測PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株，并且根據(jù)擴(kuò)增片段的大小可將兩者區(qū)分，變異毒株擴(kuò)增片段大小為442 bp，而傳統(tǒng)毒株擴(kuò)增片段大小是270 bp，試驗表明該方法具有較好的敏感性和特異性。

圖2 PEDV RT-PCR特異性試驗Fig.2 The specificity of PEDV RT-PCR

圖3 變異PEDV(A)和經(jīng)典PEDV(B) RT-PCR敏感性試驗Fig. 3 The sensitivity of conventional RT-PCR with variant PEDV (A) and classical PEDV (B)

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果利用建立的常規(guī)RT-PCR檢測42份來自臨床腹瀉癥狀豬的腸道組織，結(jié)果顯示：常規(guī)RT-PCR檢測陽性樣品29份，其中PEDV變異毒株27份，PEDV傳統(tǒng)毒株2份。PEDV檢出陽性率為69%（29/42），變異毒株檢出率為93.1%（27/29），傳統(tǒng)毒株檢出率為6.9%（2/29）。

本研究建立的鑒別PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株RT-PCR檢測方法具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點，在檢測PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株的同時將兩者區(qū)分，為豬流行性腹瀉病原檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。