重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活苗的不同免疫程序?qū)S羽肉雞免疫的效果分析

王孝德，禹婷婷，李志賢，虞與理，胡 杰

（1.賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，賀州542800；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧530001）

流感病毒分為A、B、C三型，三型之間的同源性較低[1]。禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的急性高度接觸性傳染病，我國(guó)將其列為一類傳染病。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科，單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組總長(zhǎng)13.6 kb，分為8個(gè)節(jié)段，易于發(fā)生變異和病毒重組[2]。

2017年6月前，我國(guó)僅對(duì)高致病性禽流感（H5亞型）進(jìn)行強(qiáng)制性免疫。H7N9流感病毒在禽類身上呈現(xiàn)低致病性，但對(duì)人類則顯現(xiàn)高致病力[3]，感染H7N9流感病毒的禽（雞）不發(fā)病，僅攜帶病毒[4]。近年來(lái)，由于H7N9流感毒株變異逐漸頻繁，不斷涌現(xiàn)出新的毒株，毒力逐漸增強(qiáng)，H7N9亞型流感病毒變異株對(duì)雞表現(xiàn)超強(qiáng)毒力[5]，發(fā)病率和死亡率極高，對(duì)家禽危害大，給人民的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。因此，2017年6月5日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳要求2017年7月上旬在廣東省、廣西壯族自治區(qū)啟動(dòng)H7N9免疫工作，同時(shí)也要求對(duì)疫苗的安全性和免疫效力效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)[7]。因此，如何科學(xué)、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)疫苗效果，對(duì)防控禽流感至關(guān)重要。國(guó)家新推薦使用的重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株）免疫程序、免疫效果如何，相關(guān)資料報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)黃羽肉雞不同免疫程序下的抗體消長(zhǎng)規(guī)律、抗體持續(xù)時(shí)間、免疫抗體滴度變化情況，評(píng)估重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株）的免疫效果，為禽流感的綜合防控提供理論參考，也為養(yǎng)殖企業(yè)或個(gè)體養(yǎng)殖戶的免疫防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株），簡(jiǎn)稱（H5+H7）二價(jià)滅活苗（下同），哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，政府采購(gòu)苗，批號(hào)為2017026。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物本地規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)臨床健康的10日齡360只黃羽肉雞（三黃雞），隨機(jī)分成A、B、C 3組，每組120只，用戴腳環(huán)的方式進(jìn)行標(biāo)記。

1.3 檢測(cè)試劑禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H5亞型陽(yáng)性血清以及禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H7亞型陽(yáng)性血清以及H7N9 H7-Re1株HI抗原和陽(yáng)性血清，均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。其中，禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H5亞型陽(yáng)性血清批號(hào)分別為2017001和2016003，有效期分別至2019年04月27日和2018年11月16日；禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H7亞型陽(yáng)性血清批號(hào)分別為2017007和2017004，有效期分別至2019年4月18日和2019年6月26。1%雞紅細(xì)胞懸液稀釋液和pH7.2～7.4的磷酸鹽緩沖溶液按GB/T18936-2003中的配方由賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室自配。

1.4 免疫方式及采血時(shí)間A組：即在34日齡肌肉注射0.5 mL/只（H5+H7）二價(jià)滅活苗，于免疫前0 d及免疫后第14、28、42、56、86 d，分別采集雞血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。B組：即在10日齡和20日齡雞，分別頸部皮下注射0.1 mL/只（H5+H7）二價(jià)滅活苗；于免疫前0 d、一免后第7 d以及二免后第14、28、42、56、70、100 d，分別采集雞血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。C組：即在 20日齡和40日齡分別肌肉注射0.5 mL/只（H5+H7）二價(jià)滅活苗；于免疫前0 d、一免后第14 d、二免后第8、22、36、50、80 d，分別采集雞血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測(cè)方法參照GB/T18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》中血凝（hemagglutination，HA）和血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI）方法對(duì)上述血清進(jìn)行禽流感H5和H7抗體檢測(cè)；判斷標(biāo)準(zhǔn)：抗體滴度≥4log2為陽(yáng)性，抗體滴度＜4log2為陰性。

1.6 數(shù)據(jù)分析利用SPSS軟件對(duì)1.2.2中的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行抗體平均滴度值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、95%的置信區(qū)間分析。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)有出現(xiàn)免疫不良反應(yīng)試驗(yàn)雞未觀察到有精神不振、食欲減退等不良反應(yīng)。

2.2 禽流感H5抗體情況

2.2.1 抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)變化情況 由表1可知，A組免疫后第14 d時(shí)，抗體水平提升較快，抗體陽(yáng)性率達(dá)到91.67%，抗體平均滴度為6.42log2；B組在一免后第7 d時(shí)，抗體陽(yáng)性率僅為10%，說(shuō)明有母源抗體的干擾，抗體提升慢，一免時(shí)間過(guò)早；二免過(guò)后第14 d，抗體提升非常迅速，抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%，抗體平均滴度為7.43log2；C組一免后第14 d，抗體陽(yáng)性率為94.17%，抗體提升最快。

2.2.2 禽流感H5抗體消長(zhǎng)規(guī)律 由圖1A可知，A組抗體在免疫前0 d（34日齡）時(shí)母源抗體水平低，陽(yáng)性率為0，說(shuō)明母源抗體已消退，免疫后第14 d抗體水平快速提升，免疫后第28 d抗體水平達(dá)到最高峰，平均滴度為8.09log2，抗體陽(yáng)性率為96.67%，免疫后第42 d抗體陽(yáng)性率最高為98.33%，但抗體滴度已經(jīng)下降到6.33log2，到免疫后第86 d（即出欄時(shí)），抗體滴度降為5.99log2，抗體陽(yáng)性率為89.17%（表1）。

由圖1B可知，B組抗體水平在免疫前0 d（10日齡）時(shí)抗體滴度為6.42log2，抗體陽(yáng)性率為87.5%，說(shuō)明仍存在較高的母源抗體，免疫一針后第7 d，抗體水平很低，僅為1.09log2，說(shuō)明并未產(chǎn)生抗體，也有可能是母源抗體干擾，一免第10 d后，緊接著二免，二免后第14 d，抗體水平快速提升，抗體滴度達(dá)到了7.43log2，抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%，二免后第28 d抗體水平達(dá)到最高峰，平均滴度為8.45log2，抗體陽(yáng)性率為100%，二免后第42 d抗體水平開(kāi)始下降，到二免后第100 d（即出欄時(shí)）時(shí)滴度已經(jīng)下降到6.27log2，抗體陽(yáng)性率為83.33%（表1）。

由圖1C可知，C組抗體水平在免疫前0 d（20日齡）時(shí)抗體滴度為2.01log2，抗體陽(yáng)性率僅為6.67%，說(shuō)明母源抗體基本消退，免疫一針后14 d，抗體水平快速提升，抗體滴度為6.88 log2，抗體合格率達(dá)94.17%，一免第20 d后開(kāi)始二次免疫，二免后第8 d抗體水平開(kāi)始提升，抗體滴度達(dá)7.15 log2，抗體陽(yáng)性率達(dá)99.17%，到二免后第22 d抗體滴度達(dá)到最高峰，平均滴度為8.63log2，以后抗體滴度緩慢下降，但抗體陽(yáng)性率100%狀況一直維持到二免后第50 d，到二免后第80 d（即出欄）時(shí)滴度已經(jīng)下降到7.45log2，抗體合格率仍高達(dá)為95.83%（表1）。

圖1 AIV H5抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 AIV H5 antibody test results

2.3 禽流感H7抗體情況

2.3.1 抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)變化情況 由表2可知，A組于34 d日齡實(shí)行一針免疫，免疫后第14 d抗體水平有一定提升，抗體平均滴度為4.72log2，抗體陽(yáng)性率為78.33%；B組在一免后第7 d，抗體陽(yáng)性率僅為7.5%，說(shuō)明有母源抗體的干擾，抗體提升慢，二免后第14 d，抗體提升較快，抗體陽(yáng)性率達(dá)到93.33%，抗體平均滴度為5.96log2；C組一免后第14 d，抗體陽(yáng)性率為93.33%，抗體提升最快，抗體平均滴度為6.88log2。

2.3.2 禽流感H7抗體消長(zhǎng)規(guī)律 由圖2A可知，A組抗體在免疫前0 d（34 d日齡）時(shí)母抗體水平低，僅有10%的陽(yáng)性率，說(shuō)明母源抗體消退明顯，免疫一針后14 d快速提升，免疫后第28 d抗體達(dá)到最高峰，平均滴度為7.59log2，抗體陽(yáng)性率為96.67%，然后抗體逐漸緩慢下降，抗體陽(yáng)性率變化不明顯，免疫后第86 d（即出欄時(shí)），抗體滴度降為5.31log2，抗體陽(yáng)性率86.67%（表2）。

表1 禽流感H5 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 AIV H5 antibody test results

由圖2B可知，B組抗體水平在免疫前0 d（10日齡）時(shí)抗體滴度為6.17log2，抗體陽(yáng)性率為82.5%，說(shuō)明還存在較高的母源抗體，免疫一針后第7 d，抗體水平很低，僅為1.75log2，說(shuō)明并未產(chǎn)生抗體，也有可能是母源抗體干擾，一免10 d后進(jìn)行二免，二免后第14 d，抗體水平快速提升，抗體滴度為5.96log2，抗體陽(yáng)性率達(dá)到93.33%，隨后抗體水平不斷提升，二免后第42 d抗體達(dá)到最高峰，平均滴度為7.58log2，然后抗體緩慢回落，到二免后第100 d（即出欄）時(shí)抗體滴度已經(jīng)下降到5.87log2，抗體陽(yáng)性率為80.83%（表2）。

由圖2C可知，C組的抗體在免疫前0 d（20日齡）時(shí)抗體滴度為2.01log2，抗體陽(yáng)性率僅為6.64%，說(shuō)明母源抗體基本消退，免疫一針后第14 d，抗體水平快速提升，抗體滴度為6.44log2，抗體合格率達(dá)到93.33%，一免20 d后開(kāi)始二次免疫，二免后第8 d抗體水平開(kāi)始提升，抗體滴度達(dá)7.53 log2，抗體陽(yáng)性率達(dá)到98.33%，到二免后第22 d, 抗體滴度達(dá)到最高峰，為8.77log2，以后抗體滴度緩慢下降，到二免后第80 d（即出欄時(shí)）時(shí)抗體滴度仍有7.43log2，抗體陽(yáng)性率仍高達(dá)為92.5%（表2）。

圖2 禽流感H7抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.2 AIV H7 antibody test results

3 討論

3.1 本次試驗(yàn)20日齡和40日齡各免疫一次組（C組）免疫效果較好C組的抗體滴度值、抗體均勻度、抗體高峰期的維持時(shí)間均優(yōu)于其他兩組。A組雖然抗體提升也較快，但抗體高峰期維持時(shí)間太短，抗體衰減速度快于B組、C組。因此，二次免疫的效果要比一次免疫的效果要好[8]。B組考慮三黃雞雞體格較小，一免日齡小，選擇的免疫劑量0.1 mL，低于廠家說(shuō)明書(shū)要求的0.3 mL/只，二免后雖然抗體有所提升，但抗體平均滴度低于C組，變異系數(shù)大于C組，B組免疫劑量不足是造成B組免疫效果不如C組的原因之一[9]。

3.2 （H5+H7）二價(jià)滅活苗的免疫效果好選擇的三種免疫程序，用（H5+H7）二價(jià)滅活苗免疫的黃羽肉雞，H5和H7的抗體群體陽(yáng)性率都達(dá)到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部70%以上的要求。在首免14 d 后，H5 亞型和H7亞型抗體陽(yáng)性率都可達(dá)78.00%以上，與楊澤林等[10]報(bào)道的H5亞型首免后第15 d，合格率（陽(yáng)性率）為10%，首免后22 d，合格率（陽(yáng)性率）為60%；H5亞型首免15 d后，合格率（陽(yáng)性率）為70%，首免后第22 d，合格率（陽(yáng)性率）為93.33%，有些差異。免疫后第14～120 d肉雞出欄，禽流感H5的抗體水平普遍比H7抗體水平高，H5、H7抗體陽(yáng)性率都在80%以上。表明（H5+H7）二價(jià)滅活苗有較好的免疫效果。

表2 AIV H7 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 2 AIV H7 antibody test result

3.3 根據(jù)出欄時(shí)間的不同可采取有差別的免疫程序可根據(jù)本地不同情況，采樣不同的免疫程序。對(duì)于飼養(yǎng)生長(zhǎng)速度慢、飼養(yǎng)期在120日齡左右的黃羽肉雞規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)，最好實(shí)行首免后第20 d加強(qiáng)免疫，免疫效果更好。在農(nóng)村散養(yǎng)地區(qū)，由于鄉(xiāng)村動(dòng)物防疫力量薄弱的現(xiàn)狀，首免后第20 d加強(qiáng)免疫難以全面實(shí)施的情況下，可使用一次性免疫，即可在20日齡時(shí)，也能獲得達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的免疫效果；對(duì)于飼養(yǎng)生長(zhǎng)速度快、飼養(yǎng)期在70日齡以下的肉雞的規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)，為保障雞肉的質(zhì)量安全（疫苗注射后第28 d才可上市銷售），可實(shí)行一次性免疫或首免后第10 d加強(qiáng)免疫（B組）；在有疫情發(fā)生過(guò)的區(qū)域，用首免后10日加強(qiáng)免疫（B組），使雞在較短的時(shí)間更快的獲得保護(hù)。