碧蘿芷通過(guò)激活蛋白激酶B改善AML12細(xì)胞胰島素抵抗

鐘文霞，王藝穎，2，范斌，谷劍秋

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，沈陽(yáng) 110001；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，浙江 溫州 310009；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

糖尿病是一組由遺傳及環(huán)境等多種病因引起的、以碳水化合物和脂質(zhì)代謝失調(diào)為特征的一種代謝性疾病。盡管2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但肝臟的糖脂代謝紊亂一直被認(rèn)為是其主要發(fā)病機(jī)制之一。肝臟是人體重要的物質(zhì)代謝器官，其通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解、合成、儲(chǔ)存及再分配來(lái)維持人體的代謝穩(wěn)態(tài)。肝臟出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，胰島素對(duì)糖原合成及葡萄糖攝取的作用減弱，導(dǎo)致血糖升高；另一方面又促進(jìn)甘油三酯在肝臟沉積，進(jìn)一步增強(qiáng)胰島素抵抗［1］。碧蘿芷（pycnogenol，PYC）是法國(guó)沿海松樹(shù)皮提取物，其主要成分為原花青素、兒茶酚、紫杉葉素和酚酸［2］，具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用。本研究通過(guò)體外建立肝臟胰島素抵抗模型，觀察PYC對(duì)AML12 細(xì)胞糖代謝的影響，并探討其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

油酸（oleic acid，OA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PYC購(gòu)自瑞士Horphag 研究有限公司，葡萄糖氧化酶試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物有限公司，糖原染色（periodic acid-schiff stain，PAS）試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類有限公司，胰島素受體底物（IRS/p-IRS）抗體、蛋白激酶B（AKT/p-AKT）抗體、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）抗體、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，實(shí)時(shí)PCR引物購(gòu)自上海生工有限公司，PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。PCR引物如下：GAPDH，正義鏈 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，反義鏈5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'；G6PC，正義鏈5'-TGGAGTCTTGTCAGGCATTG-3'，反義鏈 5'-GTA GAATCCAAGCGCGAAAC-3'；PEPCK，正義鏈 5'-CT GGCACCTCAGTGAAGACA-3'，反義鏈 5'-TCGATG CCTTCCCAGTAAAC-3'；PGC1α，正義鏈 5'-GTGCC ACCGCCAACCAAGAG-3'，反義鏈 5'-TTCCTCGTGT CCTCGGCTGAG-3'；Gpi1，正義鏈 5'-CAACTGCTA CGGCTGTGAGA-3'，反義鏈 5'-CCCGGACTTGGTGA TGTACT-3'；Eno1，正義鏈 5'-GTGGTGTCCATCAG AGATCC-3'，反義鏈 5'-CGCTTAGGGTTGGTCACTG T-3'；PKLR，正義鏈 5'-AGTCGGAGGTGGAAATTG TG-3'，反義鏈 5'-GCAACGACCTGGGTGATATT-3'。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：以2×105/mL濃度將AML12細(xì)胞（上海中科院）接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞分為5組：（1）空白對(duì)照組；（2）PYC50（50 μg/mL）組；（3）OA（200 μmol/L）組；（4）PYC10（10 μg/mL）+OA（200 μmol/L）組；（5）PYC50（50 μg/mL）+OA（200 μmol/L）組。PYC預(yù)處理1 h后加入OA，共培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)基上清剩余葡萄糖含量測(cè)定：將細(xì)胞接種于6孔板，OA處理24 h，取培養(yǎng)基上清液。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水倍比稀釋為5 000、1 250、312.5、78、19.5 μmol/L做標(biāo)準(zhǔn)曲線，工作液按說(shuō)明書配制（R1∶R2=4∶1），取標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品各10 μL加入96孔板中，再加入工作液190 μL，37 ℃水浴30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處吸光度值。

1.2.3 PAS糖原染色：將細(xì)胞接種于24孔板爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，棄上清，用PBS洗2次，加入高碘酸溶液染色10 min，PBS充分水洗5 min，加入Schiff試劑浸染5～10 min，自來(lái)水水洗3次，每次1 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)糖異生及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)：按說(shuō)明書提取總RNA，取1 μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈 cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，按 SYBER Green Real-time PCR熒光試劑盒說(shuō)明書操作，總反應(yīng)體積20 μL。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)：OA處理細(xì)胞24 h，加入100 nmol/L胰島素處理20 min后提取總蛋白，每孔加入60 μL裂解液充分裂解，離心（4 ℃，12 000g，15 min）取上清。蛋白上樣量50 μg，電泳（10% SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)膜（50 V，90 min）、5%牛血清蛋白封閉（90 min），一抗IRS（1∶1 000兔抗鼠單克隆IgG）、p-IRS（1∶1 000兔抗鼠單克隆IgG）、AKT（1∶1 000兔抗鼠單克隆IgG）、p-AKT（1∶1 000 兔抗鼠單克隆IgG）、p-GSK3β（1∶1 000兔抗鼠單克隆IgG）、GAPDH（1∶1 000鼠抗鼠單克隆IgG），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜（15 min×3次），二抗孵育（1∶5 000，室溫2 h），ECL顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PYC對(duì)AML12細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

與空白對(duì)照組相比，OA組細(xì)胞培養(yǎng)基葡萄糖剩余量明顯增加（P＜0.05）。PYC10+OA組、PYC50+OA組與OA組比較，培養(yǎng)基葡萄糖剩余含量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖1。表明PYC可促進(jìn)AML12細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗。

圖1 PYC促進(jìn)AML12細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗Fig.1 PYC promoted glucose consumption in AML12 cells

2.2 PYC對(duì)AML12細(xì)胞糖原合成的影響

細(xì)胞爬片PAS糖原染色結(jié)果顯示，加入PYC處理后，PYC10+OA組、PYC50+OA組與OA組比較，糖原含量明顯增加，且以PYC50+OA組更為明顯，見(jiàn)圖2。

圖2 PAS糖原染色 ×400Fig.2 PAS glycogen staining ×400

2.3 PYC對(duì)AML12細(xì)胞糖酵解及糖異生相關(guān)基因表達(dá)的影響

血糖平衡的維持與葡萄糖代謝有密切關(guān)系，其中糖酵解和糖異生為葡萄糖的重要代謝途徑。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與OA組比較，PYC10+OA組、PYC50+OA組中糖異生基因PGC1α、PEPCK及G6PCmRNA 表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），糖酵解基因Gpi1、Eno1mRNA表達(dá)增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PKLRmRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 PYC對(duì)糖異生基因PGC1α、PEPCK及G6PC mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of PYC on the mRNA expression of the genes involved in gluconeogenesis，including PGC1α，PEPCK，and G6PC，in AML12 cells

2.4 PYC對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響

Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與OA+insulin組相比，PYC10+OA+insulin組、PYC50+OA+insulin組中IRS及p-IRS蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但AKT及p-AKT蛋白、p-GSK3β蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖4 PYC對(duì)糖酵解基因Gpi1、Eno1及PKLR mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PYC on the mRNA expression of genes involved in glycolysis，including Gpi1，Eno1，and PKLR，in AML12 cells

圖5 PYC對(duì)胰島素通路蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of PYC on the expression of proteins involved in the insulin pathway，including p-GSK3β，p-AKT/AKT，and p-IRS/IRS，in AML12 cells

3 討論

近年來(lái)糖尿病患病率逐年增加，糖尿病的發(fā)病機(jī)制仍在探索中，但胰島素抵抗仍是其主要的機(jī)制之一。目前臨床上有多種降低血糖、改善胰島素抵抗作用的藥物，但是長(zhǎng)期使用藥物會(huì)產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)或出現(xiàn)藥物不耐受。因此，有必要對(duì)調(diào)控糖脂代謝的天然活性物質(zhì)進(jìn)行研究。DOSSI等［3］發(fā)現(xiàn)玫瑰果油可以抵抗高脂飲食導(dǎo)致的小鼠脂肪肝形成，CHEN等［4］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過(guò)減輕肥胖小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)改善胰島素抵抗。PYC是由多種活性物質(zhì)組成的天然化合物，具有超過(guò)其中任何單一組分的強(qiáng)大功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PYC可以降低空腹血糖［5］，改善血管內(nèi)皮功能［6］。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)PYC調(diào)控血糖的機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)給予OA刺激AML12細(xì)胞，建立體外肝臟胰島素抵抗模型，發(fā)現(xiàn)PYC可以通過(guò)激活胰島素下游信號(hào)通路改善肝細(xì)胞胰島素抵抗。

既往研究［7］發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中PYC可以促進(jìn)葡萄糖攝取。本研究給予PYC處理AML12細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)PYC不僅可以明顯增加葡萄糖的消耗，而且還可以促進(jìn)肝細(xì)胞糖原合成。在胰島素抵抗中，PI3K/AKT是經(jīng)典的胰島素信號(hào)通路，體內(nèi)外多種活性物質(zhì)通過(guò)此通路發(fā)揮重要的作用。胰島素與胰島素受體結(jié)合后促使IRS磷酸化活性增強(qiáng)，PI3K的P85/P110復(fù)合體與IRS結(jié)合，激活A(yù)KT，從而調(diào)控葡萄糖的攝取、糖原合成、糖酵解、糖異生和脂肪合成等多種代謝過(guò)程。GSK3β是糖原合成過(guò)程中的重要激酶，GSK3β磷酸化使糖原合酶活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)糖原合成。本研究發(fā)現(xiàn)，PYC處理后AKT磷酸化表達(dá)增高，且下游p-GSK3β也明顯升高，表明PYC可以通過(guò)AKT-GSK3β通路促進(jìn)糖原合成。為進(jìn)一步了解PYC通過(guò)激活胰島素通路如何調(diào)控肝臟葡萄糖代謝，本研究檢測(cè)了糖異生代謝關(guān)鍵酶G6PC、PEPCK的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PYC對(duì)糖異生基因G6PC、PEPCK表達(dá)無(wú)明顯作用。叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子O1（FoxO1）是糖異生途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)與G6PC和PEPCK基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)糖異生，而PGC1α則是FoxO1重要的共刺激因子，協(xié)同促進(jìn)糖異生基因的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，PYC也不能促進(jìn)PGC1α的mRNA表達(dá)，提示PYC可能不通過(guò)糖異生途徑發(fā)揮作用。在肝臟中，AKT可以激活葡萄糖激酶促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖，因此本研究檢測(cè)了糖酵解途徑相關(guān)作用酶，發(fā)現(xiàn)PYC不能增加糖酵解途徑中Eno1和Gpi1的mRNA表達(dá)，但可以明顯促進(jìn)糖酵解途徑關(guān)鍵酶PKLR的表達(dá)。PKLR的主要作用是將磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸，表明PYC很可能是通過(guò)糖酵解途徑促進(jìn)糖代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)，PYC雖然可以促進(jìn)p-AKT表達(dá)，但并沒(méi)有增加AKT上游p-IRS蛋白的表達(dá)。在胰島素抵抗中，炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胰島素信號(hào)通路存在著聯(lián)系。PYC可以通過(guò)抑制核因子-κB發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化抗炎作用［8］，而核因子-κB抑制因子激酶則是聯(lián)系炎癥反應(yīng)與胰島素抵抗的關(guān)鍵酶之一［9］。本課題組前期研究［10］發(fā)現(xiàn)，PYC可以通過(guò)激活PPARα調(diào)控脂肪小滴蛋白perilipin2表達(dá)。因此，PYC是否也可以通過(guò)炎癥通路或者脂代謝通路調(diào)控AKT活性，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究證明PYC可通過(guò)激活A(yù)KT促進(jìn) PKLR表達(dá)調(diào)節(jié)糖酵解途徑，并且促進(jìn)p-GSK3β表達(dá)增加糖原合成，從而調(diào)控肝細(xì)胞胰島素抵抗，為研發(fā)新的改善胰島素抵抗藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。