阿魏菇乙酸乙酯相三萜類化合物對食管癌Eca109細胞的增殖抑制及機制

王 磊，張富春，劉 軍

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

食管癌是消化道最常見的惡性胃腸道腫瘤[1]，作為全球第六大癌癥死亡原因，每年約51萬 人因食管癌死亡，57萬食管癌病例被確診[2-4]。食管癌腫瘤發(fā)病率居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，死亡率居我國惡性腫瘤死亡率的第4位[5]?，F代外科手術結合不同治療策略取得了一定的療效，如放療、化療以及免疫治療[6]，但近5 年食管癌患者生存率仍小于20%[3]。此外，現有抗腫瘤化學藥物存在價格昂貴、副作用大等弊端，因此必須尋找及開發(fā)新型有效的抗腫瘤活性藥物。飲食與癌癥化學預防已備受關注，如大蒜被廣泛應用于食品和調味劑，而大蒜素可作為抗癌藥物[7]。有研究表明食物的生物活性物質與降低癌癥風險有著密切的關系[8]。

阿魏菇（Pleurotus ferulae）屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側耳屬，又名阿魏側耳，是一種大型肉質傘菌，因寄生或腐生在干旱草原一種藥用植物阿魏上而得名，是新疆特有的一種藥食同源菌類[9]，具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血脂等多種功能[10-12]。這些功能普遍被認為與阿魏菇中存在的大量活性物質有關[10-11,13]；目前對其水提物中主要活性物成分多糖的研究較多[14]，而對其醇提物中活性成分的研究卻鮮見報道。本課題組前期研究表明，阿魏菇醇提物中含有的主要活性成分是三萜類、生物堿以及皂苷類[15]。國內外的研究表明，三萜類化合物在抗癌方面具有較高的研究價值[16-22]，例如靈芝三萜類被報道具有良好的抗腫瘤作用[22]，萜類化合物CDDO-Im作為抗腫瘤藥物已進入臨床實驗階段[23]。因此，本實驗以前期優(yōu)化后的阿魏菇粗三萜（Pleurotus ferulatus triterpenoid，PFTP）提取條件進行提取并分級萃取[9]，研究阿魏菇乙酸乙酯相三萜類化合物（ethyl acetate phase of PFTP，PFTP-E）對Eca109細胞的抗腫瘤作用機制，以期為食管癌的治療提供植物源的天然抗腫瘤候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇由新疆南山栽培基地提供，由新疆大學生命科學與技術學院逯永滿老師鑒定。人食管癌細胞Eca109、人胃癌細胞BGC823、人結腸癌細胞HT29、人結腸癌細胞SW480、人結腸癌細胞HCT116、小鼠結腸癌細胞CT26由新疆大學生物資源與基因工程重點實驗室和歐易生物醫(yī)學科技有限公司提供。

β-actin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）3、Caspase9、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bcl2、Bax、細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、細胞外信號相關激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗體、二抗山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、山羊抗兔IgG 上海生工生物工程公司；3-(4,5-二甲基噻-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶生物科技公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素 美國HyClone公司；細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒上海翊圣生物科技公司；Hoechst 33258染液、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒 上海碧云天生物工程公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒美國賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設備

DK8D型電熱恒溫水浴鍋 廣州滬瑞明儀器有限公司；2200.2超聲波破碎儀 北京桑翌實驗儀器研究所；RE-1050旋轉蒸發(fā)儀 河南蘭帆實業(yè)有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術有限公司；Heracell-150i細胞培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾公司；LSR Fortessa X-20流式細胞儀 美國BD公司；CMax-Plus酶標儀 北京華泰和合商貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 阿魏菇三萜類化合物的制備

新鮮阿魏菇子實體清洗干凈切片，真空冷凍干燥處理，粉碎過40 目篩包裝保存。稱取阿魏菇凍干粉100 g，加入2 L體積分數95%乙醇溶液，混勻后50 ℃超聲40 min，75 ℃水浴25 min，過濾收集上清液，提取3 次，合并濾液，濃縮至100 mL后得PFTP。將濃縮后的PFTP依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3 次，每次30 min，將3 個萃取相濃縮、冷凍干燥，得浸膏石油醚相提取物（PFTP-P）、乙酸乙酯相提取物（PFTP-E）、正丁醇相提取物（PFTP-B）。PFTP用DMSO溶解，貯存質量濃度為150 mg/mL，PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B用DMSO溶解，貯存質量濃度均為50 mg/mL。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于含質量分數10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、相對濕度95%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代1 次，取接種于培養(yǎng)板24 h后的細胞進行實驗。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖能力

分別取對數期的Eca109、BGC823、HT29、SW480、HCT116和CT26細胞，胰蛋白酶消化，取100 μL細胞懸液（5×103個/孔）接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B分別于37 ℃處理腫瘤細胞24、48、72 h，移除培養(yǎng)基，加入100 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育3 h，移除MTT溶液，加入200 μL DMSO，振蕩至結晶充分溶解，酶標儀檢測490 nm波長處吸光度，以正常生長細胞為對照，重復3 次后按下式計算細胞存活率，從而得到半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡

取培養(yǎng)至對數期的Eca109細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板（1×104個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP-E處理24 h，以正常生長細胞為空白對照，以順鉑（35 μg/mL，下同）處理組為陽性對照，以DMSO（與PFTP-E等體積，下同）處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，體積分數4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS清洗2 次，移除PBS，加入30 μL Hoechst 33258避光染色10 min，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 流式細胞術分析細胞凋亡、周期、胞內ROS水平和線粒體膜電位

取培養(yǎng)至對數期的Eca109細胞接種于60 mm細胞培養(yǎng)板（2.5×105個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-E處理24 h，以正常生長細胞為空白對照，以順鉑處理組為陽性對照，以DMSO處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，收集細胞，冷PBS洗2 次。然后采用Annexin VFITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙標記染色法流式細胞術檢測細胞凋亡；采用PI單標記法流式細胞術檢測細胞周期；采用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）標記法流式細胞術檢測胞內ROS水平；采用熒光探針JC-1標記法流式細胞術檢測線粒體膜電位。用Flowjo 7.6軟件處理數據。

1.3.6 Western blot法檢測相關蛋白表達量

取培養(yǎng)至對數期的Eca109細胞接種于60 mm細胞培養(yǎng)板（2.5×105個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-E處理24 h，以DMSO處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后收集細胞，冷PBS洗2 次，RIPA溶液（15 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、質量分數1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1 mmol/L Na3VO4、10 μg/mL蛋白酶抑制劑和10 μg/mL亮抑肽酶，pH 7.4）冰上裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白質量濃度，各組蛋白上樣量相同，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），轉至聚偏氟乙烯膜，用含質量分數5%脫脂奶粉的PBST溶液37 ℃封閉1 h。37 ℃一抗（β-actin、Caspase3、Caspase9、PARP、Bcl2、Bax、Cyt c、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗體）孵育2 h（體積比1∶200～1∶1 000），PBST洗3 次；37 ℃二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG）孵育1 h（1∶2 000），PBST洗3 次，用ECL試劑盒顯色。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

實驗數據采用 ±s表示，利用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析以及t檢驗并作圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 PFTP對腫瘤細胞的增殖抑制作用

以齊墩果酸標準品繪制的標準曲線y＝3.742 4x+0.078 9計算得到PFTP的三萜質量分數為2.6%。如表1所示，PFTP對6 種細胞的生長均具有抑制作用。隨著作用時間延長，PFTP對6 種細胞的增殖抑制能力均逐漸增強，表現出時間依賴性。PFTP對Eca109和CT26細胞抑制作用最強，在24 h對BGC823細胞無明顯抑制作用。Eca109為人源腫瘤細胞，而CT26屬于鼠源腫瘤細胞，因此本研究選用Eca109細胞系進行后續(xù)生物學分析。

表1 PFTP對腫瘤細胞的IC50Table 1 IC50 of PFTP againsttumor cells

2.2 PFTP對Eca109細胞凋亡的影響

圖1 PFTP對Eca109細胞凋亡和壞死的影響Fig. 1 PFTP promoted apoptosis and necrosis of Eca109 cells

1.6 mg/mL PFTP處理Eca109細胞24 h后，與空白對照和陰性對照組相比，陽性對照和PFTP組Eca109細胞凋亡率（PI和FITC雙陽區(qū)及FITC單陽區(qū)）和壞死率（PI單陽區(qū)）存在極顯著差異，說明PFTP可誘導Eca109細胞凋亡和壞死（圖1）。圖1B顯示PFTP誘導細胞凋亡的能力明顯弱于順鉑，但引起細胞壞死的能力強于順鉑。這種差異很可能由于PFTP成分復雜，主成分不單一，造成細胞不同程度的損傷，引起細胞壞死程度較高，但誘導細胞凋亡活性成分含量低，誘導細胞凋亡能力弱于順鉑，因此對PFTP作進一步分離提純。

2.3 PFTP各萃取相對Eca109細胞增殖的影響

以齊墩果酸標準品繪制的標準曲線y＝3.742 4x+0.078 9計算得到PFTP不同萃取相中三萜質量分數由高到低分別為PFTP-E（21.59%）、PFTP-P（14.22%）、PFTP-B（10.36%）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B對Eca109細胞的增殖抑制能力比萃取前的PFTP有明顯提高（圖2）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B在處理24、48、72 h對Eca109細胞的IC50分別為201.5、401.3、587.2 μg/mL，151.3、251.5、351.6 μg/mL和70.0、214.6、274.2 μg/mL，且處理時間越長IC50越?。幌嗤幚頃r間下PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B對Eca109細胞的IC50逐漸增大，表明PFTP各萃取相以時間和劑量依賴形式殺傷腫瘤細胞，PFTP-E對Eca109細胞的增殖抑制能力最強。由圖2E可知，PFTP-E質量濃度在400 μg/mL內對正常小鼠脾臟細胞處理24 h無毒副作用。如圖2D所示，400 μg/mL PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B細胞增殖抑制能力與三萜含量具有正向劑量-效應關系，初步猜測三萜類為PFTP中主要的抗腫瘤活性物質。因此用PFTP-E處理Eca109細胞24 h做進一步分析。

圖2 PFTP各萃取相對Eca109細胞增殖的影響Fig. 2 Effect of different solvent fractions of PFTP on proliferation of Eca109 cells

2.4 PFTP-E對Eca109細胞周期的阻滯作用

圖3 PFTP-E對Eca109細胞周期的影響Fig. 3 Effect of PFTP-E on cell cycle of Eca109 cells

如圖3A、B所示，PFTP-E可有效地將Eca109細胞周期阻滯在G2/M期，且質量濃度越大阻滯效果越明顯，G2/M期的細胞比例由PFTP-E 100 μg/mL的6.02%增加至300 μg/mL的18.68%。表明PFTP-E可將Eca109細胞周期阻滯在G2/M期，并具有濃度依賴性。Western blot結果顯示，PFTP-E可高度顯著下調G2期向M期轉換的關鍵周期蛋白Cyclin B1表達（圖3C、D），將細胞周期阻滯在G2/M期。

2.5 PFTP-E對Eca109細胞凋亡的影響

圖4 PFTP-E對Eca109細胞凋亡的影響Fig. 4 Effect of PFTP-E on apoptosis of Eca109 cells

PFTP-E將Eca109細胞周期阻滯于G2/M期，導致細胞不能進行正常增殖，因此進一步檢測其是否會導致細胞凋亡。圖4A顯示PFTP-E通過誘導Eca109細胞凋亡而抑制其生長。圖4B顯示PFTP-E處理24 h后細胞凋亡率與空白對照組相比呈顯著性差異，并在質量濃度為400 μg/mL時達到80%。圖4C顯示PFTP-E引起細胞毒性的原因為誘導細胞凋亡，這與PFTP誘導細胞壞死的結果存在差異。

細胞凋亡典型特征是細胞變圓、貼壁能力降低、內部染色質斷裂固縮、DNA片段化斷裂、細胞膜外翻等。通過Hoechst染色觀察核形態(tài)變化，由圖4D可觀察到，隨著PFTP-E質量濃度的增加（100～300 μg/mL），細胞數量相比于空白對照組明顯減少；空白對照組細胞為均勻藍色細胞核，PFTP-E處理組細胞核因高度固縮呈高亮藍白色（箭頭），具有顯著的濃度效應。綜合上述結果可以說明PFTP-E通過誘導Eca109細胞凋亡而抑制其生長。

2.6 PFTP-E對Eca109細胞線粒體膜電位的影響

線粒體作為細胞的能量工廠，對細胞存活、生長、增殖、分化具有重要的作用。一些作為抗腫瘤藥物的植物次生代謝物通常會激活凋亡途徑中經典的線粒體途徑[24]。圖5A顯示，PFTP-E以濃度依賴性的方式增加FITC綠色熒光強度（細胞門內），相比于空白對照組，PFTP-E質量濃度大于200 μg/mL時可極顯著增加JC-1單體熒光強度（圖5B），降低線粒體膜電位，導致線粒體膜電位崩潰。說明PFTP-E可能通過線粒體途徑誘導Eca109細胞凋亡。

圖5 PFTP-E對Eca109細胞線粒體膜電位的影響Fig. 5 Effect of PFTP-E on mitochondrial membrane potential of Eca109 cells

2.7 PFTP-E對Eca109細胞胞內ROS水平的影響

由圖6A可知，PFTP-E處理組熒光峰向右偏移。圖6B顯示與空白對照相比，PFTP-E處理組DCF相對熒光強度顯著增加（表現為處理組峰發(fā)生偏移），表明PFTP-E以濃度依賴性顯著誘導Eca109細胞胞內ROS產生。線粒體是ROS產生的主要細胞器，線粒體膜電位的降低致使線粒體膜通透性增加，導致ROS釋放到細胞質，從而誘導細胞凋亡[25]。因此推測PFTP-E可能引起癌細胞線粒體損傷，導致大量ROS釋放到胞質造成細胞損傷，使細胞增殖受到抑制，從而引起細胞凋亡。

圖6 PFTP-E對 Eca109細胞胞內ROS的影響Fig. 6 Effect of PFTP-E on intracellular ROS level of Eca109 cells

2.8 PFTP-E對Eca109細胞凋亡相關因子表達量的影響

圖7 PFTP-E對Eca109細胞凋亡相關因子表達量的影響Fig. 7 Effect of PFTP-E on the expression of apoptosis-related factors in Eca109 cells

為進一步證實PFTP-E能夠誘導Eca109細胞凋亡，通過Western blot法檢測胞質中的Cyt c以及凋亡相關蛋白分子Bcl2、Bax、PARP/剪切型PARP、Caspase3/剪切型Caspase3、Caspase9/剪切型Caspase9的表達變化，以及內質網應激相關蛋白eIF2α、CHOP和自噬標志物LC3 A/B的表達情況。如圖7A所示，與陰性對照組相比，PFTP-E可以增強Cyt c、促凋亡蛋白Bax的表達，并降低Bcl2蛋白的表達，且在300 μg/mL時顯著增強剪切型Caspase9、Caspase3、PARP的表達，激活經典的線粒體凋亡途徑。同時，PFTP-E處理也顯著提高了p-eIF2α、CHOP、LC3 A/B的表達（圖7B），可能引起內質網應激并進一步誘導細胞自噬的發(fā)生。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路可通過磷酸化來調節(jié)細胞增殖、細胞凋亡及遷移，是最常見的癌癥解除管制的信號途徑之一[26]。圖7C表明不同質量濃度PFTP-E處理Eca109細胞后可顯著提高p-JNK表達水平，表明PFTP-E可能通過影響MAPK/JNK信號通路來調控Eca109的細胞凋亡。

3 討 論

阿魏菇作為一種新疆特有藥食同源菌類，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。隨著研究的深入，發(fā)現阿魏菇醇提物主要活性成分為三萜類、生物堿類、皂苷類等化合物[15]。三萜類物質是一類重要的中藥化學成分，是藥用真菌的主要活性成分之一[16]。近幾年，對三萜類及其衍生物的抗腫瘤活性及其作用機制的研究成果迅速增加，大量研究表明三萜類化合物可以阻止腫瘤的發(fā)生，抑制癌細胞增殖、擴散、血管生成，誘導細胞凋亡分化和細胞周期阻滯，并促進化學增敏作用[27-28]。Sun Haiyan等報道從中草藥升麻中提取的環(huán)烷三萜ADCX可抑制P-gp高表達的多抗藥性細胞株HepG2/ADM增殖，并能通過抑制自噬降解進而促進其凋亡[18]。Zhao Yueliang也證實從澤瀉根中提取分離的澤瀉醋酸酯AB23A可以通過激活JNK途徑和抑制ROS的積累來誘導結腸癌SW480、HCT116細胞的自噬依賴性凋亡，且不影響正常結腸細胞CC4-841CON生長[19]。Chen Suyu等研究表明三萜類化合物可通過激活凋亡相關的分子PARP、Caspase3/9等來促進細胞凋亡[29]?；谌祁愶@著的抗腫瘤活性，為更好地開發(fā)利用阿魏菇資源，本研究制備了PFTP三萜（質量分數為2.6%），經萃取后的PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B三萜質量分數均具有較高程度的提高，分別為21.59%、14.22%、10.36%。MTT檢測結果顯示PFTP各萃取相均表現為時間和劑量依賴性地抑制Eca109細胞增殖，且抑制細胞增殖能力強弱順序均為PFTP-E＞PFTP-P＞PFTP-B，這與各相中三萜質量分數相對應，即抑制細胞增殖活性與三萜質量分數具有正向的劑量-效應關系，初步推測阿魏菇抗腫瘤活性物質可能為三萜類。

探討PFTP-E的抗腫瘤作用發(fā)現，PFTP-E對Eca109細胞處理24 h后的IC50由6.212 mg/mL降低至201.5 μg/mL，大幅提升抑制細胞增殖的能力。PFTP-E可將Eca109細胞周期阻滯在G2/M期而抑制細胞增殖，并降低細胞周期蛋白Cyclin B1的表達；且PFTP-E可導致Eca109細胞線粒體膜電位崩潰并激起胞內ROS水平顯著升高，表明PFTP-E可能通過線粒體途徑誘導Eca109細胞凋亡。進一步檢測凋亡相關分子的表達發(fā)現，PFTP-E處理后Cyt c表達量顯著升高，促凋亡因子Bax表達量增加，Bcl2表達量顯著降低，同時其能夠顯著增加剪切型PARP、Caspase3以及Caspase9的表達，表明PFTP-E可促進線粒體凋亡分子的表達，激活Caspase蛋白酶家族，從而抑制Eca109細胞生長，即PFTP-E通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。據報道，三萜類化合物為多靶向性殺傷腫瘤細胞的一類化合物，內質網應激引發(fā)細胞凋亡為其機制之一[16]。內質網是主要負責蛋白質合成、折疊、轉錄后修飾以及轉運的細胞器，GRP78是定位于內質網腔的一種維持胞內穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白，內質網穩(wěn)態(tài)時，GRP78結合蛋白激酶R樣內質網激酶（proteinkinaser-like ER kinase，PERK）并導致其失活；內質網應激時，PERK會從GRP78上釋放。PERK在內質網應激中的主要作用是抑制mRNA翻譯，減少錯誤蛋白質合成，引起eIF2α快速地磷酸化，抑制蛋白質合成，減輕內質網負擔。內質網功能持續(xù)紊亂將誘導CHOP的表達上調，CHOP作為調節(jié)內質網應激誘發(fā)的細胞凋亡蛋白可介導細胞程序性死亡。內質網應激已被證明是有效的自噬發(fā)生誘導條件，eIF2α通過磷酸化可激活自噬[30-32]。由圖7可知，PFTP-E可顯著上調p-eIF2α、CHOP和自噬標志物LC3 A/B的表達。綜上可知，PFTP-E可能通過激活經典線粒體途徑、細胞周期阻滯、內質網應激以及自噬而最終導致的凋亡（圖8）。MAPK在抗腫瘤治療中起重要作用，激活的MAPK可轉換細胞外來刺激信號以調節(jié)細胞凋亡、增殖和生長。MAPK包括ERK、JNK和p38。JNK是MAPK家族的一種壓力激活蛋白激酶，響應被激活的壓力信號，其中上游的MAP激酶激酶7可以通過磷酸化來調節(jié)JNK的激活，激活的JNK能夠調節(jié)很多轉錄因子，如AFT-2、c-Jun、AP-1和p53，它們能夠被磷酸化并作為轉錄因子去轉錄激活目標基因，引發(fā)一系列胞內程序，如細胞增殖、凋亡、自噬及DNA修復[33-34]，圖7C顯示PFTP-E可濃度依賴性地增加p-JNK的表達，因此其可能通過激活MAPK/JNK信號通路促進Eca109細胞凋亡。

圖8 PFTP-E誘導細胞凋亡相關途徑Fig. 8 PFTP-E induces apoptosis-related pathways

PFTP-E能夠上調促凋亡相關因子、下調抑凋亡相關因子的表達，表現出顯著的促細胞凋亡作用，其促凋亡機制涉及MAPK/JNK信號通路，并與線粒體損傷途徑、細胞周期阻滯、內質網應激及自噬有關（圖8）?？梢酝茰yPFTP-E可通過誘導腫瘤細胞凋亡進而達到治療癌癥的作用，隨著對阿魏菇三萜類物質不斷的深入研究，開發(fā)阿魏菇三萜類組分作為新型抗癌藥物具有廣闊前景。