植物源抗凍蛋白作用機(jī)制及其在食品中的應(yīng)用

于 晶，扈瑩瑩，溫榮欣，秦立剛，陳 倩

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物源抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是植物在外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)為保護(hù)細(xì)胞免受凍害而產(chǎn)生的一種功能性蛋白質(zhì)。AFPs在不同植物體內(nèi)的分布不同，它們都具有一定的抗凍活性，是一類能提高植物細(xì)胞抗凍活性的蛋白質(zhì)的總稱[1]。自20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)以來，有關(guān)AFPs的主要研究對(duì)象是魚類、昆蟲等，如今植物源AFPs已成為研究熱點(diǎn)。根據(jù)GB 2760—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》報(bào)道，AFPs可以作為新型食品添加劑添加到冷凍食品中[2]。

AFPs具有3 種特性，分別是熱滯活性、修飾冰晶生長(zhǎng)形態(tài)效應(yīng)和抑制冰晶再結(jié)晶。植物源AFPs相對(duì)于魚類、昆蟲源AFPs熱滯活性較低，但抑制冰晶再結(jié)晶能力較強(qiáng)[3]，因此認(rèn)為植物源AFPs調(diào)控抗凍性的主要途徑是通過抑制胞外冰晶的生長(zhǎng)及抑制冰的再結(jié)晶。植物源AFPs通過抑制溶液中冰晶的再結(jié)晶現(xiàn)象，減輕因環(huán)境溫度在零度以下附近波動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械損傷，抑制在冷藏過程中食品因反復(fù)凍融造成的質(zhì)量劣變，比其他來源的AFPs更適合添加到冷藏食品中。本文通過綜述植物源AFPs的作用機(jī)理、提取方法，以期為AFPs在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 植物源AFPs的概述

1.1 AFPs的來源

植物源AFPs主要來源于寒冷、高海拔地區(qū)的植物體內(nèi)，現(xiàn)植物源AFPs的研究對(duì)象有40余種，其中約在20 種高等植物中檢測(cè)到AFPs[4]，但真正被分離純化的植物源AFPs種類較少，主要分離自冬黑麥、沙冬青、胡蘿卜、女貞葉、黑麥草、苜蓿等。表1概括了不同植物源的AFPs，以及它們的存在形式和功能作用。植物源AFPs是一種適應(yīng)性蛋白，除低溫外，干旱[5]、脫落酸[6]、外源乙烯[7]等條件也可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生AFPs。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)AFPs在氨基酸序列、雙螺旋結(jié)構(gòu)、冰晶結(jié)合單元的特異性與植物表現(xiàn)出的抗凍特性相關(guān)。

表1 植物源AFPs來源分類及功能Table 1 Sources and functions of plant-dervied AFPs

1.2 AFPs的特性

1.2.1 熱滯活性

一般溶液（如NaCl、蔗糖溶液等）的冰點(diǎn)是固、液兩相蒸汽壓平衡時(shí)的溫度，因而冰點(diǎn)應(yīng)等于熔點(diǎn)。由于AFPs只影響結(jié)冰過程，幾乎不影響融化過程，使冰點(diǎn)低于熔點(diǎn)，其冰點(diǎn)和熔點(diǎn)的差值稱為熱滯差值，AFPs的這種活性稱為熱滯活性[16-17]。

1.2.2 修飾冰晶生長(zhǎng)形態(tài)效應(yīng)

在低溫環(huán)境下，冰晶由于受到AFPs的影響，其生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生改變，由正常冰晶的扁圓型生長(zhǎng)為六角形棱錐。隨AFPs的濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，冰晶的形態(tài)趨近針狀[18]。

1.2.3 抑制冰晶再結(jié)晶

在溶液冰點(diǎn)溫度下，溶液中的小冰晶逐漸消失聚集成為大冰晶，對(duì)產(chǎn)品的組織結(jié)構(gòu)造成破壞。添加AFPs可抑制溶液冰晶的再結(jié)晶現(xiàn)象，使小冰晶均勻分布[19]。

2 AFPs的作用機(jī)制

不同植物中的AFPs存在形式不同，并且沒有共同的演化規(guī)律[20]。然而，它們均具有熱滯活性、修飾冰晶生長(zhǎng)形態(tài)和抑制冰晶再結(jié)晶功能。其作用機(jī)理為AFPs在溶液中可調(diào)節(jié)原生質(zhì)溶液狀態(tài)，抑制冰晶的生長(zhǎng)活性，且在極低濃度條件下就能有效抑制再結(jié)晶，但無法降低冰點(diǎn)[21]。AFPs在溶液中作用方式可從能量和分子結(jié)合作用角度定義為熱動(dòng)力學(xué)作用原理和氫鍵結(jié)合作用。

2.1 熱動(dòng)力學(xué)作用原理

AFPs在溶液中遵循熱力學(xué)定律，在作用機(jī)制中，熱力學(xué)現(xiàn)象從宏觀物質(zhì)熱運(yùn)動(dòng)角度說明反應(yīng)可發(fā)生的程度，從動(dòng)力學(xué)角度說明具體生長(zhǎng)的效率。因此從宏觀熱動(dòng)力學(xué)角度將剛體能量學(xué)作用機(jī)制、冰晶吸附抑制作用機(jī)制、熱滯現(xiàn)象動(dòng)力學(xué)作用機(jī)制概括為熱動(dòng)力學(xué)作用原理。

2.1.1 剛體能量學(xué)作用機(jī)制

將溶液中AFPs視為極小的粒子，可根據(jù)界面能量推測(cè)它們?cè)诒?水界面的平衡位置，在冰晶生長(zhǎng)過程中，粒子與晶體和水相互作用。由表面能原理可知，由于“AFPs-冰晶”與“AFPs-水”表面存在差異，水會(huì)盡可能地縮小表面積減少界面總能量。因此，當(dāng)AFPs滯留在冰晶表面時(shí)，冰-水界面的面積減少使體系達(dá)到平衡。通常，水分子在冰晶表面推進(jìn)AFPs向前，在溶液中形成冰晶體[22]。在溫度降低到水溶液的過冷溫度以下1 ℃或是更低時(shí)，會(huì)產(chǎn)生很大的結(jié)晶壓力，但由于AFPs與冰晶結(jié)構(gòu)匹配時(shí)，水分子產(chǎn)生的結(jié)晶壓力使AFPs在冰晶表面保持平衡，使粒子固定在冰晶表面無法向前推進(jìn)。由此，冰晶的生長(zhǎng)只會(huì)發(fā)生在足以吞噬這些粒子的過冷狀態(tài)下，表現(xiàn)為冰點(diǎn)降低[23]。根據(jù)開爾文效應(yīng)，在彎曲冰晶表面冰點(diǎn)局部下降，冰晶在吸附的AFPs之間向前凸起（圖1）。

圖1 AFPs降低局部冰晶冰點(diǎn)示意圖[23]Fig. 1 Schematic diagram of the role of AFPs in reducing local ice crystal freezing point[23]

從剛體力學(xué)熱力學(xué)角度說明AFPs吸附在冰晶表面的原因與降低冰點(diǎn)的原理，需要進(jìn)一步討論AFPs吸附時(shí)間永久性、其作用效果與濃度之間的關(guān)系。

2.1.2 冰晶吸附抑制作用機(jī)制

在低溫條件下，AFPs具有選擇吸附性，與冰晶混合后吸附在冰晶生長(zhǎng)的表面。冰晶在AFPs分子之間的通路與水結(jié)合，在溶液中被AFPs分子覆蓋的冰晶表面停止生長(zhǎng)，而未被覆蓋的區(qū)域則沿著平面繼續(xù)向前推進(jìn)形成一個(gè)圓形的表面，使其表面曲率增加，具體見圖2。

圖2 AFPs吸附抑制冰晶生長(zhǎng)示意圖[24]Fig. 2 Schematic diagram of ice crystal growth inhibition by AFPs adsorption[24]

當(dāng)冰晶表面積與體積比超過冰晶自發(fā)生長(zhǎng)的熱力學(xué)值時(shí)，冰晶的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致冰點(diǎn)下降。換言之，由于AFPs吸附在冰晶生長(zhǎng)通路上，粘滯在冰晶表面的AFPs導(dǎo)致冰晶表面像曲面一樣彎曲。從熱力學(xué)角度來說，溶劑更傾向于在平滑的冰晶表面生長(zhǎng)，但由于冰晶表面曲率的增加使得溶劑不易附著在曲冰面上，因而冰晶的生長(zhǎng)受抑制。其中，AFPs會(huì)一直吸附在冰晶表面，直到冰晶受到外界作用融化，方可脫離冰晶表面，且AFPs濃度越高，其作用效果越好。吸附抑制作用機(jī)制在目前AFPs研究領(lǐng)域中較為合理，利用吸附抑制作用機(jī)制可以計(jì)算出AFPs吸附在冰晶表面導(dǎo)致的冰點(diǎn)下降值[25]。

2.1.3 熱滯現(xiàn)象動(dòng)力學(xué)作用機(jī)制

圖3 熱滯活性和冰晶形狀和結(jié)構(gòu)隨濃度變化情況[28]Fig. 3 Changes in ice crystal shape and structure with thermal hysteresis activity concentration[28]

目前，許多研究已經(jīng)證實(shí)熱滯活性具有濃度依賴性[26-27]，如圖3所示，AFPs其可以與冰晶平面相互作用，吸附在冰晶表面降低冰晶表面的冰點(diǎn)并提高冰晶內(nèi)部熔點(diǎn)，使冰晶產(chǎn)生熱滯差值，而且熱滯差值的增加與蛋白質(zhì)濃度的平方成正比，不同類型的AFPs在等濃度下可產(chǎn)生的熱滯差值也不同。AFPs還具有塑造冰晶表面晶體形狀的能力，AFPs存在時(shí)會(huì)影響溶液中冰晶的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，在AFPs作用活躍的情況下晶體延c軸方向生長(zhǎng)；溶液中不存在AFPs的情況下，冰晶會(huì)隨著溫度的降低而變大，類似于扁平型圓盤生長(zhǎng)，且冰點(diǎn)與熔點(diǎn)相等。

2.2 氫鍵結(jié)合作用

在溶液中AFPs與冰晶之間通過氫鍵進(jìn)行結(jié)合，但氫鍵形成方式不同，主要包括“偶極子-偶極子”、氫鍵結(jié)合、冰核抑制、表面互補(bǔ)這4 種作用機(jī)制。

2.2.1 “偶極子-偶極子”冰核抑制機(jī)理

在水分子中，由于氫原子與氧原子的電荷中心并不重合，在正電荷中心與負(fù)電荷中心之間存在一段微小的距離，在電場(chǎng)中的原子相當(dāng)于一個(gè)微觀的電偶極子受到電場(chǎng)的作用。AFPs雙螺旋結(jié)構(gòu)中具有平行于其螺旋軸的偶極子[29]，AFPs偶極子與冰核表面水分子偶極子的相互作用，使得水分子的無序性降低，在合向量方向上作用力最大。在低濃度的AFPs溶液中，由于冰晶表面AFPs濃度太低，導(dǎo)致無法進(jìn)行顯著的“偶極子-偶極子”相互作用，“偶極子-水”相互作用占主導(dǎo)地位，在冰核的棱鏡面上，AFPs的螺旋軸平行于冰晶偶極子合向量方向。AFPs與冰晶表面的相互作用會(huì)誘導(dǎo)棱鏡外層水分子局部有序排列。根據(jù)熵增原理，從c軸方向冰晶表面添加水分子比從冰晶表面添加水分子更加有利，所以冰核在c軸方向進(jìn)一步增長(zhǎng)。偶極子的相互作用改變了冰核的生長(zhǎng)習(xí)慣，形成了雙錐形冰晶體（圖4A），并抑制冰核在基面的生長(zhǎng)。隨著AFPs濃度的增加，棱鏡表面的“偶極子-偶極子”相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致棱鏡表面水分子的偶極子與AFPs螺旋軸的偶極子反向平行。在不同棱鏡面周圍的“偶極子-偶極子”相互作用下，AFPs的螺旋軸逐漸平行于冰晶的c軸，這樣改變了雙錐形晶體生長(zhǎng)方式的螺距，冰晶延c軸方向進(jìn)一步生長(zhǎng)（圖4B）。當(dāng)AFPs濃度足夠高時(shí)，所有的AFPs螺旋軸都平行于c軸，雙錐形狀近乎于針狀生長(zhǎng)（圖4C）。

圖4 冰晶朝c軸方向生長(zhǎng)模式[29]Fig. 4 Growth models of ice crystals in the c-axis direction[29]

“偶極子-偶極子”作用機(jī)制中AFPs與冰晶并不是以固定的方式結(jié)合，而是依靠冰核表面的水分子與AFPs的協(xié)同作用。由于AFPs螺旋軸表面散布著正電荷與負(fù)電荷[30]，這些暴露的電荷對(duì)冰核表面的水分子偶極子產(chǎn)生了影響，這就意味著可以存在許多氫鍵模式，AFPs螺旋的偶極特性可能是這一結(jié)合形式的關(guān)鍵性因素。

2.2.2 氫原子結(jié)合作用機(jī)制

氫原子結(jié)合作用機(jī)制也稱為“晶格匹配”或“氫鍵匹配作用機(jī)制”，在AFPs結(jié)構(gòu)中存在β-鏈、α-轉(zhuǎn)角和跨主鏈鏈接的氫鍵結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)賦予AFPs剛性球形褶皺（圖5A），AFPs中5 種含羥基氨基酸——谷氨酰胺（Gin）9、蘇氨酸（Thr）18、蘇氨酸（Thr）15、谷氨酰胺（Gin）44和天冬酰胺（Asn）14的羥基在主鏈和側(cè)鏈上形成平坦的表面[31]。對(duì)溶劑結(jié)構(gòu)分析表明，AFPs沒有增強(qiáng)與水相互作用的能力，而是與冰產(chǎn)生線性結(jié)構(gòu)的相互作用[32]。AFPs剛性平坦表面與平坦的冰晶表面之間形狀互補(bǔ)，使AFPs表面親水基團(tuán)與冰晶表面氧原子形成氫鍵，多個(gè)氫鍵的精確匹配提供了很強(qiáng)的結(jié)合性和特異性，緊密連接的冰結(jié)合位點(diǎn)通過范德華力直接排斥干擾冰晶與水分子的進(jìn)一步結(jié)合。

AFPs覆蓋在冰晶的基面并與冰晶的棱鏡面結(jié)合（圖5B），AFPs冰結(jié)合位點(diǎn)不僅降低了冰晶的凍結(jié)活性，而且對(duì)冰晶的形態(tài)產(chǎn)生了影響，在AFPs存在下形成的冰晶為短六角形雙錐體，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)冰晶延c軸生長(zhǎng)形成雙錐體結(jié)構(gòu)。

圖5 氫原子結(jié)合作用機(jī)制中AFPs剛性結(jié)構(gòu)與結(jié)合方式[31]Fig. 5 AFPs rigid structure and bonding mode in hydrogen atom-binding mechanism[31]

2.2.3 冰核抑制作用機(jī)制

冰核是形成冰晶的基礎(chǔ)，沒有冰核的存在，冰晶也就不能生長(zhǎng)。AFPs具有“冰結(jié)合面”和“非冰結(jié)合面”兩種不同面。其中，“冰結(jié)合面”上羥基和甲基有序間隔排列使得冰結(jié)合面上形成類冰水合層，促進(jìn)冰核生成；而“非冰結(jié)合面”上存在的帶電荷側(cè)鏈及疏水性側(cè)鏈，使得非冰結(jié)合面上的界面水無序，抑制冰核形成[33]。該作用機(jī)制在分子層面揭示了AFPs抑制冰核形成的原理。

2.2.4 “AFPs-冰晶”表面互補(bǔ)作用機(jī)制

冰晶與AFPs表面互補(bǔ)結(jié)合受多種作用力影響[34]。在“AFPs-冰晶”結(jié)合表面，冰如同“配體”與AFPs“受體”結(jié)合，因此該作用機(jī)制也被稱為“受體-配體”作用機(jī)制[35]。Kuiper等[36]發(fā)現(xiàn)黑麥草的AFPs一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有許多重復(fù)性序列，在118 個(gè)氨基酸的多肽中，每14～15 個(gè)氨基酸組成一個(gè)環(huán)，8 個(gè)這樣的環(huán)組成一個(gè)β-筒狀結(jié)構(gòu)，β-筒狀結(jié)構(gòu)的一端是保守的纈氨酸疏水核，另一端是由內(nèi)部天冬酰氨構(gòu)成的梯狀結(jié)構(gòu)。纈氨酸是疏水性氨基酸，天冬酰氨是親水性氨基酸；β-筒狀結(jié)構(gòu)的親水端與冰晶表面吻合互補(bǔ)，疏水端則有效地防止了水與冰晶的結(jié)合，阻止了冰晶繼續(xù)生長(zhǎng)，假定與冰晶結(jié)合區(qū)域AFPs表面平行（圖6A）。在實(shí)際運(yùn)用中，冰晶有許多不同的表面，每一個(gè)表面與氧原子間距都不同，冰晶就像配體一樣，通過表面互補(bǔ)選擇性地與不同受體的AFPs結(jié)合（圖6B），這種表面互補(bǔ)方式可適用于所有AFPs[37]。AFPs的“表面互補(bǔ)”作用機(jī)制在解釋多種冰晶表面與AFPs結(jié)合方式上提供了最合理的說明，但目前結(jié)合表面各種作用力的方式和大小還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證[38]。

圖6 AFPs與冰晶表面互補(bǔ)示意圖[36]Fig. 6 Schematic diagram of complementation between AFPs and ice crystal surface[36]

綜上所述，AFPs作用的共同特征如下：1）AFPs與冰晶表面結(jié)合取決于兩個(gè)因素：一是由于熱動(dòng)力學(xué)活性的平衡狀態(tài)使AFPs吸附在冰晶表面保持能量最低；二是由于AFPs的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與冰晶表面產(chǎn)生相互作用；2）AFPs在熱動(dòng)力學(xué)環(huán)境中相當(dāng)于一個(gè)雜質(zhì)粒子，在不存在相互作用的前提下不偏向于水或者是冰晶，由開爾文定律分析可知AFPs必須吸附在冰晶表面；3）AFPs氫鍵作用原理是依靠某種作用力與冰晶表面或冰核周圍水分子發(fā)生作用，阻止冰晶的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低冰點(diǎn)，引起熱滯活性效應(yīng)，同時(shí)依靠該作用力可抑制再結(jié)晶，也可以通過測(cè)定其熱滯差值和冰晶結(jié)構(gòu)驗(yàn)證該種AFPs是否存在；4）AFPs的作用能力與其濃度有關(guān)，且濃度越大作用效果越強(qiáng)，AFPs也存在一個(gè)漸近的活性飽和濃度，超過此濃度后，其抗凍能力不再增加，類似于酶類作用機(jī)制；5）在多種作用機(jī)制中提出AFPs有親水作用基團(tuán)和疏水作用基團(tuán)，作用基團(tuán)的存在與AFPs的氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 植物源AFPs的分離純化方法

3.1 滲透離心法

滲透離心法利用緩沖溶液以一定的固液比對(duì)植物進(jìn)行均漿、滲透離心、過濾、離心、凍干，最終得到AFPs粉末。此外，綠色葉蛋白還需經(jīng)過脫色等前處理，該種方法是提取植物源AFPs最常用的方法。尉姍姍等[39]利用纖維素DE-52離子柱層析提取分離出了冬季新疆沙冬青葉片中的AFPs，經(jīng)差示掃描熱量法測(cè)定分離出的蛋白組分熱滯活性，結(jié)果顯示當(dāng)AFPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.36%時(shí)熱滯差值為0.46 ℃。提取后脫色采用有機(jī)溶劑或超臨界CO2流體萃取，可獲得高品質(zhì)葉蛋白[40]。Jarz?bek等[41]從木本植物針葉云杉中利用抗壞血酸真空滲透、離心收回滲透液獲得AFPs，根據(jù)實(shí)驗(yàn)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）顯示，在這些云杉中積累了5～9 個(gè)多肽帶，此植物源AFPs的分子質(zhì)量為7～80 kDa。Simpson等[42]使用液氮研磨、浸提、離心的方法提取連翹樹皮中的蛋白質(zhì)，后利用陰離子交換、羥基磷灰石層析和凝膠溶液溶解從蛋白質(zhì)中分離純化出分子質(zhì)量為20 kDa的AFPs。

3.2 冰特異性吸附分離法

冰特異性吸附分離法是利用AFPs可特異性吸附在冰晶表面的特點(diǎn)，利用新型的冰晶吸附設(shè)備或冰塊從粗提物中純化與冰晶結(jié)合的AFPs，該種方法可明顯提高AFPs的濃度，操作簡(jiǎn)單方便。劉尚等[43]根據(jù)AFPs與冰晶的特異性結(jié)合，將碎冰放入女貞葉提取液中，通過碎冰吸附、凝膠過濾和離子交換層析，獲得了4 個(gè)組分的蛋白質(zhì)，其中的1 個(gè)經(jīng)鑒定具有熱滯活性，該蛋白親水性氨基酸含量較高，確定為AFPs。Kuiper等[44]設(shè)計(jì)“冷手指”設(shè)備，該設(shè)備中的“冷手指”通過內(nèi)部絕緣塑料管連接可編程水浴溫度控制裝置，讓AFPs生長(zhǎng)在“冰手指”上，結(jié)束時(shí)將“冷手指”上的冰塊融化后可用于第二輪吸附，冰餾分中的AFPs可以通過凍干或超濾回收。Zhang Chao等[45]參考Kuiper等[44]的實(shí)驗(yàn)裝置并進(jìn)行了改進(jìn)，利用三段提取法從小麥麩皮中提取并純化植物源AFPs，結(jié)合冰特異性吸附原理提取純化系數(shù)比傳統(tǒng)非冰特異性吸附法高270 倍。

3.3 濁點(diǎn)萃取法

濁點(diǎn)萃取法利用非離子表面活化劑吸附水中懸浮的固體顆粒，加速懸浮液中粒子的沉降，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物質(zhì)的分離。非離子表面活性劑在水溶液中的溶解度隨著溫度的升高而降低，在升至一定溫度時(shí)出現(xiàn)渾濁，可在放置或離心后得到兩個(gè)液相，該溫度叫濁點(diǎn)溫度。濁點(diǎn)萃取法是分離科學(xué)領(lǐng)域一種新型的提取方法，利用表面活性材料在加熱條件下，由于非離子表面活性物質(zhì)在濁點(diǎn)溫度分離成界面清晰的兩相，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組分分離[46]。濁點(diǎn)萃取技術(shù)大多用于親水蛋白與疏水蛋白的分離，并且擴(kuò)展到植物化學(xué)物質(zhì)的分離和與預(yù)濃縮[47]。Xu Huaneng等[48]將濁點(diǎn)萃取法用于冬小麥AFPs的分離純化，最后得到的蛋白產(chǎn)品用SDS-PAGE測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量范圍為15～30 kDa。

4 植物源AFPs在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

冷凍是食品冷鏈運(yùn)輸環(huán)節(jié)最重要的一個(gè)階段，且冷藏是食品領(lǐng)域常用的貯藏方式，在食品的冷鏈運(yùn)輸中極易發(fā)生溫度波動(dòng)的現(xiàn)象，使食品發(fā)生冷凍-解凍循環(huán)。因此不可避免地發(fā)生冰晶再結(jié)晶現(xiàn)象，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞組織造成破壞，導(dǎo)致食品理化性質(zhì)、組織形態(tài)發(fā)生變化[49]。同時(shí)，水的再結(jié)晶現(xiàn)象也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部組分發(fā)生改變，比如產(chǎn)生蛋白質(zhì)變性、淀粉回生等現(xiàn)象[50]。植物源AFPs作為冷凍食品添加劑，可以有效提高冷凍食品的品質(zhì)。

4.1 在冰激凌中的應(yīng)用

冷凍甜乳品冰晶的形成和再結(jié)晶對(duì)于產(chǎn)品的品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用，冰晶的形成過程決定冷凍乳品硬化和貯存過程中冰晶的生長(zhǎng)情況，影響冰激凌的乳脂狀態(tài)、粗糙和水潤(rùn)程度、硬度、冰爽口感等感官品質(zhì)；而再結(jié)晶決定了整個(gè)冷凍操作后冰激凌質(zhì)地和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。通過添加AFPs可從機(jī)械的角度控制冰晶冰核的大小，抑制蔗糖溶液中的冰晶生長(zhǎng)，改善靜態(tài)貯存條件下的穩(wěn)定性[51]。

Lillford等[51]從冬季小麥草中提取AFPs添加到冰激凌中，通過實(shí)驗(yàn)研究觀察到，AFPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.05%～0.10%時(shí)即可誘導(dǎo)冰晶平均尺寸減小。Regand等[52]將冬麥草AFPs添加到冰激凌中，通過亮視野顯微技術(shù)觀察到，當(dāng)粗蛋白添加量達(dá)到0.003%時(shí)，冬麥草AFPs表現(xiàn)出明顯的抗凍性。對(duì)低溫貯藏（-18 ℃）1 個(gè)月之后的冰激凌進(jìn)行感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，溫度在-18 ℃和波動(dòng)條件（-20～-10 ℃）下空白組的冰激凌非常粗糙，冰激凌的冰晶成片狀，而添加冬麥草AFPs的冰激凌口感滑膩、冰晶細(xì)小且均勻，證實(shí)了添加冬麥草AFPs能夠修飾冰激凌冰晶的生長(zhǎng)形態(tài)，且抑制再結(jié)晶；此外，通過熱激處理進(jìn)行驗(yàn)證，在巴氏殺菌條件下冬麥草AFPs活性沒有受到影響，在添加量達(dá)到0.13%時(shí)冬麥草AFPs活性效果最好。Zhang Yanjie等[53]從冷馴化的燕麥中提取AFPs，在冰激凌中添加AFPs（添加量為0.1%）即可使玻璃化轉(zhuǎn)變溫度從-29.14 ℃上升到-27.74 ℃，提高了冰激凌抗融性并有效抑制了其再結(jié)晶。通過添加植物源AFPs減輕了冷凍和溫度波動(dòng)對(duì)冰激淋的損傷，從而獲得了品質(zhì)與口感優(yōu)質(zhì)的冷凍食品。

4.2 在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

淀粉是多種食品加工過程中必不可少的加工原料，植物源AFPs在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用也相對(duì)較多。植物源AFPs可調(diào)節(jié)面團(tuán)中結(jié)晶水析出的量，使面團(tuán)中的水和面筋保持冷凍前的狀態(tài)，進(jìn)而使得面團(tuán)中的凝膠穩(wěn)定性、發(fā)酵面團(tuán)的孔洞大小和均勻度、熟制后面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)和香氣等不發(fā)生劣變[54]。

賈春利等[55]將女貞葉AFPs添加到小麥淀粉中，研究了淀粉凝膠凍融后的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著女貞葉AFPs濃度的增加，凍融淀粉析水率和可凍結(jié)含水量顯著降低，凝膠超微結(jié)構(gòu)被修飾使得淀粉孔洞增大受到抑制，其均勻性提升，延緩了凝膠硬度增加和彈性降低，改善了凍融后凝膠質(zhì)構(gòu)。Kontogiorgos等[56-57]從冬麥草中分離得到一種熱穩(wěn)定性AFPs，并將其加入到面團(tuán)中，發(fā)現(xiàn)空白面團(tuán)在溫度波動(dòng)條件下（-20～-10 ℃）貯藏30 d，其面筋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而加入0.1%冬麥草AFPs的面團(tuán)中冰晶再結(jié)晶現(xiàn)象降低，面團(tuán)面筋網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)較小且形狀均勻。此外，Liu Mei等[58]在面團(tuán)中加入胡蘿卜AFPs，發(fā)現(xiàn)添加胡蘿卜AFPs降低了面團(tuán)在冷凍-解凍循環(huán)過程中凍融水含量的增加，減弱了冷凍-解凍循環(huán)對(duì)冷凍面團(tuán)貯藏性能和超微結(jié)構(gòu)的破壞，從而改善了面團(tuán)熟制后的特征體積和質(zhì)構(gòu)特性。夏露等[59]以冬小麥麩皮中提取的AFPs作為添加劑，分別以相對(duì)于糯米粉1%、2%、2.5%、3%的添加量制備速凍湯圓，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2.5%的AFPs添加量對(duì)湯圓的品質(zhì)有明顯提高，煮熟后的湯圓外觀光滑，彈性好，渾湯清澈透明。

4.3 在新鮮水果中的應(yīng)用

速凍水果含水量高，在冷凍冷藏過程中易出現(xiàn)汁液流失、果實(shí)軟爛變形等現(xiàn)象[60]。將海藻糖與冬小麥AFPs混合注入新鮮草莓中，然后經(jīng)液氮冷凍，在解凍之后測(cè)定其細(xì)胞活性和汁液損失率，結(jié)果表明AFPs顯著提高了草莓的耐凍性，并且能夠保留其原有的形態(tài)和水果本身的紋理形狀，保持水果的感官與風(fēng)味[61]。Cruz等[62]利用真空浸漬法將豆瓣菜葉片與AFPs在封閉儲(chǔ)罐中進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過短時(shí)間的真空壓力作用和常壓恢復(fù)過程，AFPs與豆瓣菜葉片毛孔直接接觸，避免其了對(duì)葉片組織的損傷，降低葉片汁液損失；通過微觀結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，豆瓣菜葉片中冰晶較小。新鮮的果蔬抗凍保護(hù)重點(diǎn)在于冷凍后的細(xì)胞形態(tài)是否完整、凍傷組織的細(xì)胞活力是否存在，而且果蔬抗凍領(lǐng)域不同的AFPs對(duì)于果蔬類細(xì)胞食品的適用性也需要進(jìn)一步研究[63]。

5 結(jié) 語

植物體內(nèi)產(chǎn)生AFPs是一個(gè)復(fù)雜的過程，植物源AFPs的存在與植物的生長(zhǎng)抗性密切相關(guān)，外界環(huán)境的改變會(huì)直接影響植物源AFPs濃度，同時(shí)化學(xué)誘導(dǎo)等因素也會(huì)刺激植物產(chǎn)生AFPs，其中食品領(lǐng)域多采用克隆或轉(zhuǎn)基因的途徑獲取植物源AFPs。植物源AFPs可抑制食品在凍結(jié)和凍藏過程中再結(jié)晶現(xiàn)象，減少解凍時(shí)汁液流造成的營(yíng)養(yǎng)及品質(zhì)的降低。此外，植物源AFPs無毒性，在多種食品中添加不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，其不存在毒性蛋白的特性[64]，因此研究植物源AFPs在未來食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。

目前，對(duì)AFPs作用機(jī)理的研究可為食品抗凍技術(shù)提供新的研究方向，同時(shí)也為生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù)。然而，植物源AFPs在其規(guī)模化應(yīng)用方面仍受到較大限制，這主要是由于從植物體內(nèi)提取的AFPs量少，無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)；而人工合成成本高，可重復(fù)性差。因此，利用植物源AFPs的自身性質(zhì)，如相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、熱滯活性及其抗凍作用機(jī)制開發(fā)大規(guī)模投入使用的高效分離純化方法，并找到植物源AFPs在各類食品中應(yīng)用的最佳條件，可為冷鏈?zhǔn)称飞a(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏提供保障。同時(shí)，利用基因技術(shù)，將植物體內(nèi)的抗凍基因轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中，以期獲得大量的具有抗凍活性分子，也將是我們?cè)谥参镌碅FPs食品應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)新方向。