以豬小腸黏膜提取物作為α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV的酶活力分析體系的建立

甲承立，Naveed HUSSAIN，董 潔，王 芬，李函彤，張書文，蘆 晶，逄曉陽，劉 鷺，呂加平,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京 100093；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030800；3.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；4.北京市營養(yǎng)源研究所系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，北京 100069）

隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率也在逐年上升，成為繼腫瘤、心血管疾病的第三大疾病[1]。其中，II型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90%以上。II型糖尿病是由胰島素分泌不足、胰島素抵抗以及機體肝臟、脂肪等細胞內(nèi)的血糖氧化利用過程受到了阻礙發(fā)生高血糖等原因造成的[2]。

α-葡萄糖苷酶又稱α-D-葡萄糖苷水解酶（α-glucosidase，GAA），主要存在于小腸刷狀緣細胞膜上。GAA主要通過切開低聚糖非還原末端的α-1,4糖苷鍵方式水解低聚糖。抑制α-葡萄糖苷酶活性有利于減緩葡萄糖的生成和吸收，從而降低血糖水平。α-葡萄糖苷酶可將底物對硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG）水解為黃色的對硝基酚（p-nitrophenol，PNP）[3]，從而可通過PNP的濃度來衡量α-葡萄糖苷酶的體外活性。Shantha Kumara等[4]發(fā)現(xiàn)Brettanomyces lambicus菌體內(nèi)存在兩種α-葡萄糖苷酶，即胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶和胞外α-葡萄糖苷酶，胞內(nèi)酶為脂溶性酶，一部分與細胞膜結(jié)合，且含量比胞外酶高。因此，本研究提取制備α-葡萄糖苷酶時需將豬小腸黏膜提取物研磨破碎。

二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）是廣泛存在于細胞膜上的一類具有潛在的調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌以及神經(jīng)系統(tǒng)等功能的膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶，存在于多種器官中且家族成員眾多[5]。DPP-4能快速降解胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide，GLP）-1與葡萄糖依賴性胰島素釋放肽（glucose dependent insulinotropic polypeptide，GIP）。GLP-1、GIP這兩種肽類激素能促進胰島β細胞分泌胰島素，并減少胰島α細胞分泌胰高血糖素，從而降低血糖水平[6]。因此，開發(fā)出具有DPP-4抑制功能的活性物質(zhì)或藥物，可用于Ⅱ型糖尿病的防治。DPP-4體外酶活力的測定主要是依據(jù)DPP-4能催化水解底物甘氨酸脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-p-nitroanilide，Gly-Pro-pNA）生成黃色的pNA[7]。

近年來，具有Ⅱ型糖尿病輔助治療作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑和DPP-4抑制劑引起廣泛關(guān)注[8]。在研究中，篩選這兩種抑制劑的常用酶多來自于酵母等微生物[9-10]。目前市場上已有多種商業(yè)化α-葡萄糖苷酶和DPP-4，一方面價格昂貴；另一方面這些主要來源于微生物代謝產(chǎn)物的商業(yè)化酶與哺乳動物腸道內(nèi)α-葡萄糖苷酶和DPP-4有一定的差異性，不適合于用作這兩種酶抑制劑的篩選。Zeng Zhu等[11]從豬小腸中提取黏膜分泌物作為α-葡萄糖苷酶，篩選了多種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的乳酸菌；原愛紅[12]、Zhang Jianfen[13]等報道了大鼠大腸黏膜提取糖苷酶的工藝；張超等[7]從DPP-4/CHO工程株細胞中提取DPP-4，建立了一個DPP-4抑制劑的篩選模型；陳靜等[14]從分化成熟的人克隆結(jié)腸腺癌細胞（Caco-2細胞）中提取DPP-4，并建立了體外篩選DPP-4抑制劑的模型。但從哺乳動物小腸同時提取α-葡萄糖苷酶、DPP-4并建立測定方法的研究并不多。本研究以新鮮豬小腸為原料，對小腸不同部位的α-葡萄糖苷酶和DPP-4的分布及活力進行分析。不同部位小腸黏膜提取物均具有高濃度的α-葡萄糖苷酶和DPP-4，兩種酶混合在一起，通過商業(yè)酶分別建立標準酶活力分析體系，將混合物稀釋不同倍數(shù)，和對應(yīng)的底物反應(yīng)，確定混合物中兩種酶的活力及比活力，從而建立豬小腸源α-葡萄糖苷酶及DPP-4活力分析體系，為篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑和建立DPP-4抑制劑測定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬小腸購自北京第五肉聯(lián)廠。

酵母源α-葡萄糖苷酶、重組人源DPP-4、PNPG、Gly-Pro-pNA 美國Sigma公司；阿卡波糖 意大利J&K公司；抑二肽素A（diprotin A，IPI） 英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒 美國Biomiga公司；無水碳酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spark 20M全波長酶標儀 瑞士TECAN公司；3K15離心機 德國Sigma公司；xianou-48高通量組織研磨儀南京先歐儀器制造有限公司；MB-102恒溫金屬浴杭州博日科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬小腸黏膜液的制備

豬小腸黏膜液的制備參考文獻[11]。將新鮮的豬小腸排出內(nèi)容雜質(zhì)后在-20 ℃冰箱凍存。使用時，37 ℃溫水浴快速解凍，用4 ℃、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗。在冰溫環(huán)境下切開，用干凈的載玻片刮取腸（十二指腸、空腸、回腸）黏膜及其表面黏液。取不同部位的黏膜提取物，加入與提取物等體積的PBS（4 ℃、pH 6.8），低溫下勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取上清液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總蛋白質(zhì)量濃度的測定

取十二指腸、空腸、回腸黏膜提取物各10 μL，加入990 μL PBS（pH 6.8）（相當于稀釋100 倍），混勻，待測。BCA工作液、蛋白標準液配制及蛋白質(zhì)量濃度的測定參考BCA蛋白定量試劑盒方法與文獻[15]。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活力的測定

37 ℃時pH 6.8 PBS中，以1 min內(nèi)催化PNPG反應(yīng)生成1 μmol PNP所需α-葡萄糖苷酶的量為1 個酶活力單位[16]。PNP在405 nm波長處具有強烈光吸收，因此，可用1 min內(nèi)吸光度的變化量表征酶活力。

α-葡萄糖苷酶活力的測定參考文獻[17]。以96 孔板為反應(yīng)載體，每個樣品做3 個平行。反應(yīng)體系為：實驗組加入不同濃度的底物（PNPG）25 μL，空白組加入25 μL 0.1 mol/L PBS（pH 6.8），37 ℃恒溫金屬浴預(yù)熱10 min，然后加入50 μL不同濃度的α-葡萄糖苷酶或豬小腸稀釋液，37 ℃下反應(yīng)一定時間，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)。用酶標儀在405 nm波長處測定吸光度。考察不同酶解時間（0～24 min）、底物濃度（0～6 mmol/L）及酶濃度（0～50 U/L）對α-葡萄糖苷酶活力的影響。將豬小腸不同部位黏膜提取提取物分別稀釋不同倍數(shù)，測定豬小腸黏膜提取物中α-葡萄糖苷酶活力。

1.3.4 DPP-4活力的測定

底物Gly-Pro-pNA在DPP-4的作用下發(fā)生降解，生成的pNA在405 nm左右波長處具有強烈光吸收，因此以單位時間內(nèi)吸光度的變化量來表示酶活力[18]。

DPP-4活力的測定參考文獻[19]，以96 孔板為反應(yīng)載體，每個樣品做3 個平行。反應(yīng)體系為：實驗組加入不同濃度的底物Gly-Pro-pNA 25 μL，空白組加入25 μL 0.1 mol/L PBS（pH 6.8），37 ℃恒溫金屬浴預(yù)熱10 min，然后加入50 μL DPP-4（或豬小腸稀釋液），37 ℃下反應(yīng)一定時間，加入100 μL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標儀測定溶液在405 nm波長處的吸光度。

1.3.5 酶活力測定體系的驗證

阿卡波糖、IPI是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，常被作為陽性藥評價α-葡萄糖苷酶活力測定體系的有效性，同時可以作為對照評價其他抑制劑的效果。本實驗通過測定陽性藥物阿卡波糖和IPI（樣品）對酵母源α-葡萄糖苷酶、重組人源DPP-4、豬小腸提取物稀釋液（底物）的抑制活性，對酶促體系進行評價[20-21]。操作步驟見1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)。α-葡萄糖苷酶、DPP-4抑制率的計算見下式[22]。

式中：A1、A2、A3、A4代表不同反應(yīng)體系的吸光度，其中A1體系中含底物，樣品用PBS（0.1 mol/L、pH 6.8，下同）代替；A2體系中底物和樣品均用PBS替代；A3體系中含底物和樣品；A4體系中底物用PBS替代，含樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，使用單因素方差分析法進行差異顯著性分析，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬小腸不同部位的黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力

2.1.1 α-葡萄糖苷酶活力測定體系的建立

圖1 α-葡萄糖苷酶在不同酶促條件下的活力Fig. 1 α-Glucosidase activity under different enzymatic reaction conditions

利用商業(yè)化酵母來源的α-葡萄糖苷酶建立其活力的測定體系，獲得酶活力標準曲線，并以此為標準，確定不同部位豬小腸黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力。如圖1A所示，在底物濃度為5 mmol/L、酶濃度為50 U/L條件下，反應(yīng)時間與體系吸光度關(guān)系呈現(xiàn)拋物線形式。0～15 min內(nèi)α-葡萄糖苷酶與底物PNPG迅速反應(yīng)，吸光度呈線性變化，說明α-葡萄糖苷酶在0～15 min內(nèi)的量充足。18 min后，吸光度變化放緩，說明底物的量已無法滿足反應(yīng)的進行，反應(yīng)21 min后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），酶促反應(yīng)條件應(yīng)準確描述酶促反應(yīng)的初速率，因此確定15 min為最佳酶促反應(yīng)時間。

如圖1B所示，在酶濃度為50 U/L下反應(yīng)15 min，底物濃度與體系吸光度之間呈現(xiàn)典型的拋物線形式，即底物濃度較低時，反應(yīng)速率較大，吸光度變化較快；當?shù)孜餄舛却笥? mmol/L時，反應(yīng)體系吸光度無顯著變化（P＞0.05）。當?shù)孜餄舛冗_到5 mmol/L時，吸光度最大。為了保證酶的充分反應(yīng)，應(yīng)保證底物的適度過量[23]，因此反應(yīng)體系底物PNPG的最適濃度為5 mmol/L。

如圖1C所示，在底物濃度為5 mmol/L、反應(yīng)時間為15 min時，體系吸光度與酶濃度（0～50 U/L）呈良好的線性關(guān)系（R2＝0.999），表明此時酶濃度與吸光度成正比，酶促反應(yīng)速率恒定。

綜上可知，α-葡萄糖苷酶催化PNPG的最佳反應(yīng)條件：底物PNPG濃度為5 mmol/L，于37 ℃反應(yīng)15 min，產(chǎn)物的吸光度約為0.2～0.4，α-葡萄糖苷酶濃度20～40 U/L。該結(jié)果與先前的報道結(jié)果[15,24]一致，說明反應(yīng)體系可靠。

2.1.2 豬小腸不同部位的黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力分析

2.1.2.1 豬小腸不同部位黏膜提取物的稀釋倍數(shù)

圖2 豬小腸黏膜提取物稀釋不同倍數(shù)后的α-葡萄糖苷酶活力Fig. 2 α-Glucosidase activity from porcine small intestinal mucosal extracts diluted at different folds

圖2 A為不同稀釋倍數(shù)的豬十二指腸黏膜提取物與5 mmol/L α-葡萄糖苷酶底物（PNPG）在37 ℃下反應(yīng)15 min后α-葡萄糖苷酶活力變化，十二指腸提取物稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與吸光度呈線性關(guān)系（y＝3.492 7x+0.034 5，R2＝0.997 8）。根據(jù)圖1C可知，標準α-葡萄糖苷酶反應(yīng)體系中，酶濃度為40 U/L時的吸光度為0.367，將0.367作為y值代入圖2A中的公式，得到的x值即為相當于40 U/L標準酶的豬十二指腸黏膜提取物的稀釋倍數(shù)。因此具有與40 U/L α-葡萄糖苷酶相同活力的豬十二指腸黏膜提取物的稀釋倍數(shù)應(yīng)為10.7 倍。

圖2B表示稀釋不同倍數(shù)豬空腸黏膜提取物與5 mmol/L α-葡萄糖苷酶底物（PNPG）在37 ℃下反應(yīng)15 min后，體系的吸光度變化，稀釋倍數(shù)倒數(shù)與吸光度呈線性關(guān)系（y＝5.106 4x+0.037 2，R2＝0.997 2）。在確定的最佳酶活力測定體系中，豬空腸黏膜提取物具有40 U/L α-葡萄糖苷酶活力時的稀釋倍數(shù)為16.0 倍。

圖2C表示稀釋不同倍數(shù)豬回腸黏膜提取物與5 mmol/L底物在37 ℃下反應(yīng)15 min，體系吸光度變化，吸光度與稀釋倍數(shù)的倒數(shù)具有線性關(guān)系（y＝17.359 7x+0.044 1，R2＝0.998 9）。在確定的最佳酶活力測定體系中，豬空腸黏膜提取物具有40 U/L α-葡萄糖苷酶酶活力時的稀釋倍數(shù)為54.7 倍。

通過觀察，圖2A～C中所得公式的斜率是依次增大的（3.492 7＜5.106 4＜17.359 7），說明豬十二指腸、豬空腸和豬回腸黏膜提取物中的α-葡萄糖苷酶活力依次升高，含量依次增多。當把3 個部位豬小腸黏膜提取物稀釋到相當于標準酶40 U/L時，豬回腸黏膜提取物需要更大的稀釋倍數(shù)（54.7），這也印證了上述結(jié)論。Zeng Zhu等[11]的研究中將豬小腸混合提取物稀釋20 倍作為α-葡萄糖苷酶，但并未對具體細節(jié)作闡釋。

2.1.2.2 豬小腸不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力分析

表1 豬小腸不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力比較Table 1 Comparison of α-glucosidase activity of porcine intestinal mucosal extracts

如表1所示，豬回腸黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶比活力在3 種提取物中最高，為0.084 1 U/mg，大約是豬十二指腸的2 倍，豬空腸的4 倍，比較適于提取α-葡萄糖苷酶，作為α-葡萄糖苷酶抑制劑評價的材料。

2.1.3 α-葡萄糖苷酶活力抑制率的驗證

圖3 阿卡波糖對不同來源的α-葡萄糖苷酶的抑制率曲線Fig. 3 Inhibition curves of acarbose against α-glucosidase derived from yeast and porcine ileum

按照2.1.1節(jié)確定的酶促反應(yīng)體系，分析不同質(zhì)量濃度的阿卡波糖對酵母源和豬回腸源α-葡萄糖苷酶活力的抑制率。由圖3A可知，阿卡波糖質(zhì)量濃度為0.1～3.2 mg/mL時，抑制率與其質(zhì)量濃度呈對數(shù)關(guān)系，這與Sudha等[25]的報道結(jié)果相吻合，且得到非線性擬合方程y＝21.075 6 ln x+47.946 0（R2＝0.997 0），阿卡波糖對酵母源α-葡萄糖苷酶的半數(shù)有效抑制質(zhì)量濃度（median inhibition concentration，IC50）為（1.102 4±0.081 3）mg/mL。

由圖3B可見，抑制率與阿卡波糖質(zhì)量濃度（0.1～3.2 mg/mL）呈對數(shù)關(guān)系，擬合回歸方程為y＝14.228 5 ln x+70.030 4（R2＝0.994 2），阿卡波糖對豬回腸源α-葡萄糖苷酶活力抑制的IC50為（0.244 7±0.025 6）mg/mL，明顯低于對酵母源α-葡萄糖苷酶活力抑制的IC50，說明阿卡波糖對哺乳動物體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶具有更高的抑制活性，這與?nal等[26]的研究結(jié)果一致。選擇哺乳動物源α-葡萄糖苷酶進行α-葡萄糖苷酶抑制物篩選更加客觀、有效。

2.2 豬小腸不同部位黏膜提取物的DPP-4活力

2.2.1 DPP-4活力測定體系的建立

圖4 DPP-4在不同酶促條件下的酶活力Fig. 4 DPP-4 activity under different enzymatic reaction conditions

利用商業(yè)化的由Sf9細胞中重組表達的DPP-4建立DPP-4活力測定體系，獲得酶活力標準曲線，并以此為標準，確定不同部位豬小腸黏膜提取物的DPP-4活力。如圖4A所示，當DPP4濃度為15 U/L，底物Gly-Pro-pNA濃度為1.5 mmol/L時，體系吸光度與反應(yīng)時間關(guān)系呈拋物線形式。0～60 min內(nèi)DPP-4與底物反應(yīng)迅速，吸光度呈線性變化，說明DPP-4此時被充分反應(yīng)。60 min后，吸光度變化放緩，說明底物的量已無法滿足反應(yīng)，60 min后吸光度無顯著性變化（P＞0.05），因此確定60 min為最佳酶促反應(yīng)時間。

如圖4B所示，在酶濃度為15 U/L、反應(yīng)時間為60 min時，體系吸光度與底物濃度呈現(xiàn)典型的拋物線形式，隨著底物濃度的增加，吸光度增大，但增速放緩，當達到1.6 mmol/L時，反應(yīng)體系中底物濃度趨于飽和，繼續(xù)增加底物吸光度無顯著性變化（P＞0.05）。因此反應(yīng)體系確定底物Gly-Pro-pNA最適濃度為1.6 mmol/L。

如圖4C所示，在底物濃度為1.6 mmol/L，反應(yīng)60 min內(nèi)，體系吸光度與酶濃度（0～20 U/L）呈良好的線性關(guān)系（R2＝0.999 6），表明反應(yīng)時酶的量充足。

綜上，確定DPP-4活力測定最佳反應(yīng)條件為：DPP-4濃度5～15 U/L、底物Gly-Pro-pNA濃度1.6 mmol/L、37 ℃反應(yīng)時間60 min。在最佳反應(yīng)條件下，體系的吸光度約為0.1～0.4，這與先前的報道[17,27]一致，說明反應(yīng)體系可靠。

2.2.2 豬小腸不同部位的黏膜提取物的DPP-4活力分析

2.2.2.1 豬小腸不同部位的黏膜提取物的稀釋倍數(shù)

圖5 豬小腸黏膜提取物稀釋不同倍數(shù)后的DPP-4活力Fig. 5 DPP-4 activity of porcine small intestinal mucosal extracts diluted at different folds

圖5 A表示稀釋不同倍數(shù)的豬十二指腸提取物與1.6 mmol/L DPP-4底物在37 ℃下反應(yīng)60 min后，DPP-4活力的變化。體系吸光度與豬十二指腸提取物的稀釋倍數(shù)的倒數(shù)成正比（y＝4.107 9x+0.238 9，R2＝0.998 3）。根據(jù)已確定的DPP-4最佳反應(yīng)體系，具有與15 U/L DPP-4相同酶活力時的豬十二指腸黏膜提取物的稀釋倍數(shù)應(yīng)為27.7 倍。

圖5B表示稀釋不同倍數(shù)的豬空腸黏膜提取物與1.6 mmol/L底物在37 ℃下反應(yīng)60 min后的酶活力變化。體系吸光度與豬空腸提取物稀釋倍數(shù)的倒數(shù)呈線性關(guān)系（y＝13.345 5x+0.004 2，R2＝0.995 3）。根據(jù)已確定的DPP-4最佳反應(yīng)體系，具有與15 U/L DPP-4相同酶活力時的豬空腸黏膜提取物的稀釋倍數(shù)應(yīng)為35.1 倍。

圖5C表示分別稀釋不同倍數(shù)豬回腸黏膜提取物與1.6 mmol/L底物在37 ℃下反應(yīng)60 min后的酶活力變化，體系吸光度與豬回腸提取物稀釋倍數(shù)的倒數(shù)呈線性關(guān)系（y＝21.929 0x+0.145 8，R2＝0.997 8）。根據(jù)已確定的DPP-4最佳反應(yīng)體系，具有與15 U/L DPP-4相同酶活力時的豬空腸黏膜提取物的稀釋倍數(shù)應(yīng)為91.7 倍。

通過觀察，圖5A～C中所得公式的斜率是依次增大的（4.107 9＜13.345 5＜21.929 0），說明十二指腸、空腸和回腸黏膜提取物中的DPP-4活力依次增加。當把3 種豬小腸黏膜提取物稀釋到相當于標準酶15 U/L時，豬回腸黏膜提取物需要更大的稀釋倍數(shù)（91.7），印證了上述結(jié)論。

2.2.2.2 豬小腸不同部位黏膜提取物的DPP-4活力分析

表2 豬小腸不同部位黏膜提取物的DPP-4活力比較Table 2 Comparison of DPP-4 activity of porcine intestinal mucosal extracts

如表2所示，在豬小腸不同部位中，豬回腸黏膜提取物的DPP-4比活力最高，為0.053 4 U/mg，說明在豬回腸中有更高濃度的DPP-4，豬回腸黏膜提取物比較適宜提取DPP-4和作為DPP-4抑制劑評價的材料。據(jù)報道，負責(zé)分泌GLP-1的腸黏膜L細胞主要分布在豬空腸和結(jié)腸中，而GLP-1是DPP-4的主要體內(nèi)作用底物[28]，這一論點從側(cè)面印證了豬回腸中DPP-4活力更高。

2.2.3 DPP-4活力抑制率的驗證

按照2.2.1節(jié)確定的酶促反應(yīng)體系，分析不同質(zhì)量濃度的陽性對照IPI對細胞重組人源和豬回腸源DPP-4的抑制率。如圖6A所示，IPI質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)（2～200 μg/mL）對DPP-4活力的抑制率與其質(zhì)量濃度呈對數(shù)關(guān)系，這與Silveira等[29]的報道結(jié)果一致，非線性擬合得到方程y＝13.076 1 ln x+11.416 1（R2＝0.998 7），由此計算得到IPI對細胞重組人源DPP-4的IC50為19.119 7 μg/mL，與文獻報道的結(jié)論[30]一致。當IPI質(zhì)量濃度高于100 μg/mL時，抑制率大于70%。

圖6 IPI對不同來源的DPP-4的抑制率曲線Fig. 6 Inhibition curves of IPI against DPP-4 derived from humans and porcine ileum

如圖6B所示，豬回腸源DPP-4抑制率與IPI質(zhì)量濃度呈對數(shù)關(guān)系，回歸方程為y＝20.864 1 ln x-27.616 6（R2＝0.986 4）。IPI對豬回腸源DPP-4的IC50為41.268 4 μg/mL，比細胞重組人源DPP-4的IC50高，說明IPI對人源體內(nèi)的DPP-4具有更高的抑制活性，也證明了豬回腸源DPP-4體系有效。

3 結(jié) 論

本實驗對比分析了豬小腸不同部位的黏膜提取物α-葡萄糖苷酶和DPP-4的活力。在此基礎(chǔ)上建立了豬小腸黏膜提取物作為α-葡萄糖苷酶和DPP-4的酶反應(yīng)體系，最后利用這兩種酶的陽性藥（阿卡波糖和IPI）分別進行了抑制率驗證和評價。在α-葡萄糖苷酶篩選體系中，阿卡波糖對商品和豬回腸源α-葡萄糖苷酶的IC50分別是1.102 4、0.244 7 mg/mL；在DPP-4篩選體系中，IPI對商品和豬回腸源DPP-4的IC50分別為19.119 7、41.268 4 μg/mL。結(jié)果表明豬回腸黏膜提取物表現(xiàn)出更高的α-葡萄糖苷酶和DPP-4比活力，分別為0.084 1、0.053 4 U/mg。因此豬回腸黏膜提取物更適合用于α-葡萄糖苷酶和DPP-4抑制劑的篩選。