心力衰竭動物模型的研究進(jìn)展*

黃 明，熊 可，李 霄，呂 玲，李 霖，張 晗

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津 301617）

心力衰竭（HF）是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一組復(fù)雜臨床綜合征，發(fā)病率高，是各種心血管病發(fā)生發(fā)展的共同結(jié)局。其主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、乏力，以及肺瘀血和外周水腫[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，全世界心力衰竭患者的數(shù)量已達(dá)到2 250 萬或更多，并且仍在以每年200 萬的速度增長，且目前沒有特別理想的解決方案，因此心力衰竭的研究已成為心血管領(lǐng)域的焦點和熱點。動物實驗是進(jìn)入臨床階段之前的必要過程，所以建立成熟穩(wěn)定的心力衰竭動物模型來了解疾病進(jìn)展并研究新的治療方法顯得尤為重要。心衰動物模型通過多種手段模擬人類心衰的發(fā)病過程，能提供心衰的發(fā)病機(jī)制及防治的科學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。由于大型動物心衰模型對基礎(chǔ)實驗設(shè)備及操作技術(shù)要求較高，加之造模成本昂貴，故而在進(jìn)行藥效篩選及機(jī)制研究中，常選用成本低廉且操作相對簡便的小型心衰動物模型。筆者歸納了近年來文獻(xiàn)中常用的心衰模型制作方法及原理，主要包括主動脈縮窄法、肺動脈高壓法、鹽負(fù)荷法、冠狀動脈結(jié)扎法、阿霉素法、異丙腎上腺素法等，供研究者根據(jù)研究目的選擇不同的實驗動物模型，綜述如下。

1 缺血型心力衰竭模型

心肌缺血或心肌梗死是導(dǎo)致心力衰竭常見的危險因素，其機(jī)制為心臟缺血區(qū)血流灌注和供氧減少? 能量代謝異常和心肌細(xì)胞膜離子通透性變化，導(dǎo)致心肌收縮能力下降，持續(xù)性激活非缺血區(qū)代償性應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，同時缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外間質(zhì)纖維化。心肌梗死后將逐漸出現(xiàn)心肌重構(gòu)，導(dǎo)致后期左室擴(kuò)張和心功能持續(xù)性下降，最終當(dāng)心臟無法維持足夠的心排血量時，遂出現(xiàn)心力衰竭的臨床癥狀[2-3]，包括呼吸困難、體液潴留、活動耐受下降和組織灌注降低[4]。依據(jù)此原理，現(xiàn)在已有許多技術(shù)可用于復(fù)制缺血模型，常用的有冠狀動脈結(jié)扎法和冠狀動脈堵塞法。

1.1 冠狀動脈結(jié)扎法 冠狀動脈結(jié)扎法模型的復(fù)制原理是通過模擬低心輸出量來誘導(dǎo)慢性心力衰竭。具體方法是結(jié)扎動物的左冠狀動脈或左前降支和左旋支，通常模型復(fù)制時間為4～8 周。該方法顯示出的神經(jīng)內(nèi)分泌激活方式和心肌纖維化與人類的心肌纖維化過程相似[5]，但是這種造模方法對實驗者的技術(shù)有較高要求，如大鼠的心臟很小，脈搏很快，肉眼不易識別左冠狀動脈，從而導(dǎo)致實驗失敗[6]。冠狀結(jié)扎的部位是本造模方法成功的關(guān)鍵，李娟等[5]選擇結(jié)扎大鼠的左心耳下緣與肺動脈圓錐之間的冠狀動脈，術(shù)后顯示模型成功。李雪健等[7]通過比較3 種造模方法，認(rèn)為冠脈結(jié)扎法制作的HF 模型能模擬HF 在心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)等方面的臨床變化。由于冠狀動脈結(jié)扎術(shù)對實驗者熟練程度要求較高，且術(shù)后病死率居高不下，阻礙了其應(yīng)用[8]。為了解決此問題，喻斌等[9]通過改良研究認(rèn)為選250～300 g 體質(zhì)量的大鼠，10%的水合氯醛以3 mL/kg 劑量麻醉、無創(chuàng)氣管插管、充分暴露心臟、小號針縫合、以2 次/s 頻率對大鼠進(jìn)行心肺按壓，連續(xù)5～6 次，能夠減少手術(shù)后大鼠病死率。總之，冠脈結(jié)扎法制作的模型接近人類充血性心力衰竭的病理生理演變過程，但是其術(shù)后病死率較高，并且對操作者的手術(shù)水平要求頗高。

1.2 冠狀動脈堵塞法 冠狀動脈堵塞法制作心力衰竭模型的原理是通過導(dǎo)管介入技術(shù)將汞，塑料微球等栓塞物質(zhì)注入模型動物的冠狀動脈，使其心肌組織發(fā)生缺血，最終模擬人類慢性缺血性心力衰竭的整個病理過程。米亞非等[10]通過冠狀動脈微栓塞法成功建立了心力衰竭模型，模型復(fù)制時間為3～6 周。該模型被認(rèn)為反映了心力衰竭的自然病理變化和血流動力學(xué)變化，適用于心力衰竭的研究。此外，血管壁損傷也是人體內(nèi)形成血栓的重要因素之一，郝春華等[11]用光化學(xué)誘導(dǎo)法人為地破壞了大鼠冠狀動脈血管內(nèi)皮組織，引起血液動力學(xué)改變形成血栓，成功誘發(fā)心肌梗死，該模型形成的血栓接近患者的生理和病理狀況，此法對制作心肌梗死后心力衰竭模型有借鑒意義。見表1。

2 壓力負(fù)荷型心力衰竭模型

2.1 主動脈縮窄法 主動脈縮窄法制作心力衰竭模型的原理是通過手術(shù)將自制縮窄環(huán)或者不同規(guī)格的注射針頭，與升主動脈或腎動脈分支上方的腹主動脈捆綁在一起造成主動脈狹窄，最終制作成慢性心力衰竭模型。此方法造模相對周期較長，接近于臨床上動脈粥樣硬化等主動脈狹窄導(dǎo)致的慢性心力衰竭，心力衰竭的程度與動脈管的狹窄程度呈正相關(guān)。李曉梅等[12]用26～27G 針頭與KM 小鼠主動脈弓結(jié)扎，造成主動脈弓狹窄70%左右，至12 周出現(xiàn)失代償性心力衰竭。鐘明等[13]研究發(fā)現(xiàn)將實驗兔腹主動脈內(nèi)徑減少40%～50%術(shù)后第8 周，左室舒張末壓（LVEDP）明顯升高,松弛時間常數(shù)明顯延長，成功地建立了DHF 動物模型。該方法接近人類左室肥厚的生理和病理過程，改進(jìn)了升主動脈縮窄動物易發(fā)急性左心衰竭和高死亡率高的缺點。胡詠梅等[14]采用在Wistar 大鼠雙腎動脈上方0．5 cm 處將8 號針頭與腹主動脈共同結(jié)扎制作心衰模型，在4 周末和8 周末觀察大鼠的平均動脈壓（MBP）、LVSP、左室重量指數(shù)（LVMI），研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹主動脈狹窄法心衰模型和縮窄時間密切相關(guān)。伍鳳儀等[15]在制作主動脈縮窄法模型時都選用7 號針頭與腹主動脈捆扎。據(jù)文獻(xiàn)報道，結(jié)扎SD 或Wistar 大鼠的腹主動脈，9 號針頭可造成35%～50%狹窄[16]；8 號針頭可使腹主動脈腹主動脈管腔環(huán)形縮窄約50%～60%[17]；7 號注射針頭可使大鼠腹主動脈直徑減少70%～80%[18]。通過文獻(xiàn)分析，縮窄主動脈弓法導(dǎo)致的血流動力學(xué)改變對心臟的影響相對腹主動脈縮窄法較強(qiáng)[19]，但是該法類似于冠狀動脈結(jié)扎法，對操作者的技術(shù)水平要求較高，所以研究者宜根據(jù)實驗時間、技術(shù)水平等需要，選擇相應(yīng)方法。

2.2 肺動脈狹窄法 肺動脈狹窄法制作心力衰竭模型的原理是通過手術(shù)縮窄實驗動物的肺動脈，引起右心排血障礙，右心室后負(fù)荷加重，進(jìn)而右心室肥厚最終發(fā)展成右心力衰竭竭。Braun 等[20]選用雄性Wistar 大鼠制作心力衰竭大鼠模型，結(jié)扎其肺動脈3 周，結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)了心肌細(xì)胞凋亡和右心室肥大。李瑩等[21]通過研究證明縮窄實驗動物肺動脈可嚴(yán)重影響其體內(nèi)的相關(guān)血流動力學(xué)參數(shù)和血液流動狀態(tài)。但是Gomez-Arroyo 等[22]實驗結(jié)果顯示嚙齒動物術(shù)后雖然有壓力后負(fù)荷明顯升高，但其仍保留著線粒體的基因表達(dá)和代謝功能。且文獻(xiàn)報道肺動脈結(jié)扎術(shù)后的成年嚙齒動物模型中，圍手術(shù)期病死率高達(dá)40%[23]?？傊摲椒ň哂袑嶒灢僮鞒晒β矢叩膬?yōu)點，但對實驗動物有很大的損害，容易出現(xiàn)大出血，肺損傷等，導(dǎo)致病死率高。因此，通過這種方法制作右心力衰竭的模型具有一定的局限性。

表1 缺血性心力衰竭模型總結(jié)與評價

2.3 鹽負(fù)荷法 鹽負(fù)荷法制作心力衰竭模型的原理是通過給實驗動物喂食鹽水配合去氧皮質(zhì)醇（DOCA），必要時配合切除動物單側(cè)腎臟，使其出現(xiàn)水鈉潴留，加重心臟前后負(fù)荷，以模仿高血壓心臟病進(jìn)展的病理過程。李慧麗等[24]選擇雄性SD 大鼠作為實驗對象，切除其左側(cè)腎臟，并在手術(shù)后1 周肌內(nèi)注射DOCA（25mg/只，每周2 次，連續(xù)4 周），同時給大鼠喂食鹽水，持續(xù)8 周，大鼠出現(xiàn)了左心室明顯肥厚的表現(xiàn)。該方法主要用于模擬高血壓心力衰竭的研究。它具有操作簡單，價格優(yōu)惠的優(yōu)點，可以觀察慢性心力衰竭早期的病理生理變化。但是該方法的缺點在于難以控制心力衰竭的發(fā)生率并且成模時間長[25]。見表2。

3 容量負(fù)荷型心力衰竭模型

該模型的制作主要是通過人為造成動靜脈瘺，主動脈關(guān)閉不全、下腔靜脈狹窄、二尖瓣關(guān)閉不全和大量快速輸液來制作。目前動靜脈瘺法常用于實驗，通常使用腹主動脈-下腔靜脈造瘺法。制作容量負(fù)荷性動物心力衰竭模型的原理是使實驗動物動脈系統(tǒng)的血液分流到低壓的靜脈系統(tǒng)，以此增加心臟的前負(fù)荷和靜脈的回心血量，最終導(dǎo)致心力衰竭[26]。目前動靜脈瘺法常用于實驗，通常使用腹主動脈-下腔靜脈造瘺法。王學(xué)惠等[28]運用腹主動脈-下腔靜脈造瘺法制成心力衰竭模型，通過實驗研究證明給予容量超負(fù)荷心力衰竭大鼠外源性euregulin-1β 可有效減輕其心肌損傷，改善血流動力學(xué)改變，保護(hù)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，糾正大鼠的心功能。張敏莉等[29]實驗對比腹主動脈-下腔靜脈造瘺法和主動脈縮窄法大鼠模型，應(yīng)用超聲心動圖、血流動力學(xué)檢測、心臟稱量以及組織切片等多種方法評價心臟結(jié)構(gòu)和功能，認(rèn)為動靜脈瘺法手術(shù)操作相對簡單，所需的設(shè)備和儀器簡單價廉。該法適用于研究心力衰竭的代償機(jī)制和因容量超負(fù)荷導(dǎo)致的不伴有收縮功能障礙的舒張功能不全[27]。但動靜脈造瘺增加容量負(fù)荷的方法相對于主動脈縮窄法等文獻(xiàn)報道較少，應(yīng)用不廣泛。

4 藥物誘導(dǎo)型心力衰竭模型

此類模型的制作原理是將引起心肌功能異常或心臟損傷的化合物注射入動物體內(nèi)，以造成抑制心肌的收縮功能或心臟損傷，最終引起心力衰竭。目前報道多種藥物可致心力衰竭，常用的造模藥物有異丙腎上腺素（ISO）、阿霉素（ADR）。

4.1 阿霉素誘導(dǎo)法 阿霉素是一種廣譜抗腫瘤化療藥物，常用于治療白血病和淋巴瘤，其會導(dǎo)致心肌組織氧自由基的損傷和生物膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)[30]，可引起實驗動物心臟衰竭。兩心室擴(kuò)大、射血分?jǐn)?shù)下降、心室壁變薄是阿霉素導(dǎo)致的心力衰竭的主要表現(xiàn)，此模型主要適用于慢性充血性心力衰竭、心肌病的研究以及新的治療方法評估。郭長升等[31]選用SD 大鼠，采用腹腔注射2mg/mL 鹽酸阿霉素生理鹽水溶液，按照4mg/kg 體質(zhì)量（即2 mL/kg體質(zhì)量）劑量注射，每周1 次，連續(xù)6 周，累計總量24mg/kg 體質(zhì)量復(fù)制慢性心力衰竭模型。黃磊等[32-34]等選用SD 大鼠進(jìn)行靜脈或腹腔注射2～5mg/kg ADR，持續(xù)2～6 周，出現(xiàn)大鼠LVEDP、LVSP 等下降，心肌細(xì)胞肌漿凝聚，炎癥細(xì)胞出現(xiàn)浸潤和間質(zhì)水腫，由此證實心肌性心衰模型制備成功。

另外，斑馬魚這種新型模式生物也被用于制作ADR 誘導(dǎo)心臟損傷模型。徐卓然等[35]選用24 hpf 斑馬魚胚胎，將64．4 μmol/LADR 作用于他們以制造心臟毒性模型，并且進(jìn)行了機(jī)制探討。趙慧等[36]將阿霉素低、中、高濃度組（20、30、40 μg/mL）作用于36 h斑馬魚胚胎，成功建立阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心肌損傷模型。但是該模型的缺點是左心功能不全的程度是可變的，而且心律失常發(fā)病率相對較高，由此導(dǎo)致模型病死率較高[37]。

表2 壓力負(fù)荷型心力衰竭模型總結(jié)

4.2 異丙腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭模型 異丙腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭模型的制作原理是通過ISO 引起心肌細(xì)胞鈣超載，心肌興奮增強(qiáng)，心肌持續(xù)強(qiáng)烈收縮，耗氧量增大，加重心臟負(fù)荷，最終導(dǎo)致心力衰竭[38]。目前關(guān)于采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭模型的文獻(xiàn)報道較多，但是注射劑量、注射方式、持續(xù)時間有較大差異。徐清斌等[39]研究中使用5mg/kg異丙腎上腺素皮下注射大鼠，持續(xù)7 d，實驗結(jié)果顯示實驗大鼠心率、LVSP 和+LVdP/dtmax 均顯著下降（P＜0．01），-LVdP/dtmin顯著升高（P＜0．01），建立心力衰竭模型。張惠敏等[40]使用鹽酸異丙腎上腺素梯度造模法制作心力衰竭模型，羅時珂等[41]研究發(fā)現(xiàn)大鼠皮下注射2．5mg/（kg·d）ISO 制作心力衰竭模型較為適宜。該類模型雖然操作相對簡單，但是由于動物批次、藥物批號、給藥途徑的不同會影響動物模型的制備，必須進(jìn)行預(yù)試以確定最終的實驗方案。見表3。

5 遺傳型和轉(zhuǎn)基因型心力衰竭動物模型

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，很多學(xué)者通過靶向誘變/轉(zhuǎn)基因或藥理學(xué)研究與心力衰竭相關(guān)的基因表達(dá)的變化，但任何這種模擬心力衰竭的方法都可能被指責(zé)過于簡單化[42]，且對個體基因操縱的研究與疾病真實病因病理無關(guān)[43]。目前已發(fā)表了5 000 多項心臟轉(zhuǎn)基因/敲除研究，但這并不是疾病模型，只是被證明對于研究單個信號通路或研究單個基因的作用不可或缺[42]。但隨著基因技術(shù)不斷發(fā)展和改良，該模型仍將是研究心力衰竭發(fā)生機(jī)制和探索新治療靶點的有力工具。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)對轉(zhuǎn)基因制作心力衰竭模型綜述較少，現(xiàn)就已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因心力衰竭模型及探索作一簡要綜述。

5.1 遺傳型心力衰竭模型 SHHF/Mcc-/facp 大鼠是一種可復(fù)制性自發(fā)性充血性心力衰竭（CHF）的遺傳模型，且都會出現(xiàn)呼吸困難、端坐呼吸、紫紺、皮下水腫和腹水等充血性心力衰竭的典型癥狀，超聲心動圖顯示所有的心室都擴(kuò)張，心室壁增厚，2 個心室+dP/dT 降低和EDP 升高[44]。該鼠攜帶facp 肥胖基因，且其基因編碼1 個有缺陷的Leptin 受體（SHHF/Mcc-facp），從而導(dǎo)致肥胖和HF[45]。SHHF 大鼠從15 個月就出現(xiàn)心力衰竭，相較SHR 大鼠的18 個月較早，這些動物都表現(xiàn)出RAAS 和鈣代謝的改變[46]。Concei 等[47]研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)衰老傾向（SAMP8）小鼠是與衰老相關(guān)的良好心力衰竭模型，在6 個月大時，與對照組（SAMR1）相比，該動物模型顯示E/A 比，E′和E′/A′顯著降低以及EDPVR，纖維化和TGF-β表達(dá)增加。

5.2 基因敲除技術(shù) 基因敲除技術(shù)通過敲除與心力衰竭相對應(yīng)的實驗動物基因的位點誘導(dǎo)心力衰竭。配體維生素D 受體（VDR）在控制心血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，無論是全動物VDR 基因敲除（VDR-/-）還是肌細(xì)胞特異性VDR 基因缺失都會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，與心臟脂肪變性（肥胖和糖尿?。┫嚓P(guān)的臨床狀態(tài)也與低循環(huán)25OH 維生素D 水平有關(guān)。因此，Glenn DJ[48]等研究了VDR 缺陷在小鼠（VDR-/-小鼠）模型中的表達(dá)作用，它在心肌細(xì)胞中選擇性地表達(dá)參與甘油三酯合成的二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT1），最終這些小鼠表現(xiàn)出晚期心肌病和心力衰竭。此法為基因敲除制備心力衰竭模型提供了新思路。Pereira[49]等研究C57 小鼠缺乏α2A/α2C 腎上腺素能受體（α2A/α2CARKO）能增加心臟血管緊張素Ⅱ水平，并于第5 個月觀察到心室功能障礙和心力衰竭表現(xiàn)，并且與心臟膠原體積分?jǐn)?shù)增加有關(guān)。

表3 藥物誘導(dǎo)型心力衰竭模型總結(jié)

表4 遺傳型及轉(zhuǎn)基因心力衰竭模型總結(jié)

5.3 基因轉(zhuǎn)入技術(shù) 基因轉(zhuǎn)入技術(shù)通過將特殊加工的基因引入實驗動物的基因組中誘導(dǎo)心力衰竭。Mu 等[50]采用基因顯微注射技術(shù)構(gòu)建了具有心臟特異性表達(dá)的人SIRT1（SIRT1H363Y）的顯性失活形式的轉(zhuǎn)基因小鼠，其能抑制內(nèi)源性SIRT1 活性，病理學(xué)超聲心動圖都證實小鼠存在擴(kuò)張性心肌病，表現(xiàn)出明顯的心力衰竭癥狀，這些結(jié)果表明小鼠心臟中SIRT1（SIRT1H363Y）過表達(dá)的顯性失活形式導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和早發(fā)性心力衰竭，這表明SIRT1在出生后早期維持正常心臟發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

5.4 基因干擾技術(shù) 基因干擾技術(shù)誘發(fā)心力衰竭是通過將microRNA 與特定mRNA 組合以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。聶祥等[51]在用主動脈弓縮窄術(shù)制作心力衰竭模型時，同時采用重組腺相關(guān)病毒（rAAV-9）介導(dǎo)miR-665 在心臟中表達(dá)，采用超聲心動圖檢測心臟形態(tài)和功能變化以及應(yīng)用蛋白免疫印跡法等方法檢測相關(guān)分子機(jī)制變化，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-665 能夠增加心功能損傷和心肌肥厚，并且發(fā)現(xiàn)其機(jī)制是通過抑制冠狀動脈微血管的形成進(jìn)而誘發(fā)心力衰竭。

轉(zhuǎn)基因模型可用于探索與心力衰竭相關(guān)的基因，并為心力衰竭的基因治療提供理論基礎(chǔ)，但目前文獻(xiàn)報道不多，缺點是價格相對昂貴并且不能完全反映臨床患者的真實病因和病理情況。見表4。

6 總結(jié)與展望

近年來研究人員在心力衰竭模型制作中主要選用大鼠和小鼠，造模方法主要有冠狀動脈結(jié)扎法、冠脈堵塞法、主動脈縮窄法、腹主動脈縮窄法、動靜脈瘺法、藥物誘導(dǎo)法，最為常用的是腹主動脈縮窄法、冠狀動脈結(jié)扎法、異丙腎上腺素誘導(dǎo)法，這3 種方法可操作性強(qiáng)，成功率高，但是心力衰竭是一個長期的復(fù)雜的過程，沒有一種模型能完全復(fù)制疾病的自然進(jìn)程，每種造模方法都有其自身的優(yōu)勢和局限性，所以實驗者應(yīng)根據(jù)自己的研究方向和實驗需求選擇合適的心力衰竭模型。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者也在不斷地探索新的心力衰竭造模方法，運用基因敲除、基因替換、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，使心臟特異基因發(fā)生表達(dá)改變以制作心力衰竭模型。此外，斑馬魚這一模式生物具有胚胎發(fā)育快、實驗成本低、周期短，且第1 周可以不依賴血液循環(huán)等特點，目前也已經(jīng)探索建立了多種心臟損傷模型，在心力衰竭研究領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。心力衰竭的動物實驗研究在現(xiàn)有條件下，雖然已取得了較大的進(jìn)展和成果，并為臨床提供了一定的理論基礎(chǔ)。但同時也存在著很多不足之處，如動物模型與臨床上心力衰竭在發(fā)病機(jī)理還有一定的差異，中醫(yī)證型的模型研究還沒形成規(guī)范，實驗指標(biāo)尚缺乏特異性，這些也將是今后研究的重點和主要方向?？傊?，未來我們還需要進(jìn)一步探索更加具有可靠性、可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)性等特點的造模方法，為心力衰竭的研究提供更合適的動物模型，從而推動人類攻克心衰這類疾病的歷史進(jìn)程。