淋巴細(xì)胞亞群檢測及對結(jié)核病診斷和患者免疫狀況評價的價值

吳雪瓊

目前結(jié)核病(TB)依然是全球嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，是全球十大死因之一，是單一傳染病的頭號殺手。盡管研究顯示85%～90%的活動性肺結(jié)核是由潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infectioin, LTBI)者發(fā)展而來的，但在全球約1/4的結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染人口中，只有大約10%發(fā)病，90%終生不發(fā)??；而且TB具有家族聚集傾向，這些現(xiàn)象均說明人類在抗MTB感染方面存在遺傳差異。近年來，已發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)核感染和發(fā)病的易感基因，大多數(shù)與免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)，遺傳差異導(dǎo)致TB患者免疫功能異?；蛎庖呷毕荩绊憴C體抵抗MTB感染的效力。因此，目前已認(rèn)識到TB不僅是一種細(xì)菌感染性疾病，也是一種免疫性疾病，機體對MTB的免疫識別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控決定了MTB感染后疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[1-2]。

目前，可應(yīng)用于臨床TB患者免疫功能評價的方法較少，主要有以下三類：(1)淋巴細(xì)胞亞群分析：包括淋巴細(xì)胞亞群的相對計數(shù)和絕對計數(shù)；(2)體液免疫功能分析：主要檢測血液及體液中結(jié)核感染相關(guān)抗體；(3)細(xì)胞免疫功能分析：主要檢測皮膚遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、細(xì)胞因子[如γ干擾素(IFN-γ)]水平和分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)。

淋巴細(xì)胞亞群已廣泛用于其他疾病的免疫功能評價，但在TB臨床應(yīng)用不多，主要原因如下：(1)對TB患者免疫狀況在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用認(rèn)識不足，重視不夠；(2)對這些免疫指標(biāo)的臨床意義尚不十分清楚；(3)儀器、試劑價格昂貴，技術(shù)要求高，大多數(shù)實驗室條件有限，無法開展復(fù)雜的免疫檢測試驗?！吨袊腊A雜志》編委會于2019年5月23日在吉林省延吉市召開了淋巴細(xì)胞亞群檢測共識討論會，形成《結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測及臨床應(yīng)用專家共識》，以便臨床醫(yī)師正確解讀、客觀分析、科學(xué)判斷結(jié)果，從而合理制定綜合的治療方案，提高TB的診斷和治療水平。筆者以下將重點探討淋巴細(xì)胞亞群檢測的進(jìn)展、存在的問題和未來發(fā)展的前景。

淋巴細(xì)胞亞群檢測技術(shù)的主要進(jìn)展

1.檢測技術(shù)發(fā)展[3]：1973年，Steinkmp通過激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和分選，建立了流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)；同年Herzenberg與斯坦福大學(xué)合作研發(fā)出世界上第一臺商用流式細(xì)胞儀[熒光活化細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)儀]；20世紀(jì)80年代流式細(xì)胞術(shù)開始在臨床研究與應(yīng)用，淋巴細(xì)胞亞群分析相對計數(shù)法也開始用于各類臨床疾病的免疫診斷和治療監(jiān)測[4]；20世紀(jì)90年代定量流式細(xì)胞分析技術(shù)的問世，使淋巴細(xì)胞亞群分析更準(zhǔn)確，實現(xiàn)了對外周血淋巴細(xì)胞的絕對計數(shù)[5]。早期國內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群分析大多采用相對計數(shù)法，近年來部分實驗室已同時開展相對計數(shù)法和絕對計數(shù)法[6]。隨著流式細(xì)胞儀光學(xué)系統(tǒng)和試劑的進(jìn)步，儀器可配備多個激發(fā)器和檢測器，試劑出現(xiàn)更亮的新染料；多色流式細(xì)胞分析儀通過多種熒光抗體可以檢測淋巴細(xì)胞在不同生長水平及分化水平所表達(dá)的細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)抗原，在單細(xì)胞水平可測定多個參數(shù)，使得單一樣品可檢測高達(dá)14 個參數(shù)，從而可能對淋巴細(xì)胞亞群的不同特征進(jìn)行多方面的鑒定[7]。

2.檢測指標(biāo)增多：臨床上淋巴細(xì)胞亞群分析由只分析T淋巴細(xì)胞的CD3、CD4和CD8，發(fā)展到分析B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT細(xì)胞)；由只檢測相對計數(shù)到絕對計數(shù)法；其他疾病進(jìn)行相關(guān)檢測時，還對CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行精細(xì)分型，如幼稚T細(xì)胞亞群、記憶T細(xì)胞亞群、T細(xì)胞功能亞群和T細(xì)胞激活亞群等，為臨床患者提供較多的免疫評價指標(biāo)。

3. 檢測標(biāo)本擴展：淋巴細(xì)胞亞群檢測主要是檢測外周血，后來發(fā)展到可檢測胸腔積液和肺泡灌洗液[8-9]，以了解局部免疫功能。結(jié)核性胸腔積液以淋巴細(xì)胞為主，與外周血淋巴細(xì)胞結(jié)果相比，結(jié)核性胸腔積液表現(xiàn)為CD3+和CD4+T淋巴細(xì)胞亞群增多，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值增加，B淋巴細(xì)胞百分比和絕對計數(shù)均減少[8,10]；NK 細(xì)胞的占比明顯下降，其中CD56+CD16-NK 細(xì)胞亞群占比相對增加而CD56+CD16+NK 細(xì)胞亞群占比明顯減少，而且NK 細(xì)胞高表達(dá)記憶相關(guān)分子CD45RO、低表達(dá)初始相關(guān)分子CD45RA，提示結(jié)核性胸腔積液中可能存在一群記憶性NK 細(xì)胞[10]?；顒有苑谓Y(jié)核患者肺泡灌洗液及外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值均明顯低于對照組(P<0.05)，而且患側(cè)也明顯低于健側(cè)；患側(cè)肺泡灌洗液中的NK 細(xì)胞水平也明顯低于健側(cè) (P<0. 05)；肺泡灌洗液中CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比明顯高于外周血(P<0.05)，而且患側(cè)明顯高于健側(cè)(P<0. 05)；但兩側(cè)CD3+T淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0. 05)[9,11]。

淋巴細(xì)胞亞群百分比和絕對計數(shù)的關(guān)系

淋巴細(xì)胞亞群分析有兩種方法，其中相對計數(shù)法是分析各亞群細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞數(shù)的百分比，因此，結(jié)果易受各類細(xì)胞亞群變化的影響。而絕對計數(shù)法可了解各類細(xì)胞亞群的獨立變化，一種淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)的變化不會影響其他細(xì)胞亞群絕對計數(shù)的變化；但可能影響淋巴細(xì)胞亞群相對計數(shù)的變化，如：大多數(shù)TB患者表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)降低，導(dǎo)致其細(xì)胞百分比降低；CD8+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)在TB患者中也會出現(xiàn)不同程度的降低，但其降低程度低于CD4+T淋巴細(xì)胞，因而相對計數(shù)時會出現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞百分比增高，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值可能不變或者降低[12-13]。T淋巴細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中所占百分比較高(50%～84%)，因此T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)或百分比變化必然會引起NK、NKT及B淋巴細(xì)胞的百分比發(fā)生相應(yīng)改變[14]。肺結(jié)核患者CD3+CD56+CD16+/-NKT細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞亞群的百分比和絕對計數(shù)均明顯低于對照組[15]。重癥TB患者各淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)均出現(xiàn)降低，但各淋巴細(xì)胞亞群百分比可能沒有明顯變化，仍處于正常范圍[16]。因此，只分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分比不能客觀、準(zhǔn)確地反映TB患者的免疫功能狀況，建議同時檢測與分析淋巴細(xì)胞亞群的相對計數(shù)和絕對計數(shù)。

γ干擾素釋放試驗(IGRA)檢測結(jié)果與外周血淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系

IGRA的兩種成熟檢測技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)試驗與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測的敏感度均隨著外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)的降低而明顯降低， ELISPOT試驗結(jié)果相對ELISA而言較不受淋巴細(xì)胞計數(shù)的影響[17]。當(dāng)外周血淋巴細(xì)胞數(shù)低于500個/ml時， ELISPOT試驗的敏感度為81%，而ELISA的敏感度降為39%[17]。由此可見，在低淋巴細(xì)胞計數(shù)的情況下，ELISPOT試驗優(yōu)于ELISA。

CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞計數(shù)與外周血淋巴細(xì)胞數(shù)呈明顯線性相關(guān)，CD4+T細(xì)胞是產(chǎn)生IFN-γ的主要細(xì)胞類型，少量CD8+T細(xì)胞也被誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ[18]。IGRA檢測結(jié)果與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞計數(shù)密切相關(guān)，IGRA檢測陽性者的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)大多在正常范圍，也就是說CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)在正常范圍患者的IGRA陽性率明顯高于其他患者。IGRA對活動性肺結(jié)核的陽性預(yù)測值(PPV)很低[19]；IGRA最大的優(yōu)點就是陰性預(yù)測值(NPV)非常高[20]，但CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞絕對計數(shù)明顯低于正常范圍的患者易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，同時也會因為免疫低下而導(dǎo)致內(nèi)源性復(fù)燃的風(fēng)險增高[21]。因此，IGRA用于檢測高風(fēng)險人群的LTBI時，建議同時分析淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)，以避免由于IGRA假陰性造成遺漏而導(dǎo)致活動性肺結(jié)核的發(fā)展[22]。

MTB/HIV共感染與淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系

人類G蛋白偶聯(lián)因子超家族(GPCR)成員的細(xì)胞膜蛋白趨化因子CCR5是HIV-1入侵機體細(xì)胞的主要輔助受體之一。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TB相關(guān)的慢性免疫激活可使患者機體CCR5+表達(dá)增強、CCR5+CD4+T細(xì)胞頻率增高，從而導(dǎo)致HIV優(yōu)先靶向MTB 特異的記憶性CD4+T細(xì)胞，使 MTB 特異的CD4+T細(xì)胞在HIV感染早期就從外周血中消失[23-25]。MTB/HIV共感染導(dǎo)致MTB特異性T細(xì)胞功能分層喪失，首先是白細(xì)胞介素(IL)-2+CD4+T細(xì)胞反應(yīng)喪失，其次是腫瘤壞死因子(TNF)-α+CD4+T細(xì)胞喪失，IFN-γ+CD4+T細(xì)胞最后喪失，提示IL-2的分泌能力可能在TNF-α或IFN-γ之前首先喪失。HIV感染的LTBI者中MTB特異性CD4+T細(xì)胞的耗竭在IFN-γ+IL-2-TNF-α+亞群中最為明顯，MTB特異的CD4+T細(xì)胞的快速耗竭使感染HIV的LTBI者患活動性TB的風(fēng)險明顯增加[26-27]。MTB特異性IL-2+TNF+或IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)與HIV病毒載量呈負(fù)相關(guān)，MTB/HIV共感染者隨著HIV-1感染病情的進(jìn)展、免疫抑制增強會導(dǎo)致MTB特異性多功能CD4+T細(xì)胞反應(yīng)喪失。HIV感染者中抗原特異性CD8 T細(xì)胞早期表現(xiàn)為CD27+/CD28+(早期分化表型)，隨后CD28表達(dá)喪失(CD27+/CD28-，呈中間分化表型)，晚期CD27表達(dá)喪失(CD27-/CD28-，呈晚期分化表型)[28]。而MTB感染者正好相反，MTB特異性CD8 T細(xì)胞表現(xiàn)為CD28+高表達(dá)，CD27+低表達(dá)，首先是CD27表達(dá)喪失[27]。 MTB/HIV共感染會損害MTB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，不能在MTB激活下抑制其復(fù)制，導(dǎo)致疾病進(jìn)程加快，極大地增加了活動性肺結(jié)核發(fā)病的風(fēng)險。此外，CD4+T細(xì)胞對MTB呈現(xiàn)強反應(yīng)的同時可能也增強了HIV的復(fù)制[29]，因此，MTB/HIV共感染者的HIV病毒載量一般高于單獨HIV感染者，反復(fù)或持續(xù)的共感染明顯增加了HIV病毒載量，從而增加HIV傳播的風(fēng)險和艾滋病的發(fā)病率[30]。

衰老與淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系

隨著人體的衰老，發(fā)生免疫系統(tǒng)的衰退被稱為免疫衰老，導(dǎo)致細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答降低，外周血淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生一系列變化；其中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞減少，記憶性CD4+、CD8+T細(xì)胞增多，T細(xì)胞CD28表達(dá)減少對于免疫系統(tǒng)的衰老具有重要意義[31-32]。CD8+T細(xì)胞會隨著年齡的增長而下降，而且明顯早于CD4+T細(xì)胞。CD28分子是效應(yīng)CD4+和CD8+T細(xì)胞的重要共刺激標(biāo)記物，在出生時幾乎所有的T細(xì)胞都表達(dá)CD28，隨著年齡的增長胸腺退化，與其相關(guān)的幼稚CD28+T細(xì)胞輸出逐漸減少，至80歲50%～60%的CD8+T細(xì)胞失去CD28的表達(dá)，導(dǎo)致免疫表型減弱[33]。老年人CD8+CD28-T細(xì)胞的表達(dá)頻率明顯高于CD4+CD28-T細(xì)胞，CD28-T細(xì)胞雖然可增強細(xì)胞毒性和調(diào)節(jié)功能，但具有降低抗原受體多樣性、抑制抗原誘導(dǎo)的增殖、縮短復(fù)制壽命的作用，可能導(dǎo)致老年人免疫功能低下，對新病原體和疫苗的反應(yīng)受損[34]。因此，CD28-T細(xì)胞可作為老年人免疫功能不全的一個重要預(yù)測因子。相反，老年人NK細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的絕對計數(shù)和百分比可能變化不明顯，但CD56+NK細(xì)胞百分比降低、CD56-NK細(xì)胞增加[31,35]；B細(xì)胞多樣性明顯下降，由于B細(xì)胞可產(chǎn)生抗體，也是有效的抗原遞呈細(xì)胞，因此導(dǎo)致免疫力下降[36]。由此可見，對于老年TB患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，評價免疫功能，對于制定合理的綜合治療方案是非常需要的。

需建立新的基于多色流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群的方法

目前，TB臨床檢測淋巴細(xì)胞亞群的類型有限，對淋巴細(xì)胞亞群功能的評價不足，尚不能完全滿足臨床需求，需研發(fā)、開展新的針對TB患者臨床免疫學(xué)特征的淋巴細(xì)胞亞群的分析指標(biāo)和方法，以指導(dǎo)臨床診療。如通過流式細(xì)胞術(shù)將T淋巴細(xì)胞分為中心記憶T細(xì)胞(T central memory，TCM)、效應(yīng)記憶T細(xì)胞(T effector memory，TEM)、效應(yīng)T細(xì)胞(T effectorcells，TE)和幼稚T細(xì)胞(naive T cells)，通過分析TEM/TCM 的比值可作為了解MTB感染的標(biāo)志物，痊愈TB患者的TEM和TCM對早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)均有反應(yīng)，而IFN-γ陰性個體只有TCM反應(yīng)；TCM占優(yōu)勢者通常體內(nèi)無MTB增殖，而TEM占優(yōu)勢者體內(nèi)可能有MTB增殖[37]。

CD4+T細(xì)胞在TB患者抗感染免疫中發(fā)揮著重要的作用，可以作為一個相對獨立的分析指標(biāo)。CD4+T細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子和介導(dǎo)的功能不同可以進(jìn)一步分為輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)1(Th1細(xì)胞)(IFNγ+CD4+)、Th2細(xì)胞(IL-4+CD4+)、Th17細(xì)胞(IL-17+CD4+)、Th9細(xì)胞(IL-9+CD4+)、Th22細(xì)胞(IL-22+CD4+)，以及具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg，CD4+CD25+Foxp3+)等細(xì)胞亞群。IFN-γ+CD4+在與TB密切接觸者和免疫抑制劑使用者中對LTBI診斷的敏感度明顯高于IGRA和PPD皮膚試驗[38]。此外，可從細(xì)胞免疫功能方面進(jìn)一步精準(zhǔn)地評估TB患者的免疫狀態(tài)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞表面的細(xì)胞因子也可診斷MTB感染，如LTBI者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T細(xì)胞比率明顯高于活動性TB患者；活動性TB患者隨著治療好轉(zhuǎn)、MTB載量下降，分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T細(xì)胞比率也會逐步升高。應(yīng)用多色流式細(xì)胞術(shù)評價MTB特異的CD4+或CD8+T細(xì)胞免疫激活標(biāo)志物的表達(dá)，TB患者M(jìn)TB特異的CD4+IFNγ+T細(xì)胞表達(dá)免疫激活標(biāo)志物CD38、人類白細(xì)胞抗原DR等位基因(HLA-DR)和細(xì)胞內(nèi)增殖標(biāo)志物Ki-67的頻率明顯高于LTBI者[39]。最近發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物CD161+T細(xì)胞在活動性TB患者中明顯低于LTBI者和正常人[40]，這些標(biāo)志物可能能夠鑒別活動性TB和LTBI。

細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，未來隨著流式細(xì)胞術(shù)的進(jìn)步與推廣將會極大地促進(jìn)TB診治各領(lǐng)域的發(fā)展，如TB診斷試驗的建立、基礎(chǔ)免疫的了解、疫苗接種效果的評估等[41]，也許能夠解決全面評價TB患者淋巴細(xì)胞亞群表型和功能分析的難題。FACS可能成為診斷TB、判斷疾病嚴(yán)重程度和治療效果的重要手段之一。