中藥治療肺結(jié)核的用藥規(guī)律及作用機制預(yù)測

李婷婷 劉歡慶 杜巧盈

隨著醫(yī)藥技術(shù)的不斷發(fā)展進步，我國結(jié)核病發(fā)病率有所控制。目前，肺結(jié)核的治療主要以化學(xué)藥品為主，但長期應(yīng)用西藥治療會產(chǎn)生較大的藥物不良反應(yīng)，同時也容易出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。中醫(yī)藥輔助治療肺結(jié)核能明顯改善患者臨床癥狀[1-2]，提高痰菌陰轉(zhuǎn)率[3]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)過上千年的積累，已經(jīng)保留了不少治療肺結(jié)核的經(jīng)典方劑，如肺腑湯、保真湯等，李志明等[4]自擬的柴竹石膏湯治療反復(fù)發(fā)熱結(jié)核病并發(fā)其他感染患者具有較好臨床療效，可見，中藥湯劑治療結(jié)核病有著重要的作用。文本挖掘(text ming)能夠整合海量的中醫(yī)藥文獻，從文本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)并提取用戶所需的關(guān)鍵信息。在多種多樣的分析工具中，Rapidminer是最有潛力進行可伸縮大數(shù)據(jù)分析的平臺[5]。因此，筆者采用Rapidminer 分析技術(shù)對中藥治療肺結(jié)核的文獻進行分析，探索肺結(jié)核的中醫(yī)臨床用藥規(guī)律，同時通過中藥分子機制生物信息學(xué)在線分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)[6]、TTD、DisGeNET 和Genecards數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選核心中藥治療肺結(jié)核的作用靶點，并用DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行GO生物功能及KEGG通路分析。

資料和方法

1.文獻檢索：通過中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫和萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)檢索中文文獻，檢索詞為“肺結(jié)核”“中藥”；通過PubMed數(shù)據(jù)庫檢索外文文獻，檢索詞為“tuberculosis”“traditional Chinese medicine”； 檢索時間限定為1998年1月1日至2018年12月31日。共檢索到相關(guān)文獻512篇(中文文獻405篇，外文文獻107篇)，最終納入363篇(中文文獻352篇，外文文獻11篇)。

2.納入排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：中藥復(fù)方治療肺結(jié)核的臨床研究文獻。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①僅以摘要形式發(fā)表的文獻；②綜述性文獻；③只有診斷或鑒別診斷的文獻；④動物實驗研究文獻。

3.中藥名詞術(shù)語：參照《中藥學(xué)》[7]，中藥根據(jù)功效分為解表藥、清熱藥、瀉下藥、祛風(fēng)濕藥、化濕藥、利水滲濕藥、溫里藥、理氣藥、消食藥、驅(qū)蟲藥、止血藥、活血化瘀藥、化痰止咳平喘藥、安神藥、平肝息風(fēng)藥、開竅藥、補虛藥、收澀藥、涌吐藥、攻毒殺蟲止癢藥、拔毒化腐生肌藥等共21類。同時，根據(jù)《中藥學(xué)》規(guī)范文獻中藥物名稱，如元胡、玄胡歸為延胡索。

4.文本挖掘分析：將下載的文獻轉(zhuǎn)化為“.txt格式”并以ANSI格式保存。應(yīng)用Rapidminer軟件對下載的文獻對照關(guān)鍵詞庫進行信息提取，并按統(tǒng)一格式保存為便于Access數(shù)據(jù)庫和SQL大型數(shù)據(jù)庫處理的格式，基于頻繁模式樹(FP-growth)算法，對治療肺結(jié)核的中藥進行一維頻次的分析和二維關(guān)系分析。利用Cytoscape 3.7軟件對采集的數(shù)據(jù)進行可視化處理，形成二維關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。 應(yīng)用BATMAN-TCM對高頻中藥進行生物信息學(xué)分析。運用治療靶點數(shù)據(jù)庫[TTD數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、 GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)]搜索獲得結(jié)核相關(guān)靶點。將核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中(https://david. ncifcrf.gov/，Version 6.8)進行GO(gene ontology)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。

結(jié) 果

1.各類中藥使用情況：對363篇文獻中所涉及到的出現(xiàn)頻次≥10的中藥進行分類統(tǒng)計，治療肺結(jié)核使用頻次最高的是補虛藥(663次)，其次為活血化瘀藥(403次)、清熱藥(325次)及化痰止咳平喘藥(282次)。

2.藥物使用情況： 363篇文獻中包含122味中藥，使用總頻次為2470次；使用頻次≥10的中藥共72味，使用頻次排名前5位的中藥為甘草(122次)、當(dāng)歸(102次)、生地(99次)、白芍(74次)、百部(72次)。

3.藥對使用情況：將363篇文獻進行藥物兩兩聯(lián)用組合的分析，將最小支持度設(shè)置為0.028，即A藥與B藥在分析文獻中同時出現(xiàn)的概率≥2.8%。結(jié)果顯示，兩兩藥對出現(xiàn)頻次最高的是甘草-當(dāng)歸(70次)，其次為甘草-生地(52次)，當(dāng)歸-生地(49次)，當(dāng)歸-白芍(49次)。

進一步分析中藥聯(lián)用情況，3味藥組合出現(xiàn)頻次較高的有甘草-當(dāng)歸-生地(37次)、甘草-當(dāng)歸-柴胡(31次)及甘草-當(dāng)歸-黨參(31次)，4味藥組合出現(xiàn)頻次最高的是甘草-當(dāng)歸-生地-白芍(24次)。

4.用藥規(guī)律：將最小置信度設(shè)置為0.6，即A藥出現(xiàn)后B藥出現(xiàn)的概率≥60%。生地、白芍配伍時當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為95.0%；黨參、白芍配伍時當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為94.7%，丹參、白芍配伍時當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為94.7%(表1)。

表1 中藥治療肺結(jié)核的用藥規(guī)律文本分析結(jié)果

5.藥物聯(lián)用情況：選取支持度≥0.028的藥物聯(lián)用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7可視化軟件，顯示治療肺結(jié)核的藥物聯(lián)用情況如圖1所示。圖中節(jié)點代表中藥，節(jié)點的大小代表該藥物與其他藥物聯(lián)用得出的藥物權(quán)重，權(quán)重越大節(jié)點越大；兩個節(jié)點之間的連線代表中藥之間的聯(lián)用情況。由圖1可見，與其他藥物聯(lián)用時甘草的用藥權(quán)重最高(3.32%)，其次為當(dāng)歸(3.25%)、生地(1.94%)、白芍(1.88%)，可作為中醫(yī)治療肺結(jié)核的核心藥物，與其他多種藥物具有廣泛的聯(lián)用關(guān)系。

6.核心治療中藥分子靶點預(yù)測：選取核心藥物甘草、當(dāng)歸、生地和白芍，應(yīng)用BATMAM-TCM在線分析工具，將“cut-off”值設(shè)為80，“AdjustPvalue(校正P值)”設(shè)為0.05。結(jié)果顯示，4味藥物共包括385種已知化合物，將277種結(jié)構(gòu)明確、靶點已知的化合物納入分析，剔除各化合物重復(fù)靶點后獲得作用靶點共430個。通過TTD、DisGeNET、GeneCards 數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞檢索，共收集到2482個結(jié)核相關(guān)靶點，然后將整理的結(jié)核疾病靶標(biāo)與核心藥物有效成分靶點映射篩選出共同靶點92個，見表2。對共同靶點基因進行GO富集分析(圖2)，結(jié)果顯示核心中藥治療肺結(jié)核的關(guān)鍵靶點主要富集的生物學(xué)過程為：氧化還原(21個基因)、細(xì)胞死亡(20個基因)、細(xì)胞程序性死亡(20個基因)、細(xì)胞凋亡(20個基因)。KEGG通路富集分析見圖3，結(jié)果顯示4味核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點主要富集的通路為：癌癥通路(14個基因)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(13個基因)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(10個基因)、ErbB信號通路(10個基因)等。表明4味核心中藥活性成分的關(guān)鍵靶點分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗結(jié)核作用。這些通路可作為未來研究核心中藥抗結(jié)核機制的重要方向。

討 論

文本挖掘已經(jīng)在多個行業(yè)領(lǐng)域如教育、商業(yè)、生物技術(shù)等中發(fā)揮重要的作用[8]。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的文章數(shù)量呈現(xiàn)指數(shù)級的增長，但是人們對信息的處理及分析遠(yuǎn)滯后于醫(yī)學(xué)信息的增長，因此，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域文本挖掘的開展刻不容緩。中醫(yī)藥有著幾千年的實踐經(jīng)驗，已經(jīng)積累了大量的信息數(shù)據(jù)。近幾年，文本挖掘技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是中醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，為分析中醫(yī)證候、配伍規(guī)律提供了有力的信息技術(shù)支撐[9-10]。筆者利用Rapidminer分析軟件對大量的關(guān)于中醫(yī)藥治療肺結(jié)核文獻數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)治療肺結(jié)核的藥物主要為補虛藥、活血化瘀藥和清熱藥。王勝圣等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核的癥候主要為肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛，因此，用清熱藥除蒸，用補虛藥補氣治本，而使用化痰止咳平喘藥屬對癥治療，與本文的分析結(jié)果一致。補虛藥又分為補氣藥、補血藥、補陰藥和補陽藥。補氣藥可補脾益氣，補陰藥可補充因長期消耗和虛熱減為匱乏的陰液，而補血藥則可填補精血，補益肺腎。而肺結(jié)核發(fā)病部位在肺部，且為慢性疾病，患者多為腎陰不足，精血不充，因此，需以補虛藥治療肺結(jié)核的陰血虧虛。有學(xué)者認(rèn)為肺結(jié)核兼有血瘀的癥狀，通過滋陰殺蟲，活血化瘀治療肺結(jié)核血瘀陰虛型患者取得了較好的療效[12]。伍明俊[13]應(yīng)用人參、黃芪、麥冬、丹參、川芎等配伍的扶正湯對肺結(jié)核患者肝功能異常、末梢神經(jīng)炎有較好的療效。筆者通過文本挖掘分析發(fā)現(xiàn)，丹參為治療肺結(jié)核常用的活血化瘀藥，也證實了活血化瘀藥在治療肺結(jié)核中的作用。使用頻次居第三者為清熱藥，肺結(jié)核的主要癥狀之一的骨蒸潮熱便是由肺腎陰虛引起，陰虛則陽偏亢。明代龔居中編著的《紅爐點雪》[14]中有云：夫癆者勞也，以勞傷精氣血液，遂致陽盛陰虧，火炎痰聚。因此配伍清熱藥瀉火退潮熱，以治療肺結(jié)核的骨蒸潮熱。結(jié)核病患者脾肺氣虛，津液運化不利，易生痰濕，犯于肺則咳嗽咳痰；因此，治療肺結(jié)核時也常配伍止咳化痰藥。

圖中節(jié)點代表中藥，節(jié)點的大小代表該藥物與其他藥物聯(lián)用得出的藥物權(quán)重，權(quán)重越大節(jié)點越大；兩個節(jié)點之間的連線代表中藥之間的聯(lián)用情況圖1 中藥治療肺結(jié)核的藥物二維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 核心中藥治療肺結(jié)核的部分分子靶點信息

圖2 甘草、當(dāng)歸、生地、白芍等核心中藥治療肺結(jié)核關(guān)鍵靶點的GO富集分析

圖3 甘草、當(dāng)歸、生地、白芍等核心中藥治療肺結(jié)核關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

通過文本挖掘發(fā)現(xiàn)，甘草使用頻次最高，其次為當(dāng)歸、生地。黃潔和周建英[15]使用生甘草聯(lián)合西醫(yī)抗結(jié)核藥品治療繼發(fā)性肺結(jié)核痰菌陽性患者發(fā)現(xiàn)，相較于僅用抗結(jié)核西藥治療的患者能明顯改善患者的體質(zhì)量指數(shù)和肺部病變吸收情況。綜合分析，甘草之所以是最高頻次使用藥物，主要原因有三，一是甘草素有“國老”之稱，能夠緩和峻烈藥物的毒性，二是入心肺脾經(jīng)補心脾氣，三是具有祛痰止咳的功效。當(dāng)歸性甘溫，歸肝心脾經(jīng)，可補血亦可活血，在補血養(yǎng)陰的基礎(chǔ)上行活血祛瘀之功。一般肺結(jié)核會伴有咯血的癥狀，使用當(dāng)歸補血的特性改善咯血的癥狀；對于血瘀陰虛行患者配伍當(dāng)歸則可使血瘀去，新血生。當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸多糖和阿魏酸是補血的主要有效成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸多糖和阿魏酸可增加血虛動物骨髓造血細(xì)胞的總量[16]。同時，也有研究顯示當(dāng)歸可明顯改善血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能異常[17]。生地歸心、肝、腎經(jīng)，有清熱涼血、養(yǎng)陰之功?！侗静菝劁洝穂18]中提到生地可涼血補血，涼中有補，遏制血的上炎之勢。肺結(jié)核的主要癥狀之一就是反復(fù)潮熱，因此，使用生地可清熱涼血，去除陰虛骨蒸之熱。

通過對治療肺結(jié)核藥對使用情況的分析發(fā)現(xiàn)，甘草-當(dāng)歸是最高頻次的使用藥對，二藥同屬補虛藥，說明補虛培元，增強正氣是治療肺結(jié)核中最重要的治法。當(dāng)歸屬補虛藥中的補血藥同時有活血的功效，肺結(jié)核的基本病機是元氣虧虛、肝腎不足、精血虧耗，使用補虛藥可益氣生津、化陰生血，行氣逐瘀、行津祛痰[19]。甘草-當(dāng)歸-生地3味藥的高頻次配伍模式及甘草-當(dāng)歸-生地-白芍4味藥高頻次配伍模式，體現(xiàn)了補虛藥與清熱藥配伍治療肺結(jié)核的配伍思路，可益氣養(yǎng)陰、清熱除蒸。分析治療肺結(jié)核的用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)若使用生地和白芍時，配伍當(dāng)歸的概率為95%，基本可認(rèn)為甘草-當(dāng)歸-生地-白芍為治療肺結(jié)核的核心中藥，同時也可根據(jù)病情適當(dāng)配伍其他種類中藥，如配伍清熱涼血、止咳平喘、收斂止血及健脾利濕之品可肅清肺中痰瘀，防止肺氣損耗；輔以解表藥如柴胡、桂枝可加強宣肺止咳之效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科。中藥復(fù)方制劑成分比較復(fù)雜，作用機制尚不明確，影響了中藥復(fù)方制劑的臨床推廣和研發(fā)。凌彥博等[20]運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥復(fù)方牛貝消核提取物可通過下調(diào)c-JUN末端激酶(JNK)信號通路發(fā)揮抗結(jié)核作用。筆者利用在線分析工具BATMAN-TCM獲取了治療肺結(jié)核的4味核心中藥組合(甘草-當(dāng)歸-生地-白芍)的277種結(jié)構(gòu)明確化合物的430個作用靶點，同時通過數(shù)據(jù)庫收集到2482個結(jié)核相關(guān)靶點，然后將整理的結(jié)核疾病靶標(biāo)與核心中藥有效成分靶點映射篩選出共同靶點92個，該92個共同靶點認(rèn)為是治療結(jié)核病的4味核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點。通過對這92個關(guān)鍵靶點進行GO富集分析，核心中藥治療結(jié)核病的關(guān)鍵靶點主要富集的生物學(xué)過程為：氧化還原、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞程序性死亡和凋亡，這些生物學(xué)過程在核心中藥活性成分抗結(jié)核機制及靶點所涉及的通路都有所體現(xiàn)。KEGG通路富集表明，4味核心中藥抗結(jié)核所涉及的通路主要包括癌癥通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ErbB信號通路等，其中已有自然殺傷細(xì)胞抵抗結(jié)核分枝桿菌的報道，自然殺傷細(xì)胞具有殺滅感染細(xì)胞和清除細(xì)胞內(nèi)病原體宿主的能力，在病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的免疫應(yīng)答中起著重要的作用[21]。γ干擾素(IFN-γ)能夠通過激活巨噬細(xì)胞及增強殺菌活性從而抵抗結(jié)核分枝桿菌，而自然殺傷細(xì)胞是IFN-γ的重要來源[22]。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)，在感染結(jié)核分枝桿菌的Rag敲除小鼠的自然殺傷細(xì)胞可通過分泌IFN-γ抵抗肺結(jié)核。對于ErbB信號通路與結(jié)核病的關(guān)系也有研究，ErbB屬于EGFR家族成員，Sogi等[24]研究發(fā)現(xiàn)EGFR和ErbB2的小分子抑制劑吉非替尼可抑制巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的生長。

綜上所述，本研究中筆者使用Rapidminer技術(shù)分析得出中藥治療肺結(jié)核多以補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥為主，且甘草、當(dāng)歸、生地、白芍這4味藥最常配伍使用；同時運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測高頻次藥物甘草、當(dāng)歸、生地、白芍治療肺結(jié)核的作用機制可能是通過癌癥通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ErbB信號通路來實現(xiàn)。可見，基于文本挖掘技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選統(tǒng)計及預(yù)測的結(jié)果與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究相符。因此，我們可以嘗試從此兩種角度研究中藥治療疾病的用藥規(guī)律和預(yù)測作用機制，為更深層次探索中藥研究提供參考。