單倍體胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景

徐希橋，徐家偉，王海松，孫瑩璞*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450000；2.河南省生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000；3.河南省婦產(chǎn)疾病(生殖醫(yī)學(xué))臨床醫(yī)學(xué)研究中心，鄭州 450000；4.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷與篩查河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000)

正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)只有減數(shù)分裂后的配子是單倍體，其他細(xì)胞均為二倍體，即一套染色體來(lái)自于母親，一套染色體來(lái)自于父親。一方面，從進(jìn)化角度和生物多樣性角度看，單倍體精子與卵細(xì)胞融合產(chǎn)生的二倍體哺乳動(dòng)物具有諸多優(yōu)勢(shì)，既能有效防止隱性的有害突變導(dǎo)致生物體的淘汰[1]，維持種群數(shù)量的穩(wěn)定，也能通過種間雜交增加遺傳多樣性，促進(jìn)新物種的產(chǎn)生。但是另一方面，二倍體細(xì)胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)阻礙了人們?cè)诙扼w細(xì)胞基因功能研究、印記基因調(diào)控和基因篩選方面的應(yīng)用。而單倍體細(xì)胞既有單倍性，也有類似于二倍體的多能性和強(qiáng)大的分化潛能，能在體外實(shí)現(xiàn)自我更新。因此，單倍體細(xì)胞在探究基因功能、表觀遺傳修飾、研究配子發(fā)育過程、生成多基因修飾動(dòng)物模型等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2]。本文就單倍體胚胎干細(xì)胞(haESCs)的特性、獲取及其發(fā)展過程中遇到的問題進(jìn)行思考并對(duì)其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

一、haESCs的獲取及特性

1.體外誘導(dǎo)獲取haESCs：?jiǎn)伪扼w細(xì)胞只含有一套染色體組，不含等位基因，因此在研究生物表型與基因關(guān)系以及基因篩選方面具有較高價(jià)值。但是由于單倍體細(xì)胞有存活能力弱、自發(fā)二倍化等特性，其穩(wěn)定細(xì)胞系的建立經(jīng)歷了一個(gè)曲折的過程。早期探索過程中，單倍體細(xì)胞的自發(fā)二倍化特性使研究者難以獲得穩(wěn)定的單倍體胚胎干細(xì)胞系，這也成了發(fā)展過程中困擾人們的最大問題。曾有研究者利用從慢粒細(xì)胞白血病患者骨髓中獲取的名為KBE-7的細(xì)胞株，通過連續(xù)亞克隆的方式分離出了“近單倍體”的細(xì)胞系，其染色體中除了8號(hào)染色體為兩條，其余皆為一條[3]。然而由于該細(xì)胞系來(lái)源于癌細(xì)胞且基因組不穩(wěn)定，限制了其在功能研究中的應(yīng)用。

直到2009年，haESCs研究取得了重大進(jìn)展，較為穩(wěn)定的脊椎動(dòng)物單倍體胚胎干細(xì)胞系成功建立，該細(xì)胞系來(lái)源于青鳉魚胚胎[4]，為單倍體研究打開了一扇全新的大門。2011年，Elling等[5]和Leeb等[6]兩個(gè)研究小組用不同的方法建立了小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)了體外建立高等哺乳動(dòng)物單倍體細(xì)胞系“零”的突破。其相同點(diǎn)在于均使用化學(xué)手段處理未受精的卵母細(xì)胞，模擬精子進(jìn)入卵母細(xì)胞過程中引發(fā)的鈣振蕩，使卵母細(xì)胞孤雌激活，然后收集囊胚期胚胎。之后使用流式細(xì)胞熒光分選術(shù)(FACS)分選并富集haESCs，不同點(diǎn)在于Elling等[5]采用體內(nèi)途徑獲取囊胚，即將卵母細(xì)胞激活后移植到假孕母鼠體內(nèi)，再富集囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞擴(kuò)增并進(jìn)一步分選，而Leeb等[6]采取體外途徑獲取囊胚，即在體外使用2i培養(yǎng)基(含有與凋亡相關(guān)的兩條通路——激酶Mek通路和激酶GSK3通路的抑制因子)將胚胎培養(yǎng)至囊胚期并進(jìn)行同樣的分選流程。通過這兩種方式獲取的haESCs可以穩(wěn)定保持單倍體性，其形態(tài)與正常二倍體胚胎干細(xì)胞相似，可表達(dá)經(jīng)典的胚胎多能性標(biāo)記基因并且具有分化為三胚層及完整組織的潛力。盡管實(shí)驗(yàn)存在局限性，但是穩(wěn)定的小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。2012年，小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞相繼在中國(guó)的兩個(gè)課題組建系成功[7-8]，并且其替代精子產(chǎn)生成子代的能力得到了證實(shí)。在此之后，獼猴和大鼠的haESCs也建立起來(lái)，增加了將其他種類哺乳動(dòng)物單倍體細(xì)胞用于基因研究的可行性[9-10]。2016年，Sagi等[11]和Zhong等[12]的研究組分別用MⅡ期卵母細(xì)胞化學(xué)激活法和顯微外科手術(shù)法首次建立了人類孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系，并且驗(yàn)證了其基因組的完整性和分化潛能。4年后，獲取難度相對(duì)更高的人孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系由中國(guó)學(xué)者建系成功，Zhang等[13]利用改良的顯微操作技術(shù)成功建立了人孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系，并證明其具有使卵母細(xì)胞受精并發(fā)育至囊胚的能力，填補(bǔ)了haESCs的最后一塊空白。除了具備分化潛能外，該細(xì)胞還具有與配子相似的生殖功能，可通過胞漿內(nèi)孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞注射技術(shù)(ICAHCI)將遺傳修飾從細(xì)胞水平傳遞到個(gè)體水平，單倍體細(xì)胞系的建立為人類遺傳學(xué)的發(fā)展提供了一種全新的工具。此外，haESCs具有強(qiáng)大的自我更新能力，能夠兼容先進(jìn)的基因編輯方法，可用于生成含純合等位基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而使人們能夠全面地研究隱性基因功能。

2. 穩(wěn)定單倍體胚胎干細(xì)胞系的分選方法：迄今為止，由于存在自發(fā)的二倍化，單倍體的長(zhǎng)期維持仍需通過FACS來(lái)富集單倍體細(xì)胞，這是一個(gè)復(fù)雜的過程。首先用Hoechst 33342對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行染色[14]，在波長(zhǎng)355 nm的激光照射下，細(xì)胞核放射出波長(zhǎng)為461 nm的熒光，然后使用流式細(xì)胞儀根據(jù)核酸含量進(jìn)行單倍體細(xì)胞富集。其原理是當(dāng)染色后的胚胎干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀時(shí)，其散發(fā)的熒光會(huì)被捕捉到，之后流式細(xì)胞儀捕捉光信號(hào)并進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，單倍體的DNA含量只有二倍體的一半，因此熒光信號(hào)也明顯弱于二倍體細(xì)胞。根據(jù)這一特點(diǎn)，在流式細(xì)胞儀中可將細(xì)胞分為3個(gè)峰，分別為1C(G0/G1期單倍體細(xì)胞)、2C(G2/M期單倍體細(xì)胞和G0/G1期二倍體細(xì)胞)和4C(G2/M期二倍體細(xì)胞)，1C峰便是我們所需的單倍體細(xì)胞，通過這種方法可以較為精準(zhǔn)地將單倍體細(xì)胞分離出來(lái)[15]。但流式細(xì)胞術(shù)是一種依賴于大型設(shè)備、高成本且復(fù)雜的技術(shù)，并且Hoechst 33342染料與紫外照射存在的細(xì)胞毒性會(huì)降低存活率，影響獲取效率[16]，這些局限性限制了FACS的廣泛應(yīng)用。近期，有研究者利用不同脫氧核糖核酸含量的細(xì)胞之間存在明顯的大小差異這一原理開發(fā)了簡(jiǎn)化的過濾方法來(lái)富集單倍體細(xì)胞，即通過定期過濾將直徑較小的單倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞分離，操作方法相對(duì)簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷小，經(jīng)濟(jì)適用，為獲取穩(wěn)定的單倍體胚胎干細(xì)胞系提供了全新的選擇[17-18]。

3. haESCs的特性：haESCs與傳統(tǒng)的二倍體胚胎干細(xì)胞具有一些共同的特征，如無(wú)限的自我更新能力和多能性。除此以外，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞還擁有與精子類似的功能，可以使卵母細(xì)胞“受精”，已經(jīng)證明往卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞可支持小鼠和大鼠胚胎的足月發(fā)育。同時(shí)，在孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞中模擬精子的印記狀態(tài)，并通過注射到卵母細(xì)胞后可有效地產(chǎn)生具有預(yù)期遺傳特性的小鼠模型[8，10，19]，因?yàn)橥ㄟ^這種方式獲取的小鼠只含有一半的父源遺傳物質(zhì)，所以這種小鼠又稱為半克隆小鼠。雖然成功獲取了可用于基因篩選的半克隆小鼠，但由于其存活率低而極大地阻礙了haESCs在動(dòng)物工程中的廣泛應(yīng)用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，印記基因可能是阻礙半克隆小鼠存活的“元兇”，在雄性印記中，H19-甲基化差異區(qū)域(DMR)和IG-DMR是兩個(gè)特殊且重要的區(qū)域，兩者父源等位基因處于甲基化狀態(tài)，母源等位基因則相反，因此這兩個(gè)區(qū)域稱為DMR，其異常甲基化會(huì)影響小鼠胚胎的正常發(fā)育[21]。早期有學(xué)者證實(shí)了H19-DMR和IG-DMR的敲除可使孤雌小鼠出生率得到有效升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在異常的半克隆小鼠中出現(xiàn)H19-DMR區(qū)域的甲基化異常擦除，極有可能是獲得半克隆小鼠較為困難的關(guān)鍵因素之一[7，22-24]。

HaESCs的另一重要特征就是自發(fā)二倍化。在體外培養(yǎng)的過程中，一部分單倍體細(xì)胞會(huì)成為二倍體細(xì)胞，這對(duì)于該細(xì)胞系的維持極為不利，該問題是應(yīng)用haESCs過程中亟待解決的一大難點(diǎn)。防止二倍化的關(guān)鍵在于了解其機(jī)制，目前的研究結(jié)果表明，細(xì)胞周期異常，而非單倍體細(xì)胞之間的融合是自發(fā)二倍化的“罪魁禍?zhǔn)住?。正常二倍體細(xì)胞的有絲分裂過程可分為間期和分裂期(M期)，間期又分為G1期(合成RNA與蛋白質(zhì))、S期(核內(nèi)DNA合成使DNA加倍)和G2期(細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)并合成蛋白)。然而，一些單倍體細(xì)胞在分裂期時(shí)出現(xiàn)異常，跳過了M期并再次進(jìn)入G1/S期，因此細(xì)胞中DNA含量變?yōu)樵瓉?lái)的兩倍[25]。Takahashi等[26]課題組發(fā)現(xiàn)：在培養(yǎng)基中加入Wee1激酶抑制劑，可加快haESCs由G2期向M期的轉(zhuǎn)變并防止其進(jìn)入額外的G1/S期，該方法可有效增加haESCs的體外維持時(shí)長(zhǎng)。還有研究者發(fā)現(xiàn)，在2i培養(yǎng)基中聯(lián)合添加PD 166285(Wee1激酶抑制劑)和RDF(R：Repsox，TGF-β途徑抑制劑；D：DMH1，BMP4途徑抑制劑；F：Forskolin，腺苷酸環(huán)化酶激活劑)，可加速haESCs由S/G2期向M期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而將它的單倍體性維持時(shí)間增加至5周以上[27]。這些發(fā)現(xiàn)均證實(shí)單倍體細(xì)胞的異常有絲分裂機(jī)制會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性二倍體化。目前，為了獲得更加穩(wěn)定的單倍體細(xì)胞系，單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞之間有絲分裂的詳細(xì)差異以及二倍體化的分子機(jī)制仍有待揭示。

二、haESCs在基因功能研究中的應(yīng)用

1. haESCs與基因篩選：通常情況下，在二倍體胚胎干細(xì)胞中很難獲得純合突變，雜合基因型對(duì)同源等位基因的表型可能沒有影響，因此哺乳動(dòng)物的二倍體基因組阻礙了對(duì)隱性基因功能的探究。目前，通過基因編輯技術(shù)獲得等位基因純合突變難度較大，這也阻礙了純合基因敲除文庫(kù)的產(chǎn)生。使用haESCs可以克服這個(gè)障礙，由于單倍體細(xì)胞只攜帶一套染色體，它們?cè)谕蛔儠r(shí)可表現(xiàn)出相應(yīng)的表型，使得haESCs在功能基因組學(xué)研究以及遺傳篩選方面存在廣泛的應(yīng)用。利用haESCs可在體外無(wú)限增殖的特性，通過基因誘捕建立全基因組的突變庫(kù)，這一發(fā)展為基因研究提供了一種快速而簡(jiǎn)單的方法。通常，研究人員利用酵母自然狀態(tài)下為單倍體的特性，來(lái)進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的突變篩選[1]，但由于種屬特異性，這種方法無(wú)法應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。目前，隨著獲取haESCs難度的大幅降低，全基因組篩選已廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，以闡明不同生物學(xué)過程中各種基因的功能，極大地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)展。

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)篩選有“正向遺傳學(xué)”(forward genetics)和“反向遺傳學(xué)”(reverse genetics)兩種方式。一般來(lái)說(shuō)，正向遺傳篩選是通過等位基因突變獲得功能喪失的表型，進(jìn)而研究等位基因的功能，即從表型到基因。反向遺傳篩選則是通過某個(gè)特定的基因或蛋白質(zhì)的改變追蹤表型的變化，是從基因到表型。haESCs可通過基因工程廣泛應(yīng)用于正向遺傳篩選，基因組工程可通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入或核酸介導(dǎo)的靶向修飾技術(shù)產(chǎn)生突變文庫(kù)，這些技術(shù)包括piggyBac轉(zhuǎn)座子、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和TALENS等，進(jìn)行基因編輯后的haESCs通過篩選和驗(yàn)證，可獲得特定的突變細(xì)胞。迄今為止，通過對(duì)單倍體細(xì)胞系的基因篩選，研究者們?cè)诨蚬δ芎团R床疾病研究方面取得了一定進(jìn)展，例如：2019年，Bai等[28]建立了一種體內(nèi)遺傳篩選策略，將ICAHCI和CRISPR/Cas9文庫(kù)結(jié)合用于鑒定參與骨發(fā)育的基因。該課題組使用攜帶組成型表達(dá)的Cas9和小向?qū)NA(sgRNA)文庫(kù)的DKO-AG-haESCs(H19-DMR和IG-DMRs雙敲孤雄單倍體)生成突變小鼠，獲得攜帶了69個(gè)候選基因的半克隆小鼠幼崽，并驗(yàn)證了ICAHCI技術(shù)和CRISPR/Cas9文庫(kù)結(jié)合可有效獲取突變半克隆小鼠。該研究通過篩選骨骼發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)骨發(fā)育相關(guān)基因：Zic1、Clec11a、Rln1和Irx5，為haESCs應(yīng)用于功能性遺傳篩選開辟了新的渠道。同年，該課題組通過向卵母細(xì)胞注射含有強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良征I型相關(guān)突變基因的haESCs生成雜合小鼠，并成功模擬了強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良征I型的相關(guān)癥狀，這一發(fā)現(xiàn)不僅有利于闡明疾病發(fā)病機(jī)制，更證實(shí)了haESCs可用于建立疾病相關(guān)動(dòng)物模型，拓展了其應(yīng)用前景[29]。

綜上所述，利用haESCs進(jìn)行遺傳篩選，將促進(jìn)發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)在基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)物種進(jìn)化、譜系分化、信號(hào)通路、生物分子的相互作用和癌癥領(lǐng)域的研究有重要的價(jià)值。

2. haESCs與X染色體失活：haESCs的另一潛在應(yīng)用是研究X染色體失活(XCI)的相關(guān)機(jī)制在哺乳動(dòng)物的XY性別決定機(jī)制中存在的基因劑量補(bǔ)償效應(yīng)，該效應(yīng)使得性連鎖基因在兩種性別中有相等或近乎相等的有效劑量，而XCI則是與該效應(yīng)密切相關(guān)的一個(gè)表觀遺傳修飾和發(fā)育過程。在XCI機(jī)制作用下，二倍體雌性體細(xì)胞中的一條X染色體處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)(Xa)，另一條通過表觀遺傳機(jī)制處于沉默狀態(tài)(Xi)，而二倍體雌性胚胎干細(xì)胞可表現(xiàn)出不同的XCI狀態(tài)，如XaXa或是更為常見的XaXi[30]。XCI與長(zhǎng)鏈非編碼RNA Xist表達(dá)密切相關(guān)[31]，Xist可使一條X染色體隨機(jī)失活。Monfort等[32]使用誘導(dǎo)Xist過表達(dá)系統(tǒng)成功篩選出XCI過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子——RNA結(jié)合蛋白SPEN，證實(shí)了SPEN是Xist發(fā)揮基因抑制作用所必需的。SPEN的鑒定為進(jìn)一步研究Xist的基因沉默途徑開辟了道路，顯示了haESCs在研究表觀遺傳途徑的遺傳篩選中的作用。Li等[33]課題組利用小鼠和大鼠的haESCs成功構(gòu)建出了小鼠-大鼠雜交異源二倍體胚胎干細(xì)胞(AdESCs)，這些AdESCs的異源二倍體基因組相對(duì)穩(wěn)定，具有二倍體細(xì)胞的普遍特性。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：幾乎所有被測(cè)序的X連鎖基因轉(zhuǎn)錄本都映射到了大鼠的X染色體上，然而介導(dǎo)沉默的Xist基因的轉(zhuǎn)錄本，被單獨(dú)定位到小鼠X染色體上，這些結(jié)果表明，小鼠X染色體在異源二倍體細(xì)胞中處于失活狀態(tài)。他們還系統(tǒng)地分析了大量RNA-seq數(shù)據(jù)，在異源二倍體體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了146個(gè)未知的小鼠基因，這些基因可能與X染色體失活逃逸有關(guān)。以上研究成果證實(shí)了單倍體的衍生物AdESCs是研究X染色體失活相關(guān)機(jī)制并篩選XCI失活逃逸基因的強(qiáng)力工具。

3. haESCs與CRISPR/Cas9：haESCs作為一種強(qiáng)大的研究基因功能的工具，可以將基因功能研究從細(xì)胞水平提升至個(gè)體水平，即通過基因編輯技術(shù)與ICAHCI技術(shù)建立半克隆小鼠的基因突變文庫(kù)，而CRISPR/Cas9技術(shù)作為其中具有代表性的技術(shù)，大大降低了細(xì)胞水平上基因編輯的難度，使得haESCs與基因編輯技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于基因功能研究成為可能。CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，在該系統(tǒng)中，Cas9核酸內(nèi)切酶可通過容易進(jìn)行修飾的引導(dǎo)RNA(guide RNA)靶向結(jié)合并切割特定DNA序列，并通過這種方式高效特異地進(jìn)行基因操作[34]。通常，基于同源重組的基因組編輯技術(shù)在小鼠胚胎干細(xì)胞的遺傳修飾中有著廣泛的應(yīng)用[35]，但是這種方式存在F0代基因型不穩(wěn)定、嵌合體占較大比例、文庫(kù)制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力以及在制備多個(gè)基因編輯的模型上效率低下等問題，尤其是在建立多個(gè)基因編輯的動(dòng)物疾病模型時(shí)尤為明顯，因?yàn)楂@取多個(gè)特定基因的突變成功率極低，而且在妊娠期長(zhǎng)、性成熟時(shí)間長(zhǎng)以及單胎生育的大型動(dòng)物身上難以實(shí)行，使用haESCs則可以很大程度上解決這些問題。首先，haESCs可無(wú)限增殖并分化為三胚層，因此可獲得大量的樣本進(jìn)行CRISPR-Cas9文庫(kù)導(dǎo)入和篩選，這確保了獲得的半克隆動(dòng)物模型攜帶了特定的遺傳修飾，很大程度上避免了獲得嵌合體F0代的問題，有效縮短了獲取模型動(dòng)物的周期。除此之外，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞有精子的特性，可使卵母細(xì)胞受精，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞水平的遺傳修飾通過遺傳給后代完成了從細(xì)胞到個(gè)體水平的轉(zhuǎn)變；其次，haESCs作為“中介”，可實(shí)現(xiàn)一步轉(zhuǎn)化為個(gè)體文庫(kù)，通過細(xì)胞水平篩選避免了個(gè)體水平的篩選，極大節(jié)約了試驗(yàn)成本及時(shí)間。

2018年，Li等[36]課題組將CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單堿基編輯系統(tǒng)(BE3)與haESCs介導(dǎo)的半克隆技術(shù)結(jié)合，在個(gè)體水平上進(jìn)行了Dnd1氨基酸功能位點(diǎn)的遺傳篩選。Dnd1基因是影響小鼠原始生殖細(xì)胞(PGCs)發(fā)育的重要基因，他們發(fā)現(xiàn)將攜帶BE3的haESCs注入卵子可以產(chǎn)生純合突變的半克隆小鼠，而向haESCs中導(dǎo)入Dnd1基因的靶向sgRNA慢病毒文庫(kù)可以在半克隆小鼠誘導(dǎo)單堿基突變，最終發(fā)現(xiàn)了E59K、V60M、P76L和G82R對(duì)DND1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性具有重要作用。該體系拓展了haESCs在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能方面的應(yīng)用，使得預(yù)測(cè)疾病相關(guān)基因的致病位點(diǎn)成為可能。除此之外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)促進(jìn)了全基因組敲除haESCs文庫(kù)的產(chǎn)生，兩者之間的“強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手”將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)遺傳學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。

4. haESCs與印記基因研究：人類二倍體基因組包含23條母源染色體和23條父源染色體，正常情況下，父源與母源等位基因均有表達(dá)。然而，1984年McGrath等[37]和Surani等[38]等通過嘗試建立孤雌(雙母本來(lái)源)和孤雄(雙父本來(lái)源)胚胎證實(shí)了在哺乳動(dòng)物中，親代基因組功能并不均等，且親本雙方的基因組都是胚胎發(fā)育所必需的，而這種模式便是通過基因印記的方式實(shí)現(xiàn)的?；蛴∮洷举|(zhì)上是一種差異性表觀遺傳機(jī)制，在這種表觀遺傳機(jī)制中，親本的等位基因出現(xiàn)差異性表達(dá)進(jìn)而影響表型表達(dá)[39]。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者常用同源敲除重組法作為確定印跡基因體內(nèi)功能的標(biāo)準(zhǔn)方法，即通過敲除印記產(chǎn)生相應(yīng)的模式動(dòng)物揭示印記基因的效應(yīng)。這種策略耗費(fèi)大量時(shí)間與資源，嚴(yán)重阻礙了印記基因功能研究的發(fā)展。相比之下，若能夠通過haESCs代替卵母細(xì)胞或精子的基因組構(gòu)建動(dòng)物模型，可節(jié)省大量人力、物力與時(shí)間，極大地方便了在體內(nèi)研究印記基因功能和調(diào)控機(jī)制。比如，結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)，在體外對(duì)haESCs進(jìn)行修飾生成具有特定遺傳修飾的小鼠模型，可成為研究印記基因功能的一種全新工具。目前，對(duì)于該細(xì)胞系是否能夠代替卵母細(xì)胞或精子基因組高效獲得足月發(fā)育的子代尚未定論，但在探索印記基因功能和調(diào)控機(jī)制方面，haESCs仍不失為一種潛在的高效便捷的研究工具。

5. haESCs與單性生殖：?jiǎn)涡陨嘲ü麓粕撑c孤雄生殖。孤雌生殖是指卵子在不受精的情況下通過自身DNA復(fù)制而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，在自然界中較為常見，如蜥蜴、蛙和魚類中均存在孤雌生殖現(xiàn)象。與之對(duì)應(yīng)，孤雄生殖只存在于極個(gè)別低等動(dòng)物中，高等哺乳動(dòng)物中目前還未發(fā)現(xiàn)孤雄生殖現(xiàn)象，這是因?yàn)橛∮浕蜃璧K了單一親本基因組胚胎的正常發(fā)育，它的存在為沖破性別壁壘增添了一道難以跨越的“鴻溝”?？缭健傍櫆稀钡牡?步始于2004年，日本科學(xué)家Kono等[22]利用缺失H19印記區(qū)的未成熟卵母細(xì)胞首次獲得了活的孤雌小鼠，首次實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物孤雌生殖，這一重大突破驗(yàn)證了基因印記正是小鼠單性生殖的阻礙，加深了人們對(duì)于印記基因的理解。3年后，Kawahara等[23]通過改進(jìn)這一方法，即刪去H19-DMR和IG-DMR兩個(gè)印記區(qū)域提高了孤雌小鼠的出生率。之后，隨著各種生物的單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了haESCs作為配子替代物生成單性生殖動(dòng)物的“妙用”，雖然孤雌小鼠的獲取已然不是困難，但孤雄小鼠的難關(guān)一直未被攻克。直到2018年，Li等[40]團(tuán)隊(duì)率先取得進(jìn)展，為獲取活體孤雄小鼠，他們敲除了包含Gnas免疫印跡區(qū)在內(nèi)的7個(gè)印記區(qū)，并通過四倍體補(bǔ)償?shù)姆绞綇?77個(gè)胚胎中獲取了12只孤雄小鼠，這是世界上第1例擁有兩個(gè)父源基因組的孤雄小鼠，證實(shí)了高等哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)孤雄生殖的可行性。雖然12只小鼠中有10只存活不到兩天，剩余2只也未成年，但是該團(tuán)隊(duì)以haESCs作為研究工具，闡述了哺乳動(dòng)物跨越同性生殖障礙的必要因素，說(shuō)明了以haESCs為配體替代物構(gòu)建胚胎體系的方法可作為“跳板”研究胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步延伸了haESCs應(yīng)用的深度和廣度。

三、結(jié)論與展望

在人類疾病與細(xì)胞功能研究進(jìn)展不斷深化的背景下，haESCs的研究已達(dá)到一定的水準(zhǔn)。雖然其細(xì)胞系的建立、維持及將細(xì)胞系轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用的過程中尚存在許多問題，但haESCs具有的多能性以及在各種臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中的適用性都證明了其具備重要的應(yīng)用價(jià)值，目前研究者對(duì)于haESCs的性質(zhì)和獲取方法已具備了相當(dāng)程度的認(rèn)知，未來(lái)的研究應(yīng)著眼于如何高效保存haESCs并將其應(yīng)用于各種領(lǐng)域上?？偠灾?，haESCs在未來(lái)的一段時(shí)間內(nèi)仍會(huì)是干細(xì)胞研究的重點(diǎn)之一。