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    人卵母細胞體外成熟后受精所形成胚胎篩選模式的建立

    2020-09-28 09:11:56狄春光王慧王功發(fā)王毅華科王麗萍
    生殖醫(yī)學雜志 2020年9期
    關鍵詞:卵裂囊胚卵母細胞

    狄春光,王慧,王功發(fā),王毅,華科,王麗萍

    (浙江省嘉興市婦幼保健院生殖中心,嘉興 314000)

    卵母細胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)是一項新的輔助生殖技術,可用于難治性多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和促排卵周期中卵巢反應不良患者不成熟卵母細胞的體外培養(yǎng)成熟,目前國內外IVM技術并不是很成熟。有研究表明IVM后的卵母細胞紡錘體結構和染色體構型異常比例要高于正常胚胎[1],因此如何在IVM胚胎中篩選出正常且發(fā)育潛能高的胚胎,是臨床上亟待解決的問題。目前的胚胎形態(tài)學評估只能在固定的時間點對胚胎進行觀察[2],不能對影響胚胎發(fā)育潛能的非正常事件,如非二倍性卵裂等進行觀察評估,故胚胎形態(tài)學評估在不同發(fā)育潛能的胚胎篩選上有一定局限性[3]。而時差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging,TLI)為非侵入性胚胎評估系統(tǒng),通過對培養(yǎng)中的胚胎進行連續(xù)觀察,獲得與胚胎發(fā)育相關的動力學參數,從而準確評估其發(fā)育潛能[4-5],是對胚胎形態(tài)學評估的一個有力補充。因此本研究利用TLI結合胚胎形態(tài)學評估方法建立一種新的IVM胚胎篩選模式,以期為臨床實踐中挑選高發(fā)育潛能的胚胎移植提供參考,以提高患者臨床妊娠率。

    資料與方法

    一、研究對象

    收集2016年2月至2019年5月于本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療患者的402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養(yǎng)。卵母細胞IVM后行ICSI授精,精子來源均為患者丈夫,受精后的胚胎在TLI系統(tǒng)中觀察培養(yǎng)。排除標準:合并艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗原陽性患者。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會審查,所有患者夫妻雙方已簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.IVM培養(yǎng)液準備:G-2 plus胚胎培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典),含有0.2 μg/ml 17β-雌二醇(Sigma,美國)、75 U/L FSH和150 U/L HCG(Serono,瑞士)。

    2.未成熟卵母細胞的收集及培養(yǎng):所有患者從上一月經周期排卵后7 d或月經第2天開始注射達菲林(Ipsen,法國)針劑0. 1 mg/d,降調節(jié)至少14 d后檢查性激素水平,達降調水平,開始注射果納芬(Serono,瑞士)或麗申寶(珠海麗珠制藥)進行控制性促排卵,至雙側卵巢內有2個或2個以上的卵泡直徑達 18 mm時,注射重組HCG 250μg(Serono,瑞士),36 h后在陰道超聲引導下取卵。ICSI前剝除卵母細胞周圍的大部分顆粒細胞,經倒置顯微鏡觀察卵母細胞的成熟程度,選擇未成熟卵母細胞(GV期或MI期)供本研究使用。將未成熟卵母細胞移入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24~40 h,如果卵母細胞成熟則行ICSI受精,受精卵在TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)。

    3.TLI系統(tǒng)使用及胚胎培養(yǎng):使用Primo Vision(Vitrolife,瑞典)TLI系統(tǒng),圖像每5 min采集1次,共連續(xù)培養(yǎng)6 d。所有胚胎均采用WOW 9孔培養(yǎng)皿,卵裂期胚胎培養(yǎng)液為37℃、6%CO2平衡過夜的G-1 plus(Vitrolife,瑞典)培養(yǎng)液。囊胚培養(yǎng)為37℃、6%CO2平衡過夜的G-2 plus(Vitrolife,瑞典)培養(yǎng)液,培養(yǎng)過程中均有Primo Vision成像系統(tǒng)采集圖像,并進行胚胎發(fā)育的動力學參數與卵裂模式分析。

    4.胚胎發(fā)育時間參數和卵裂模式設定:胚胎發(fā)育各時間點的命名方法參照Ciray標準[6],將ICSI受精時間記為“0”點,原核消失時間(tPNF),發(fā)育至2細胞時間為t2,發(fā)育至3細胞時間為t3,以此類推為t4、t5。2細胞發(fā)育至3細胞所需時間為cc2,3細胞發(fā)育至4細胞所需時間為s2,比較第3天(D3)IVM胚胎未形成囊胚組(A組)和形成囊胚組(B組)相應的動力學參數。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂、非軸性卵裂、不均、卵裂球碎裂、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯等。

    5.胚胎評估標準:卵裂期胚胎評估參考Peter標準[7],囊胚期胚胎評估參考Gardner標準[8]。D3可移植胚胎:細胞數≥4個,碎片≤30%,胚胎內無異常結構;D3優(yōu)選胚胎:細胞數7~12個,碎片≤20%;D3次選胚胎:D3可移植胚胎中優(yōu)選胚胎除外的胚胎。

    三、統(tǒng)計學分析

    采用SPSS 25.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。胚胎動力學參數tPNF、t2、t3、t4、t5、cc2、s2等計量資料不符合正態(tài)分布,以中位數(四分位數)[M(Q25,Q75)]表示,組間比較用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗。對非二倍性卵裂發(fā)生率、囊胚形成率等計數資料用頻數和率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    一、胚胎形態(tài)學評估選擇發(fā)育潛能更高的IVM胚胎

    本研究共納入402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養(yǎng),共有315枚成熟,成熟率為78.4%;對315枚IVM成熟卵母細胞進行ICSI后,正常受精219枚,形成D3可移植胚胎數162枚。按胚胎形態(tài)學標準評估,在D3獲得優(yōu)選胚胎95枚,次選胚胎67枚。優(yōu)選胚胎和次選胚胎的囊胚形成率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

    表1 兩組囊胚形成率比較(%)

    二、IVM胚胎卵裂模式與囊胚形成的關系

    通過TLI觀察,我們發(fā)現在219枚受精卵中非二倍性卵裂的發(fā)生率最高(24.2%),其后分別為正常卵裂(21.9%)、不均(17.8%)、發(fā)育停滯(16.9%)、非軸性卵裂(10.1%)、卵裂球碎裂(9.1%)。IVM胚胎中正常卵裂胚胎的囊胚形成能力最高(52.1%),其次是非軸性卵裂胚胎(45.5%),再次為分裂不均胚胎(35.9%),卵裂球碎裂最低(10.0%),發(fā)育停滯和非二倍性卵裂胚胎均無囊胚形成(表2)。

    表2 IVM胚胎中各卵裂模式的發(fā)生率和囊胚形成率(n=219,%)

    三、動力學參數對IVM胚胎發(fā)育潛能的預測性

    D3 IVM胚胎未形成囊胚組(A組,111枚)和形成囊胚組(B組,51枚)相應的動力學參數進行比較,發(fā)現兩組動力學參數tPNF、t2、t3、cc2、s2比較均無顯著性差異(P>0.05),t4、t5比較有顯著性差異(P<0.05)(表3),提示t4、t5對IVM胚胎的發(fā)育潛能具有一定預測性。B組t4、t5的參數值范圍分別為(24.6~41.9)h和(26.1~56.9)h,該范圍內的IVM胚胎具有更高的囊胚形成能力。

    表3 兩組動力學參數比較[M(Q25,Q75),h]

    四、TLI結合胚胎形態(tài)學評估建立IVM胚胎篩選模式

    首先在D3 IVM胚胎中排除發(fā)生非二倍性卵裂的胚胎,非二倍性卵裂胚胎為廢棄胚胎(即E級胚胎)。然后再按胚胎形態(tài)學評估將IVM胚胎分為可移植胚胎和廢棄胚胎,繼續(xù)將可移植胚胎分為優(yōu)選胚胎和次選胚胎,結合形成囊胚最佳的t4、t5動力學參數范圍,再篩選出A、B、C、D四級胚胎。A級胚胎符合優(yōu)選胚胎標準,且胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內;B級胚胎符合優(yōu)選胚胎標準,胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內;C級胚胎符合次選胚胎標準,胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內;D級胚胎符合次選胚胎標準,胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內。胚胎移植或冷凍優(yōu)先級為A>B>C>D(圖1)。

    圖1 IVM胚胎篩選模式

    五、驗證篩選模式下所選胚胎的囊胚形成能力

    再次收集123枚未成熟卵細胞,經IVM成熟92枚,受精后得到D3可移植胚胎43枚。在所建立的篩選模式下篩選出A級胚胎14枚、B級胚胎11枚、C級胚胎8枚、D級胚胎10枚,繼續(xù)囊胚培養(yǎng),結果優(yōu)選胚胎囊胚形成率44.0%。該模式下各級胚胎的囊胚形成率如下:A(64.3%)>B(18.2%)>C(12.5%)>D(10.0%)。該模式所選出的A級胚胎囊胚形成率顯著高于優(yōu)選胚胎(64.3% vs. 44.0%)(P<0.05),證實該篩選模式在IVM胚胎高發(fā)育潛能胚胎的篩選中有較高的應用價值。

    討 論

    如何快速有效地挑選高發(fā)育潛能的IVM胚胎,一直是臨床上亟待解決的問題。本研究中我們利用TLI系統(tǒng)結合卵裂期胚胎形態(tài)學評估,建立了有效準確的IVM胚胎篩選模式,有利于優(yōu)化篩選胚胎流程,快速挑選出高發(fā)育潛能的胚胎進行移植,經篩選后的A級胚胎囊胚形成率為64.3%,遠高于胚胎形態(tài)學評估所得優(yōu)選胚胎的囊胚形成率44.0%,具有非常大的臨床應用價值。

    胚胎發(fā)育過程中,一些非正常事件的發(fā)生,如非二倍性卵裂、不均、發(fā)育停滯、非軸性卵裂、卵裂球碎裂等,都可能預示著胚胎未來的命運[9]。非正常事件中不均、發(fā)育停滯可以通過在D1、D2、D3等固定時間點對胚胎進行形態(tài)學觀察對照發(fā)現,而非二倍性卵裂、非軸性卵裂和卵裂球碎裂則很難被傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學評估方法發(fā)現,TLI技術對胚胎不間斷地連續(xù)觀察,可獲取胚胎發(fā)育全過程的動態(tài)影像,能對胚胎發(fā)育進行更加全面和細致的記錄[10],因此非軸性卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂可在TLI觀察下迅速被發(fā)現。本研究中非軸性卵裂、卵裂球碎裂等胚胎均有囊胚形成,而非二倍體卵裂胚胎的囊胚形成率為0%,并且非二倍性卵裂發(fā)生率最高(24.2%),因此我們認為在IVM胚胎篩選中應首先剔除非二倍性卵裂胚胎。王珊珊等[11]報道非二倍性卵裂胚胎的優(yōu)質囊胚形成率僅為2.16%。Athayde等[12]報道非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率為11.7%,種植率只有3.7%,建議非二倍性卵裂作為胚胎篩選的排除條件。因此,本研究中我們建立的IVM胚胎篩選模式中首要的排除條件為非二倍性卵裂胚胎。

    目前已有很多研究將TLI技術運用到胚胎篩選評估中,主要通過胚胎動力學參數對胚胎發(fā)育潛能進行預測[13-15]。本研究中我們發(fā)現t4形成囊胚的最佳范圍為(24.6~41.9)h,當t4>41.9 h時囊胚形成能力下降。Yang等[16]利用TLI系統(tǒng)研究其動力學參數對138枚受精卵發(fā)育成囊胚的影響,發(fā)現當t4>41.3 h時,胚胎形成囊胚能力下降。與我們的結果相似,也從側面證實參數t4的重要性。t5同樣可以作為胚胎發(fā)育潛能的預測性參數,Meseguer等[15]對285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時間、卵裂球大小和多核等做了詳細的回顧性分析,總共移植了522枚胚胎,結果顯示當t5最佳范圍為(48.8~56.6)h時,其胚胎種植率約40%,遠高于其范圍之外的種植率。本研究中我們確定的t5最佳范圍為(26.1~56.9)h,比Meseguer等[15]的確定范圍略大,分析其原因可能為各中心的促排卵方案、培養(yǎng)環(huán)境及人員操作等差異造成了各中心提取的共性參數有所不同。因此,各生殖中心應該根據最適合本中心的共性參數,挑選優(yōu)質胚胎進行移植。

    胚胎形態(tài)學評估雖然有一定局限性,但其挑選的正常優(yōu)質胚胎的囊胚形成率依然可達60%以上,且效率遠高于TLI,依然是各大實驗室胚胎評估的主要方法。而TLI雖然有很多優(yōu)點,但考慮到價格因素,每臺TLI系統(tǒng)加上配套耗材估計使用價格達百萬元以上,因此現階段大規(guī)模的TLI應用還不現實,但對于反復移植失敗、高齡、需IVM等特殊患者的應用,能提高TLI的使用價值。尤其使用TLI結合胚胎形態(tài)學評估對胚胎進行篩選,可使篩選高發(fā)育潛能胚胎的效果得到提高[17-18]。對反復移植失敗、高齡、需IVM等患者而言,其胚胎染色體異常的概率遠大于正?;颊?,利用TLI結合胚胎形態(tài)學評估方法從中篩選高發(fā)育潛能的胚胎,可以顯著提高這些患者的妊娠率。本研究中我們進行IVM培養(yǎng)的不成熟卵母細胞是當患者的優(yōu)勢卵泡直徑達18 mm時經過取卵后獲得,患者所獲得的卵母細胞大部分已成熟,不成熟卵母細胞只占小部分,患者有足夠正常成熟卵母細胞來源的胚胎移植,因此IVM胚胎的臨床應用價值仍然具有一定局限性[19]。而在臨床上經典的IVM促排方案中,當優(yōu)勢卵泡直徑達10 mm~12 mm時,超聲引導下經取卵術獲得的卵母細胞均不成熟,經IVM培養(yǎng)后才能成熟,并具有受精形成胚胎的能力。因此臨床上經典的IVM促排方案對因卵泡發(fā)育遲緩影響卵母細胞成熟的不孕患者來說意義重大。利用TLI結合形態(tài)學評估方法建立的這種針對IVM胚胎的篩選模式,對經典IVM促排方案來源的IVM胚胎篩選,具有極高的借鑒和應用價值。

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