掌葉覆盆子組培快繁技術(shù)

謝從壽 陳泳和 應(yīng)薛養(yǎng) 鄭平漢 楊福良 饒寶蓉 熊欣沁 胡建珠 陳琦輝

摘?要：為掌葉覆盆子的組培快繁篩選最佳培養(yǎng)基配方。以掌葉覆盆子優(yōu)良單株NS8一年生枝條為外植體，在不同激素成分及濃度水平下進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明：最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA3 0 mg·L-1，誘導(dǎo)率達(dá)到68%，芽苗健壯;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，苗勢健壯，增殖系數(shù)達(dá)到4.87;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.6 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+活性炭0.8 g·L-1，生根率達(dá)到95.3%，生根數(shù)達(dá)到5.7條，根長達(dá)到5.8 cm，根系發(fā)達(dá)，苗勢健壯。結(jié)果表明篩選出的最佳培養(yǎng)基配方適宜本土掌葉覆盆子品種的組培快繁，為在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗及大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野生資源;掌葉覆盆子;組織培養(yǎng);快速繁殖

中圖分類號：S567?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）10-0032-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.006

Abstract： The optimal medium formula was selected for the tissue culture and rapid propagation of Rubus chingii. In this paper， the fine NS8 annual branch of Rubus chingii was used as the explant to conduct the tissue culture experiments under different hormone composition and concentration levels. The results showed that the best induction medium was MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA3 0 mg·L-1， in which the induction rate reached 68%， and the bud seedlings were haleness. The best medium for proliferation was MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1， in which the growth state of the seedlings was haleness and the proliferation coefficient reached 4.87. The best medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.6 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+ activated carbon 0.8 g·L-1， in which the rooting rate reached 95.3%， the number of rooting was 5.7， and the root length was 5.8 cm， with well developed root system and good growth vigor of seedlings. The results showed that the selected best medium formula was suitable for the tissue culture and rapid propagation of local Rubus chingii， which would provide the basis for obtaining a large number of high-quality seedlings and large-scale commercial production in a short period of time.

Key words： Wild Resources;Rubus chingii;Tissue culture;Rapid propagation

掌葉覆盆子Rubus chingii Hu為薔薇科Rosaceae懸鉤子屬Rubus L.多年生漿果類藤本灌木，其未成熟的干燥果實具有益腎、固精、縮尿等功效[1-2]，是重要的傳統(tǒng)中藥材，在治療亞健康及中老年保健領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。成熟果實酸甜可口，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，藥食兼用，被譽為繼柑橘、獼猴桃之后的第三代新型水果[3]。福建省武夷山市和浙江省淳安縣是掌葉覆盆子的重要發(fā)源地，擁有豐富的野生掌葉覆盆子資源[4-5]。南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所從2016年開始調(diào)查和收集兩地野生掌葉覆盆子，并從大量的群體中篩選出生長勢強，株型挺拔，果實碩大，果心小、風(fēng)味濃郁、色澤艷麗、抗病性強的藥用和鮮食采摘型品種，可在福建、江西、浙江等南方丘陵山地種植。

掌葉覆盆子傳統(tǒng)的繁殖方式為采挖野生苗、種子繁殖、根蘗繁殖、分株繁殖等[6-8]。過度采挖野生苗對野生資源破壞大，種子繁殖發(fā)芽率偏低[9]，根蘗和分株繁殖對母株的傷害較大，影響母樹的產(chǎn)量。傳統(tǒng)的繁殖方法，或繁殖系數(shù)過低，或株間差異較大，群體良莠不齊，同時長期采用無性繁殖，會促使病毒積累，往往造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降。通過組織培養(yǎng)方式繁殖種苗，可以對植株進(jìn)行脫毒復(fù)壯，固定優(yōu)良品種性狀，防止品種退化，具有繁殖周期短、繁殖速度快、繁殖系數(shù)高、植株性狀整齊一致，種苗質(zhì)量好等優(yōu)點。劉計權(quán)[1]研究認(rèn)為，掌葉覆盆子的生根培養(yǎng)中無須添加外源激素也能生根，且其生長勢明顯高于非組培苗;孫長清[10]對掌葉覆盆子的生物學(xué)特性進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)根插條用50 mg·L-1的ABT1生根粉浸泡0.5、1 h后，可提高生根率，但出芽率下降;潘彬榮等[2]研究認(rèn)為，利用莖段能誘導(dǎo)出不定芽，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，最佳分化培養(yǎng)基為MS+KT 2.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1，平均每株生根4.8條;王利平等[11]研究認(rèn)為，當(dāng)年生莖段可誘導(dǎo)出不定芽，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1，最佳繼代培養(yǎng)基為MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。

目前福建省掌葉覆盆子組培快繁技術(shù)的研究較少，而隨著地域和品種的不同，往往導(dǎo)致研究結(jié)果差異較大，所以其他地區(qū)和品種的研究只能為福建省掌葉覆盆子的組培快繁技術(shù)提供一定的數(shù)據(jù)支持。為此南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所在調(diào)查、收集、選育野生掌葉覆盆子及前人工作的基礎(chǔ)上，開展組培快繁技術(shù)研究，期望篩選出適宜本地掌葉覆盆子品種的各培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基配方，為在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗及大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

以自選的南平市野生掌葉覆盆子優(yōu)良單株NS8作為供體材料，以其一年生帶芽嫩枝莖段為外植體。

1.2?試驗方法

1.2.1?外植體處理和消毒?在晴天，選擇無病蟲的健康植株，剪取一年生帶芽枝條，剪去所有葉片，用柔軟牙刷輕刷洗凈，放在洗衣粉溶液下浸泡30 min，撈起洗凈后，放在自來水下沖洗2 h，在超凈工作臺上用無菌水清洗2次，用75%酒精消毒30 s，然后用0.1%升汞溶液消毒6～12 min，再用無菌水沖洗6遍，將帶芽莖段用無菌紙吸干后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2?不定芽的誘導(dǎo)?采用L16（43）正交試驗設(shè)計，對帶芽莖段最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。共選用3個激素，每個激素設(shè)4個濃度水平（mg·L-1），6

BA 0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA 0、0.05、0.15、0.25 mg·L-1，GA3 0、0.3、0.5、0.7 mg·L-1，共16個處理。每個處理接種30瓶，每瓶接種2個帶芽莖段，3次重復(fù)，30 d后調(diào)查誘導(dǎo)率。

1.2.3?不定芽的增殖?6BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA濃度為0.05、0.10、0.15 mg·L-1，完全隨機區(qū)組設(shè)計，共9個處理。每瓶接10個不定芽，10瓶為一重復(fù)，設(shè)3個重復(fù)，30 d后調(diào)查其增殖系數(shù)。

1.2.4?不定芽的生根培養(yǎng)?NAA+IBA的濃度分別為0.3 mg·L-1+0 mg·L-1、0.6 mg·L-1+0 mg·L-1、0.9 mg·L-1+0 mg·L-1、0 mg·L-1+0.2 mg·L-1、0 mg·L-1+0.4 mg·L-1、0 mg·L-1+0.6 mg·L-1、0.3 mg·L-1+ 0.1 mg·L-1、0.6 mg·L-1+0.2 mg·L-1，共8個處理，每處理接種10瓶，每瓶接10個不定芽，設(shè)3個重復(fù)，45 d后調(diào)查其生根數(shù)、根長（cm）、生根率。

1.2.5?培養(yǎng)條件?將消毒處理好的外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，35 d后將誘導(dǎo)出的帶3～4節(jié)的小苗剪成帶芽莖段，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d左右，芽苗基部長出大量的不定芽，當(dāng)不定芽長到2～3 cm時，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)和增殖階段以MS為基本培養(yǎng)基，食用白糖30 g·L-1，卡拉膠7 g·L-1，pH 5.8。生根階段以1/2MS為基本培養(yǎng)基，食用白糖20 g·L-1，卡拉膠7 g·L-1，活性炭0.8 g·L-1，pH 5.6。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照每天12 h，光照強度2000 lx。

1.2.6?統(tǒng)計及分析方法?試驗結(jié)果用Minitab 19軟件進(jìn)行方差分析和Fisher LSD多重比較，顯著性水平為P<0.05。誘導(dǎo)率為出芽株數(shù)/無污染株數(shù)， 增殖系數(shù)為總芽數(shù)/接種芽數(shù)， 生根率為生根株數(shù)/總株數(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同培養(yǎng)基對外植體誘導(dǎo)率的影響

帶芽莖段接種10 d后開始出現(xiàn)芽點，20 d后芽苗長至2～3 cm（表1）。

從表1可知，誘導(dǎo)率主要受6BA影響，隨著6BA濃度的升高，其誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。6BA濃度在0.5～1.0 mg·L-1時，誘導(dǎo)率為0.26～0.46，當(dāng)6BA濃度為1.5～2.0 mg·L-1時，誘導(dǎo)率為0.64～0.77，和6BA濃度在0.5～1.0 mg·L-1相比，誘導(dǎo)率明顯提高，達(dá)到顯著水平。NAA會加速泡沫狀愈傷的形成，濃度越高，泡沫越多，當(dāng)NAA濃度為0.25 mg·L-1時，泡沫愈傷過多，蓋住了整個外植體基部，影響誘導(dǎo)芽的形成和生長。GA3主要影響芽苗的長勢，對外植體的誘導(dǎo)沒有影響。當(dāng)GA3為0.5～0.7 mg·L-1時，芽苗偏細(xì)、高。綜合來說，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以處理Y11為最佳，誘導(dǎo)率達(dá)到68%，芽苗健壯。

2.2?不同培養(yǎng)基對外植體增殖效果的影響

增殖培養(yǎng)基接種7 d左右，小苗基部開始出現(xiàn)小芽點，15 d左右增殖苗慢慢長出。從表2可以看出，6BA和NAA對不定芽增殖系數(shù)都有先升后降的趨勢，當(dāng)6BA濃度在0.5～1.5 mg·L-1時，隨著6BA濃度的增加，增殖系數(shù)也隨著增加，當(dāng)6BA濃度在1.5～2.5 mg·L-1時，隨著6BA濃度的增加，增殖系數(shù)開始下降，因此過高的6BA濃度不利于增殖。NAA也有類似的規(guī)律，當(dāng)NAA濃度在0.05～0.10 mg·L-1時，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)也隨著增加;當(dāng)NAA濃度在0.10～0.15 mg·L-1時，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)開始下降。NAA雖然有利于不定芽的增殖，但濃度過高會產(chǎn)生大量的泡沫狀愈傷，覆蓋整個不定芽基部，影響不定芽的增殖和生長。

從表2和表3可知，6BA和NAA是影響增殖的最主要因素，6BA×NAA的P值=0.07>0.05，因此，6BA和NAA基本沒有互作，獨立地對增殖發(fā)揮作用。各處理之間增殖系數(shù)有先升后降的趨勢，6BA是影響增殖系數(shù)的主要因素，NAA次之，以處理Z5綜合表現(xiàn)最好，增殖系數(shù)為4.87，增殖苗健壯。

2.3?不同培養(yǎng)基對生根效果的影響

當(dāng)不定芽長至30 d左右，長2～3 cm時，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（表4）。

生根培養(yǎng)基加活性炭 0.8 g·L-1后，愈傷得到了很好的抑制，接種后基部基本沒有愈傷組織的形成，但生根較遲，直至接種15 d后，才陸續(xù)有根點出現(xiàn)。從表4可以看出，生根率隨著NAA濃度的增加有先升后降的趨勢，NAA濃度過低時，生根率偏低，根數(shù)偏少，根也較短，NAA濃度過高時，則會抑制根的形成。添加NAA和IBA培養(yǎng)基生出的根有較大差異，添加NAA培養(yǎng)基生出的根短而粗，添加IBA培養(yǎng)基生出的根細(xì)而長。NAA和IBA混合使用，則根系粗細(xì)長短較為適中。綜合而言，以處理R8培養(yǎng)基最好，生根率達(dá)到95.3%，根數(shù)達(dá)到5.7條，根長5.8 cm，根系發(fā)達(dá)，苗勢健壯。

3?結(jié)論與討論

掌葉覆盆子具有較高的藥用價值，是一種廣泛使用的傳統(tǒng)中藥材。作為藥食兼用的新型水果也得到社會的廣泛認(rèn)可，進(jìn)行人工栽培將產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)和社會效益[7]。但掌葉覆盆子長期野生生長，群體良莠不齊，扦插繁殖又較為困難，通過組織培養(yǎng)可在短期內(nèi)對優(yōu)良單株進(jìn)行大量擴(kuò)繁，是加快優(yōu)良品種推廣進(jìn)程的有效途徑。為此近年來國內(nèi)對掌葉覆盆子的組培快繁做了相關(guān)研究，但隨著研究地域和品種的不同，得出的結(jié)論差異很大。劉計權(quán)[1]研究認(rèn)為生根培養(yǎng)基中無須添加外源激素就能生根，孫長青[10]通過解剖學(xué)的研究認(rèn)為覆盆子莖中無潛伏根原基，不易誘導(dǎo)生根，其他一些研究認(rèn)為適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基能誘導(dǎo)出不定芽、 不定根，但所使用外源激素的類型和濃度差異較大。通過對南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的掌葉覆盆子優(yōu)良單株NS8進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，利用掌葉覆盆子一年生莖段能誘導(dǎo)出不定芽、不定根，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA3 0 mg·L-1，誘導(dǎo)率達(dá)到68%，芽苗健壯;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，苗勢健壯，增殖系數(shù)達(dá)到4.87;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.6 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+活性炭 0.8 g·L-1，生根率達(dá)到95.3%，生根數(shù)達(dá)到5.7條，根長達(dá)到5.8 cm，根系發(fā)達(dá)，苗勢健壯。

掌葉覆盆子屬藤本植物，其莖內(nèi)無潛伏根原基存在，不易誘導(dǎo)生根[12]，在誘導(dǎo)生根時可適當(dāng)加大生長素濃度，最好NAA和IBA混合使用，同時要掌握好轉(zhuǎn)接時間，轉(zhuǎn)接苗太嫩或太老都會影響生根率。本研究初步認(rèn)為，30～40 d是掌葉覆盆子轉(zhuǎn)接的最佳時期。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）