外泌體
——卵巢癌診治潛在新靶點(diǎn)

應(yīng) 翔，馮杏君，鄭靈芝

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臺(tái)州 317000)

卵巢癌起病隱匿，病程進(jìn)展較快，對(duì)女性健康造成嚴(yán)重的威脅。卵巢癌的病死率位居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]。大部分卵巢癌患者確診時(shí)已處于病程中晚期，且常伴有轉(zhuǎn)移[1]；在有效手術(shù)和以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療下，腫瘤細(xì)胞較易發(fā)生化療耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率較高。因此，深入探索腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于卵巢癌的早期診斷、開展新治療策略以及提高遠(yuǎn)期生存率具有重要意義。

外泌體是直徑為30～100 nm的超微膜性囊泡，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，近年來成為學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。研究表明，腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等幾乎所有類型的細(xì)胞都可釋放外泌體，外泌體內(nèi)攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂類等多種生物活性分子，在細(xì)胞間通信作用中發(fā)揮重要作用[2]。在腫瘤微環(huán)境中，外泌體通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為、血管生成、免疫耐受、腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移前環(huán)境形成等促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[3-4]。此外，外泌體還可存在于血漿、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、腹水等體液，正常人群和卵巢癌患者的外泌體數(shù)量及內(nèi)容物組成和含量均存在差異，可能成為疾病早期診斷的新的生物標(biāo)志物[5]?，F(xiàn)就外泌體及其在卵巢癌早期診斷方面的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體結(jié)構(gòu) 外泌體是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的微小囊泡，于1981年在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被首次發(fā)現(xiàn)，其形成過程主要包括細(xì)胞膜周圍早期核內(nèi)體的形成以及細(xì)胞核周圍晚期核內(nèi)體的發(fā)育成熟[6]。含有腔內(nèi)囊泡的成熟晚期核內(nèi)體，稱多泡體。多泡體可與溶酶體融合，通過水解降解其內(nèi)容物，還可與細(xì)胞膜融合，將其腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外環(huán)境，即外泌體。免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞在正常和病理?xiàng)l件下均可分泌外泌體[3]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞在高壓、低氧的腫瘤微環(huán)境中可產(chǎn)生更多數(shù)量的外泌體[7]。

根據(jù)母細(xì)胞的類型和所處的微環(huán)境，外泌體內(nèi)富含不同類型的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含有參與抗原遞呈的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ以及跨膜蛋白、膜聯(lián)蛋白等多種生物活性蛋白。此外，外泌體中包含DNA、非編碼RNA等核酸，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及疾病診斷中起重要作用[8]。外泌體的釋放依賴于H+/Na+和Na+/Ca2+等離子通道的參與，具有時(shí)間依賴性，并受到細(xì)胞外外泌體的反饋調(diào)節(jié)。

外泌體與靶細(xì)胞作用方式主要有：①與靶細(xì)胞直接融合，釋放內(nèi)容物至靶細(xì)胞中；②被靶細(xì)胞內(nèi)化，其內(nèi)容物被靶細(xì)胞攝??；③與靶細(xì)胞表面特異性蛋白結(jié)合[9]。腫瘤細(xì)胞通過釋放富含蛋白、核酸等生物學(xué)活性的外泌體促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、形成適合腫瘤轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境、幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視等。

1.2外泌體的分離與鑒定 血清和體液中外泌體數(shù)量和內(nèi)容物反映了釋放外泌體母細(xì)胞的生物學(xué)特性及刺激母細(xì)胞釋放的激活劑，故可通過對(duì)外周血或體液外泌體的分離及分析來評(píng)估和監(jiān)測腫瘤患者病情。目前，常用的外泌體分離方法是將不含外泌體的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的上清進(jìn)行差異超速離心，轉(zhuǎn)速尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大部分研究采用(100 000～180 000)×g，離心30～60 min；隨后，根據(jù)細(xì)胞外液中外泌體處于低密度的特性將其與蛋白復(fù)合體等無膜囊泡分離。目前對(duì)外泌體的鑒定主要通過形態(tài)學(xué)觀察和蛋白分析的方法，透射電子顯微鏡可觀察外泌體的形態(tài)和大小。有學(xué)者報(bào)道了一個(gè)分析透射電子顯微鏡圖像中外泌體形態(tài)特征的新軟件[10]。流式細(xì)胞術(shù)是目前外泌體研究最常用的方法，可同時(shí)檢測外泌體表面的多種抗原，并進(jìn)行定量。此外，納米顆粒追蹤分析可測量卵巢癌細(xì)胞外泌體的大小及其表面蛋白的表達(dá)[11]，但適當(dāng)?shù)耐饷隗w分離檢測手段尚有待進(jìn)一步探索。

2 外泌體與卵巢癌

2.1外泌體通過不同機(jī)制促進(jìn)卵巢癌發(fā)生進(jìn)展 腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，在腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移中起重要作用。外泌體通過傳遞內(nèi)容物至鄰近細(xì)胞發(fā)揮生理功能，從而建立適宜腫瘤生長轉(zhuǎn)移的局部微環(huán)境[12]。

外泌體通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者尿液外泌體高表達(dá)微RNA(microRNA，miRNA/miR)-30a-5p，敲除miR-30a-5p基因可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖遷移能力。Enriquez等[14]研究認(rèn)為，卵巢癌細(xì)胞外泌體高表達(dá)RNA結(jié)合蛋白——重組人RNA結(jié)合蛋白28，促進(jìn)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變等過程。Kobayashi等[15]研究報(bào)道，卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力與外泌體中l(wèi)et-7 和miR-200家族的富集密切相關(guān)?？梢?，外泌體可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。腹膜轉(zhuǎn)移是卵巢癌最主要的轉(zhuǎn)移方式。卵巢癌細(xì)胞間失去細(xì)胞間接觸，引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞獲得較強(qiáng)的遷徙侵襲能力，進(jìn)而原發(fā)灶癌細(xì)胞脫落穿透腹膜引起癌細(xì)胞的腹腔內(nèi)播散。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞可通過傳遞外泌體內(nèi)容物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤的腹膜轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。

新生血管的形成在腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Yi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與低級(jí)別卵巢癌相比，高級(jí)別卵巢癌來源外泌體中富含活化轉(zhuǎn)錄因子2和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1等，促進(jìn)血管生成和腫瘤進(jìn)展。有文獻(xiàn)報(bào)道，表達(dá)CD147(EMMPRIN)的卵巢癌細(xì)胞囊泡活化內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，促進(jìn)新生血管的生成[18]。卵巢癌外泌體內(nèi)富含的可溶性上皮鈣黏素，促進(jìn)新生血管形成，與卵巢癌患者惡性腹水形成及腹膜種植轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]。由此可見，腫瘤來源的外泌體在新生血管形成中發(fā)揮重要作用。

腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的局部環(huán)境密切相關(guān)。外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境間的相互作用對(duì)腫瘤進(jìn)展十分重要。侵襲性卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌患者體液分離的外泌體攜帶膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1參與細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。Nakamura等[21]報(bào)道，卵巢癌細(xì)胞通過外泌體傳遞分化抗原44 (CD44)至間皮細(xì)胞，引起基質(zhì)金屬蛋白酶9分泌增加，形成促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展的轉(zhuǎn)移龕，從而建立了外泌體促使適合卵巢癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境。

腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可抑制患者免疫系統(tǒng)，并協(xié)助形成腫瘤轉(zhuǎn)移前小灶。卵巢癌細(xì)胞通過外泌體誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，抑制其吞噬功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。M2型巨噬細(xì)胞由轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-4等誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抑制免疫應(yīng)答、促進(jìn)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞大多表現(xiàn)為M2型。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞外泌體來源的miR-222-3p可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化極化為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。卵巢癌外泌體可降低自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性[22]。可見，腫瘤來源的外泌體可通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中的免疫細(xì)胞減弱免疫應(yīng)答，從而協(xié)助卵巢癌細(xì)胞逃避免疫攻擊。

2.2外泌體在卵巢癌早期診斷及治療監(jiān)測中的價(jià)值 卵巢癌往往起病隱匿，且預(yù)后較差，早期篩查診斷和治療是降低腫瘤死亡率的有效途徑。血清糖類抗原125和人附睪上皮分泌蛋白4的表達(dá)水平是目前最常用的卵巢癌早期診斷指標(biāo)之一，但兩者在卵巢癌篩查中的敏感性和特異性均欠佳，需進(jìn)一步尋找新的敏感性和可靠性較高的早期診斷標(biāo)志物。外泌體在卵巢癌患者血清和腹水中廣泛存在，其在疾病診斷中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。miRNA指約由22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，其表達(dá)水平失衡可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。腫瘤細(xì)胞可釋放外泌體進(jìn)入外周血，包裹在外泌體中的miRNA受到囊泡的保護(hù)，故其穩(wěn)定性較高。Ying等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，卵巢癌患者血清外泌體miR-222-3p表達(dá)水平較高。一項(xiàng)隊(duì)列研究表明，與早期卵巢癌(國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期Ⅰ～Ⅱ期)相比，中晚期卵巢癌(國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期Ⅲ～Ⅳ期)患者外周血外泌體miR-200b和miR-200c表達(dá)水平較高[23]。隨著卵巢癌病程的進(jìn)展，很多患者表現(xiàn)為惡性腹水，血清外泌體中的miRNA譜作為一種無創(chuàng)檢查，可能成為卵巢癌早期篩查與診斷的新的生物標(biāo)志物。

卵巢癌細(xì)胞外泌體內(nèi)富含生物活性蛋白分子。與正常對(duì)照組相比，卵巢癌患者外泌體高表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子[24]。黏附分子24(CD24)與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，卵巢癌患者腹水外泌體高表達(dá)CD24[25]。與早期卵巢癌患者相比，進(jìn)展期卵巢癌患者腹水中外泌體數(shù)量更多，且外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)水平升高[26]。可見，外泌體內(nèi)蛋白表達(dá)水平可能成為新的診斷卵巢癌的標(biāo)志。此外，探索特異度和靈敏度較高的外泌體檢測方法對(duì)外泌體的臨床應(yīng)用非常重要。

除作為腫瘤早期檢查指標(biāo)外，外泌體還可通過參與腫瘤細(xì)胞藥物代謝過程影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可提高上皮性卵巢癌對(duì)順鉑類藥物的耐藥性[27]。鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞外泌體可提高非鉑類耐藥卵巢癌細(xì)胞的耐藥性。卵巢癌細(xì)胞中，對(duì)紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞較紫杉醇敏感細(xì)胞更容易釋放富含P-糖蛋白的外泌體。富含P-蛋白的外泌體可通過調(diào)節(jié)局部腫瘤微環(huán)境提高腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素和紫杉醇的耐藥性[28]。因此，在卵巢癌患者耐藥性篩選生物新標(biāo)記的開發(fā)中，外泌體具有較好的應(yīng)用前景。

2.3外泌體與卵巢癌治療 目前，手術(shù)治療和以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌的一線治療，但由于腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，故卵巢癌的復(fù)發(fā)率較高，且分子靶向治療和免疫治療仍無法提高卵巢癌患者的5年生存率。

以RNA干擾為基礎(chǔ)的基因治療是基于小干擾RNA引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，目前有研究致力于將其應(yīng)用于惡性腫瘤的治療。外泌體在人體體液循環(huán)中穩(wěn)定存在，且不引起免疫排斥，其作為遞送藥物的載體可提高抗腫瘤治療的成功率[29]。外泌體可保護(hù)RNA分子免受RNA酶、溫度等的影響。Reza等[30]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過傳遞miRNA抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。外泌體可傳遞花青素，故花青素可提高卵巢癌的治療效果[31]。加載雷公藤的外泌體可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖以及腫瘤的生長，具有較好的腫瘤治療潛力[32]。綜上所述，外泌體可作為載體用于治療轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性卵巢癌，但目前此研究尚處于起步階段，仍有待進(jìn)一步的臨床研究。

腫瘤免疫治療是較新的腫瘤治療手段。外泌體具有調(diào)節(jié)免疫的生物學(xué)特性，故有望應(yīng)用于腫瘤免疫治療。樹突狀細(xì)胞可通過活化T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞來源的外泌體可通過激活 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前，樹突狀細(xì)胞外泌體治療部分晚期惡性腫瘤正處于臨床試驗(yàn)階段[33]。

外泌體在卵巢癌免疫治療中具有較好的應(yīng)用潛力，但目前尚無以外泌體為基礎(chǔ)的卵巢癌免疫治療研究的相關(guān)報(bào)道。某些類型的多肽物(如整合素結(jié)合肽)可通過結(jié)合卵巢癌來源的外泌體膜抑制受體細(xì)胞攝取外泌體[34]。外泌體的大小影響其在細(xì)胞間信息傳遞的速度，為其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路，外泌體有望成為卵巢癌免疫治療及靶向治療的有效靶點(diǎn)。

3 小 結(jié)

在婦科腫瘤中，卵巢癌的病死率最高，其發(fā)病機(jī)制未明。近年來，隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入，外泌體的許多未知功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。揭示外泌體在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用為開發(fā)卵巢癌診斷標(biāo)志物以及開辟其治療新策略提供了新的思路。外泌體內(nèi)含有豐富的核酸、蛋白等生物活性分子，并廣泛存在于卵巢癌患者腹水及外周血循環(huán)中，對(duì)卵巢癌的早期診斷具有重要意義。在治療方面，外泌體的研究主要集中于調(diào)節(jié)外泌體的釋放、將外泌體作為載體進(jìn)行藥物傳遞、以外泌體為靶點(diǎn)介導(dǎo)腫瘤靶向治療、基于外泌體的腫瘤免疫治療等方面。目前關(guān)于外泌體的大部分研究仍處于體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)其在人體內(nèi)表達(dá)及調(diào)控的研究較少。因此，外泌體與卵巢癌形成和進(jìn)展關(guān)系及其在腫瘤診治的應(yīng)用有待進(jìn)一步探究。