功能性復(fù)合多糖飲料的研制及其抗氧化和降糖活性研究

蔣鵬飛，王趙改，史冠瑩，王曉敏，張樂，程菁菁，趙麗麗，王旭增

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州，450000)

多糖(polysaccharide)是一類由多個相同或不同類型單糖失水縮合而成的高分子碳水化合物，可以激活人體免疫細(xì)胞、促進(jìn)功能細(xì)胞因子的生成、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和清除自由基等，具有降血糖血脂[1-2]、抗癌[3]、抗輻射、抗氧化[4-5]以及增強機體免疫力[6]等生物活性，因此多糖越來越多地應(yīng)用于保健飲料的開發(fā)。但目前市場上的多糖飲料存在原料單一、口感和功能性差、易產(chǎn)生沉淀等問題[7]，急需配方優(yōu)化和加工技術(shù)的改進(jìn)。

香椿[Toonasinensis(A.Juss.)Roem]為楝科(Meliaceae)香椿屬，是著名的藥食兩用木本植物，被國內(nèi)外譽為“綠色保健菜”，因富含多酚、黃酮和多糖等活性物質(zhì)而具有抗氧化和降血糖等功能[8-9]。香椿紅茶采用香椿葉發(fā)酵做茶，通過適度的萎凋與發(fā)酵，激發(fā)鮮葉中酶的活性，促使鮮葉中大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解為可吸收的小分子，使茶水中營養(yǎng)物豐富，口感醇香，功能效果更佳[10]。大麥(HordeumvulgareL.)為禾本科植物，含有多糖等活性成分，具有抗氧化、降低血清膽固醇、刺激免疫和抗腫瘤等多種生物活性，且無毒副作用，在功能食品和醫(yī)藥方面有良好應(yīng)用前景[11-12]。山藥(DioscoreaoppositeThunb.) 為薯蕷科多年生宿根蔓生植物薯蕷的塊莖，是我國傳統(tǒng)的藥食同源食物之一[13]。山藥多糖目前被公認(rèn)為山藥主要的生物活性成分，占其干物質(zhì)的 2.15%～2.92%[14]。決明子(Cassiaseem)為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，具有降壓降脂、保肝明目、潤腸抗菌等作用，所含多糖、大黃酸和大黃素是治療糖尿病的活性物質(zhì)[15]。

目前尚未有功能性復(fù)合多糖飲料及其功能活性的研究報道。本研究采用超聲波輔助提取香椿、決明子、大麥、山藥多糖，以提取到的提取液為主要原料，添加甜葉菊和檸檬酸調(diào)節(jié)口感，研究功能性復(fù)合多糖飲料的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品配方和感官品質(zhì)，并通過測定對DPPH自由基、羥基自由基的清除作用及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用來評價其功能活性，以期得到一種工藝合理、營養(yǎng)健康豐富、富含多糖等生物活性的功能性復(fù)合多糖飲料，解決目前市場上的多糖飲料原料單一化、口感和功能性差等問題，為開發(fā)功能性復(fù)合多糖飲料提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

香椿葉選取頭茬嫩芽，采自登封市嵩陽紅香椿種植專業(yè)合作社；決明子、大麥和甜葉菊，鄭州市張仲景大藥房；山藥，鄭州市拜特超市；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)，美國Sigma公司；DPPH，東京化成工業(yè)株式會社；鐵氰化鉀、KH2PO4、K2HPO4、水楊酸和Na2CO3均為分析純；水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-250 A型高速多功能粉碎機，浙江省永康市青松五金廠；DGG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；SB-5200 DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ME204E 型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GENESYS 10S型UV-VIS紫外分光光度計，美國Thermo公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；H1650R/H1850R 臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；NUII-10T型實驗室(超)純水機，南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 功能性復(fù)合多糖飲料的工藝流程

制備各種多糖液→混合→調(diào)配→過濾→均質(zhì)→灌裝→滅菌→冷卻→成品

1.3.1.1 香椿紅茶、大麥、決明子和山藥多糖提取液的制備

利用本實驗室發(fā)明的香椿紅茶專利制作香椿紅茶。取香椿紅茶(干)用超微粉碎機粉碎后過200目篩。稱取香椿紅茶粉20 g，按料液比1∶20(g∶mL)的比例加入80 ℃的水，超聲輔助提取3 h，過濾后的上清液為香椿葉多糖提取液。

分別稱取40 g大麥和決明子(干)，放置烤箱的烤盤中，上火160 ℃，烘烤10 min，冷卻至室溫備用。將烘烤后的大麥和決明子于超微粉碎機中粉碎后過200目篩子。稱取大麥粉和決明子粉各20 g，按料液比1∶20(g∶mL)的比例加入100 ℃的水，超聲輔助提取3 h，過濾后的上清液為大麥多糖提取液和決明子多糖提取液。

選取新鮮的山藥，經(jīng)去皮、切片、護(hù)色、干燥、粉碎后得到山藥粉，稱取山藥粉20 g，按料液比1∶20(g∶mL)的比例加入80 ℃的水，超聲輔助提取3 h，過濾后的上清液為山藥多糖提取液。

1.3.1.2 混合調(diào)配

以香椿葉、決明子、大麥和山藥多糖提取液為原料，甜葉菊和檸檬酸調(diào)節(jié)口感，設(shè)計6因素5水平L25(56)正交試驗，按正交試驗(表1)確定最佳配比混合，選出最優(yōu)配方，然后將多糖溶液與穩(wěn)定劑料液定量混合，充分混合均勻后，最后用飲用水補至產(chǎn)品的最終總體積100 mL。正交試驗因素及水平如表1所示。

1.3.1.3 均質(zhì)

將過濾好的功能性復(fù)合多糖飲料在18～20 MPa，50～60 ℃下進(jìn)行均質(zhì)4～5 min，使多糖飲料混合均勻，防止分層、沉淀，口感更細(xì)膩。

1.3.1.4 殺菌與灌裝

將均質(zhì)后的功能性復(fù)合多糖飲料加熱到90 ℃，趁熱灌裝于清洗消毒的玻璃瓶中，封口后在115 ℃的高壓蒸汽鍋中滅菌20 min后，放于冷水中冷卻至室溫，即為成品。

1.3.2 感官評定

感官評定從視覺、嗅覺、味覺即澄清度與色澤、氣味、口感3方面的指標(biāo)對其進(jìn)行評定，其中澄清度與色澤占40分，氣味占30分，口感占30分[16]。功能性復(fù)合多糖飲料評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 多糖含量測定

采用硫酸-苯酚比色法[17]，稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖25 mg，置于250 mL容量瓶中，定容。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于試管中，用蒸餾水補足至1 mL，各管再加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入5 mL濃H2SO4搖勻，靜置10 min后于30 ℃水浴中加熱20 min，去除冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖檢測質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.010 6x+0.153 8，R2=0.999 3)(x，μg/mL)。吸取1 mL待測液，按上述步驟反應(yīng)后，平行3次測定吸光度，原液多糖含量(μg/mL)按公式(1)計算：

(1)

式中：A,樣品溶液吸光度；f,樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

稱取7.896 mg DPPH，用無水乙醇定容到100 mL，即配成0.2 mmol/L，4℃冰箱避光保存。樣品配制成38.500 mg/mL的母液，再梯度稀釋，使質(zhì)量濃度分別為9.624、4.812、2.406、1.203、0.601、0.300、0.150、0.075 mg/mL。避光反應(yīng)30 min，517 nm處測試不同濃度樣品的吸光度，平行3次測試[18]?！PPH清除率按公式(2)計算：

(2)

式中：A1，樣品溶液吸光度；A2，無水乙醇代替DPPH自由基醇溶液的對照試驗吸光度；A0，蒸餾水代替樣品溶液或VC的空白試驗吸光度。

1.3.3.3 羥基自由基清除率的測定

樣品梯度稀釋，使之分別稀釋成38.50、19.25、9.63、4.81、2.41 mg/mL。在離心管中依次加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣液溶液，0.3 mL 8.0 mmol/L FeSO4，0.25 mL 20 mmol/L H2O2，1.0 mL 3.0 mmol/L水楊酸。在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，流水迅速冷卻，再分別補加0.45 mL蒸餾水，使得溶液體積為3.0 mL。搖勻后10 ℃，2 000 r/min離心15 min，取上清液于510 nm處比色測定OD值，平行測定3次[19]?！H清除率按公式(3)計算：

(3)

式中：A1，樣品溶液吸光度；A2，蒸餾水代替H2O2溶液的對照試驗吸光度；A0，蒸餾水代替樣品溶液或VC的空白試驗吸光度。

1.3.3.4 復(fù)合多糖飲料對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以pNPG為反應(yīng)底物，經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解α-1,4-葡萄糖苷鍵后釋放出對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)，在410 nm下檢測黃色的對硝基苯酚的生成量作為酶活大小的判定標(biāo)準(zhǔn)[20]。實驗各組物質(zhì)加入量如表3所示。

樣品梯度稀釋，使之稀釋成38.50、19.25、9.63、4.81、2.41 mg/mL。向5 mL試管中依次加入pH 6.8，0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液、不同濃度的待測多糖飲料和α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)后37℃水浴鍋預(yù)熱20 min，加入pNPG溶液(2.5 mmol/L)37 ℃條件下水浴反應(yīng)30 min，加入610 μL Na2CO3溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)，于410 nm處測定各組OD值。按照公式(4)計算不同濃度的多糖飲料對α-葡萄糖苷酶的抑制率。通過繪制多糖飲料濃度與酶活抑制率的關(guān)系曲線圖，利用SPSS軟件計算3種水提物對α-葡萄糖苷酶酶活抑制的IC50。

(4)

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每次實驗做3次平行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件，組間差異顯著性采用t檢驗分析(P<0.05)；實驗數(shù)據(jù)用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性復(fù)合多糖飲料正交試驗結(jié)果分析

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取香椿葉多糖提取液、決明子多糖提取液、大麥多糖提取液、山藥多糖提取液、甜葉菊和檸檬酸為因素，分別設(shè)計5個水平按L25(56)正交表進(jìn)行正交試驗，以感官評價為衡量指標(biāo)，優(yōu)化功能性復(fù)合多糖飲料配方工藝參數(shù)，試驗統(tǒng)計分析結(jié)果見表4和表5。

注：**代表極顯著(P<0.01)；*代表差異顯著(P<0.05)。

由表4極差分析可知，影響功能性復(fù)合多糖飲料感官評價因素主次順序依次為A>C>F>D>E>B，即對功能性復(fù)合多糖飲料感官評價影響最大的因子是香椿葉多糖提取液。由表5方差分析可知，在實驗誤差范圍內(nèi)，A(香椿葉多糖提取液)和C(大麥多糖提取液)對功能性復(fù)合多糖飲料的口感具有極顯著性影響(P<0.01)，F(xiàn)(檸檬酸)具有顯著性影響(P<0.05)，B(決明子多糖提取液)、D(山藥多糖提取液)和E(甜葉菊)影響不顯著(P>0.05)。獲得功能性復(fù)合多糖飲料最佳配方工藝條件組合為A4B1C4D5E4F1(M號)，即香椿葉多糖提取液16 mL，決明子多糖提取液8 mL，大麥多糖提取液24 mL，山藥多糖提取液28 mL，甜葉菊0.04 g，檸檬酸0.02 g，功能性復(fù)合多糖飲料的感官評分最高。

為驗證正交試驗的預(yù)測結(jié)果，特將(M號)與正交試驗表中感官評價較高的16號、19號和20號進(jìn)行了重復(fù)對比試驗，試驗結(jié)果是M號感官評價得分為91.1分，16號為89.2分，19號為89.4分，20號為89.9分，M號感官評價得分最高，說明正交試驗預(yù)測的準(zhǔn)確性。M號功能性復(fù)合多糖飲料經(jīng)高速離心后無沉淀析出，且多糖含量高達(dá)7.92 mg/mL，是徐雅雯[21]研究的山藥多糖復(fù)合飲料中多糖含量(3.82 mg/mL)的2倍多，是卓榮權(quán)等[22]研究的秋葵多糖飲料中多糖含量(14 mg/100 mL)的56倍，這說明M號功能性復(fù)合多糖飲料不僅具有較好的穩(wěn)定性，還含有豐富的多糖，具有極強的功能活性。

2.2 不同濃度功能性復(fù)合多糖飲料對DPPH自由基清除能力影響分析

利用最優(yōu)的條件生產(chǎn)功能性復(fù)合多糖飲料，按梯度將其稀釋成不同濃度，從圖1可以看出，多糖飲料對DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)多糖飲料質(zhì)量濃度在0.075～0.601 mg/mL之間時，清除能力隨著多糖飲料質(zhì)量濃度的增加呈直線上升；當(dāng)多糖飲料質(zhì)量濃度在0.601～2.406 mg/mL 之間時，清除能力隨著多糖飲料質(zhì)量濃度的增加先急劇升高后逐漸減緩；當(dāng)多糖飲料濃度在2.406～9.624 mg/mL之間時，清除能力隨著多糖飲料質(zhì)量濃度的增加趨于平穩(wěn)。因此功能性復(fù)合多糖飲料具有很強的DPPH自由基清除能力。

2.3 不同濃度功能性復(fù)合多糖飲料對羥基自由基清除能力影響分析

利用最優(yōu)的條件生產(chǎn)功能性復(fù)合多糖飲料，按梯度將其稀釋成不同濃度，多糖飲料對羥基自由基的清除能力如圖2所示。功能性復(fù)合多糖飲料的質(zhì)量濃度在2.41～38.50 mg/mL的實驗范圍內(nèi)，多糖飲料清除羥基自由基的能力隨著溶液質(zhì)量濃度的增加而升高。通過擬合得到的多糖飲料的溶液質(zhì)量濃度與羥基自由基清除率的關(guān)系方程為y=-0.037 3x2+3.099 9x-2.47(R2=0.993 8；2.41～38.50 mg/mL)。由此可以看出，功能性復(fù)合多糖飲料具有很強的羥基自由基清除能力。

2.4 不同濃度的功能性復(fù)合多糖飲料對α-葡萄糖苷酶抑制能力影響分析

利用最優(yōu)的條件生產(chǎn)功能性復(fù)合多糖飲料，如圖3所示，多糖飲料與α-葡萄糖苷酶的抑制率之間存在明顯的劑量依賴關(guān)系，抑制作用隨著多糖飲料質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)多糖飲料質(zhì)量濃度在2.41～9.63 mg/mL之間時，此時酶促反應(yīng)處于混合反應(yīng)階段，抑制率隨著多糖飲料濃度的增加呈現(xiàn)上升的關(guān)系；當(dāng)多糖飲料質(zhì)量濃度在9.63～38.50 mg/mL之間時，此時酶促反應(yīng)處于零級反應(yīng)階段，抑制率趨于平穩(wěn)。當(dāng)多糖飲料的質(zhì)量濃度為38.50 mg/mL時，α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)70.36%。由此可以得出多糖飲料對α-葡萄糖苷酶活性有很明顯的抑制作用。

2.5 功能性復(fù)合多糖飲料抗氧化和對α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值

IC50是評價多糖飲料對DPPH自由基和羥基自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制力的重要指標(biāo)，可作為篩選抗氧化和降糖活性的手段[23]。多糖飲料對DPPH自由基和羥基自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制能力都是隨著濃度的增減而升高，呈劑量依賴型關(guān)系。功能性復(fù)合多糖飲料對DPPH自由基和羥基自由基清除、α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值分別為0.506、24.494、9.280 mg/mL。

3 結(jié)論與展望

本研究采用正交試驗對功能性復(fù)合多糖飲料的配方進(jìn)行優(yōu)化，還檢測了其體外抗氧化活性和體外降糖活性，得到的功能性復(fù)合多糖飲料色澤均勻、滋味協(xié)調(diào)、酸甜適宜，具有較好的穩(wěn)定性、體外抗氧化活性和體外降糖活性。本研究不僅解決了目前市場上多糖飲料原料單一、口感和功能性差的問題，還進(jìn)一步評價了復(fù)合多糖飲料的功能性，為功能性復(fù)合多糖飲料的開發(fā)提供了初步理論依據(jù)，提高了香椿、大麥、決明子、山藥等深加工產(chǎn)品的利用程度，對功能性復(fù)合多糖飲料的開發(fā)及其精深加工研究具有重要意義。另外香椿、大麥、決明子、山藥作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，含有豐富的營養(yǎng)成分和功能活性成分，滿足了現(xiàn)代人健康的生活需求。香椿、大麥、決明子、山藥加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提高了山區(qū)人民種植和生產(chǎn)的積極性，避免了資源的浪費，帶動了農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)和運輸業(yè)等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入，對山區(qū)脫貧致富具有重要意義。