大豆分離蛋白-大豆低聚糖糖基化產(chǎn)物溶解性和乳化性分析

周洋瑩，鄭紅莉，楊文鈺，張清*

1(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川省作物帶狀復合種植工程技術研究中心，四川 成都，611130)

大豆栽培方式多種多樣，東北和黃淮地區(qū)多實行單作、部分間作；而南方地區(qū)主要以套作為主。套作是為充分利用不同作物間的互補關系，人為調節(jié)各類作物的不同組合，搭配成多作物、多層次、多功能的作物復合群體結構的一種栽培方式[1]，使之具有良好的通風透光條件和抗逆性。套作大豆優(yōu)勢突出，具有可觀的經(jīng)濟和生態(tài)效益，蛋白質含量高[2]，可滿足人們對優(yōu)質蛋白的需求。

大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)是一種重要的植物蛋白，主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成，蛋白質含量在90%以上[3]，含多種必需氨基酸及豐富的不飽和脂肪酸、鈣、磷、鐵和膳食纖維等。SPI有溶解性、凝膠性、乳化性和起泡性等多種加工特性，在食品生產(chǎn)中廣泛使用。然而，由于高溫、pH等因素的影響，SPI的應用受到了一定的阻礙。

蛋白質改性方法主要有物理方法、化學方法和生物酶法[4]?；瘜W改性包括糖基化、?；土姿峄确椒?，通過改變蛋白質的結構來改善其功能特性，反應簡單、效果明顯且應用廣泛。糖基化是將糖鏈以共價鍵的形式與蛋白質分子上的α-或ε-氨基相連接而形成糖蛋白，屬于美拉德反應的第一步[5]。此反應無需添加任何催化劑，僅加熱即可自發(fā)進行，分為干熱法和濕熱法。研究表明，糖基化后的大豆蛋白具有優(yōu)良的乳化能力，且溶解性、膠凝性、熱穩(wěn)定性和抗氧化性等均有不同程度的提高[6]。AN等[7]進行了卵清蛋白與羧甲基纖維素的糖基化研究，發(fā)現(xiàn)隨著接枝度的增大，糖基化產(chǎn)物的乳化性能顯著增強；同時，隨著反應時間的延長，接枝物的起泡性下降而泡沫穩(wěn)定性卻顯著提高。

本實驗分別從套作大豆和凈作大豆中提取SPI，與大豆低聚糖混合，通過干法糖基化制備糖基化產(chǎn)物，測定其在不同pH條件下的溶解性和乳化性，比較分析套作大豆和凈作大豆蛋白產(chǎn)品在食品加工性質方面的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豆12套作大豆、南豆12凈作大豆，四川省作物帶狀復合種植研究工程中心；大豆低聚糖(純度99%，水蘇糖∶蔗糖∶毛蕊花糖∶棉子糖=25∶10∶8∶7)，浙江一諾生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，成都市科龍化工有限公司。

DYY-6D電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像儀，北京君意東方電泳設備有限公司；NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash熒光酶標儀，北京朗鐸科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI的提取

參考趙曉園[8]所述的方法。采用粉碎機將大豆粉碎，過60目篩，得大豆粉，備用。向燒杯中加入一定量的大豆粉，按照正己烷∶大豆粉=3∶1(mL∶g)加入正己烷，迅速混勻，封口。置于恒溫水浴鍋(30 ℃)中反應20 min，待反應結束后，將反應液真空抽濾，脫溶，重復脫脂3次。濾餅放入恒溫干燥箱(25 ℃)中，6 h后取出。

采用堿溶酸沉法提取SPI。準確稱取一定量的脫脂豆粉于燒杯中，按照m(脫脂豆粉)∶V(超純水)=1∶15加入超純水，充分攪拌混勻。用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH至7.8～8.0，攪拌2 h，8 000 r/min離心15 min，取上清液用1 mol/L HCl調節(jié)pH至4.6，靜置30 min，8 000 r/min離心15 min，保留沉淀，水洗2～3次后加入少量超純水攪拌混勻，調節(jié)pH至7.0，將漿液冷凍干燥得到SPI。

1.2.2 SPI/大豆低聚糖糖基化產(chǎn)物的制備

將SPI與大豆低聚糖分別以質量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3溶于超純水，蛋白質質量濃度為60 mg/mL，磁力攪拌1 h混合均勻，冷凍干燥后置于4 ℃冰箱中冷藏備用。取一定量的混合粉末于稱量皿中，將其放入干燥器內(nèi)(底部盛裝飽和KBr溶液以保持相對濕度79%)，恒溫60 ℃下分別反應2、4、6、8和10 h，制得不同比例以及不同反應時間的糖基化產(chǎn)物。

1.2.3 糖基化產(chǎn)物的鑒定

1.2.3.1 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyae,OPA)試劑法[9]測定接枝度。試劑1：準確稱取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇；試劑2：將50 mL 0.1 mol/L的四硼酸鈉溶液、5 mL質量濃度200 mg/mL的SDS和200 μL的β-巰基乙醇混合。試劑1和試劑2充分混勻后定容至100 mL，配成OPA試劑(棕色瓶避光保存)。取2 mg/mL的蛋白樣液200 μL于4 mL OPA試劑中，充分振蕩混勻，35 ℃下反應2 min，以OPA試劑加入200 μL水為空白，340 nm測定其吸光度，接枝度按照公式(1)進行計算。

(1)

式中：AC，物理混合物的吸光度；AS，糖基化產(chǎn)物的吸光度。

1.2.3.2 十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

配制5 g/L蛋白溶液，與樣品緩沖液以體積比1∶1混合均勻，沸水浴中煮沸5 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。制備分離膠濃度為10%，濃縮膠為4%的電泳膠片，在孔徑中分別加入標準蛋白(相對分子質量11.0～245.0 kDa)5 L，樣品液10 L，保持電壓為120 V，進行電泳。電泳結束后將膠片放入考馬斯亮藍染色液中染色30 min，于脫色液中脫色，直至條帶清晰，浸泡于體積分數(shù)7%乙酸脫色液中保存。

1.2.3.3 紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析

參考SANG等[10]所描述的方法。將2 mg待測蛋白樣品與200 mg KBr在瑪瑙研缽中研磨成粉，使用壓片機將混合物壓成透明薄片。測量波數(shù)為400～4 000 cm-1，掃描分辨率為2 cm-1，掃描32次。

1.2.4 糖基化產(chǎn)物溶解性和乳化性的測定

1.2.4.1 溶解性的測定

采用考馬斯亮藍G250染色法[11]測定。取6支試管，配制0～100 μg/mL的牛血清白蛋白稀釋溶液，分別取各濃度的稀釋液1 mL加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，振蕩混勻，靜置2 min，595 nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線。

將樣品溶于pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸鹽緩沖液中，充分攪拌溶解。8 000 r/min離心15 min，取0.1 mL上清液稀釋10倍，加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，振蕩混勻，靜置2 min。以考馬斯亮藍G250溶液作為空白，595 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算溶液中蛋白質溶解度。

1.2.4.2 乳化活性(emulsifying activity,EA)與乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ES)的測定

參考王松等[12]的方法。將樣品溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)中，使樣品液質量濃度為1 mg/mL，將40 mL樣品溶液和10 mL大豆油放入100 mL燒杯中用均質機高速勻漿1 min，分別于0 min和10 min從底部吸取50 μL樣液到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后在500 nm波長處測定吸光度，記作A0和A10。以0.1% SDS溶液作為空白對照。乳化活性(m2/g)用公式(2)進行計算，乳化穩(wěn)定性(min)用公式(3)進行計算。

(2)

(3)

式中：F,稀釋度，100;C,樣品液濃度；φ,油相所占體積比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復3次，采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理；采用IBM SPSS Statistics 22進行方差分析(P<0.05)，采用Origin Pro 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 糖基化產(chǎn)物的鑒定

2.1.1 接枝度的測定

糖基化使蛋白質的氨基與糖類還原端羰基接枝，體系中自由氨基的含量相應減少。如圖1-a所示，隨時間的延長，套作SPI與低聚糖的接枝度總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，蛋糖比1∶1,反應物在4 h接枝度最高，達45.07%，其余比例反應物均在6 h達到峰值，接枝度依次為51.33%、65.58%、70.83%和73.81%，不同蛋糖比及反應時間的產(chǎn)物接枝度差異顯著(P<0.05)。反應開始，蛋白質分子受熱，內(nèi)部結構逐漸舒展，氨基基團暴露，蛋白質分子與糖分子進行共價結合，接枝度提高。隨反應時間的延長，反應物逐漸消耗，由于蛋白質分子間的相互作用，自由氨基含量降低，同時接枝后的蛋白質空間位阻增大[13-14]，導致其接枝度進一步下降。1∶3和3∶1反應物的接枝度最高，可能是由于體系中蛋白質分子或糖分子相對較多時，所能提供的反應位點更多，分子間碰撞結合的幾率增加[15]，促進反應的發(fā)生。

如圖1-b所示，蛋糖比1∶3時，凈作SPI與低聚糖的接枝度隨時間的增加顯著升高(P<0.05)，10 h時接枝度達71.11%；其余比例接枝度均先升后降，在6 h或8 h時達到最高。蛋糖比1∶1的接枝度最高達51.34%，而1∶2、2∶1和3∶1比例的最高接枝度分別為37.98%、29.63%和36.59%。蛋糖比1∶3時，體系中糖分子較多，可有更多的羰基與蛋白質的氨基進行共價結合[16]，更利于反應的發(fā)生。

相同反應條件下，套作SPI與凈作SPI糖基化產(chǎn)物的接枝程度和趨勢不盡相同，套作SPI糖基化的接枝度整體較凈作高，這是由于套作大豆中賴氨酸含量高于凈作大豆[17]，而賴氨酸中的自由氨基更易發(fā)生美拉德反應[18]，從而導致其反應的程度不同。

2.1.2 SDS-PAGE分析

如圖2-A所示，糖基化反應4～10 h的電泳條帶中，7S各亞基特征條帶和11S酸性亞基的特征條帶都較SPI有些許上移。糖基化后的蛋白質分子量增大，遷移速率變慢，條帶呈現(xiàn)滯后現(xiàn)象，由此可見，糖基化反應在SPI的7S和11S球蛋白部分均有發(fā)生。4和6 h的電泳條帶顏色明顯減弱，表明糖基化反應較為充分，大多數(shù)蛋白質與低聚糖發(fā)生了結合?？捡R斯亮藍染液通常在酸性條件下以靜電結合的方式與蛋白質分子上的自由氨基和巰基等活性基團作用而顯示藍色[19]，接枝后，自由氨基減少，故染色劑與蛋白分子結合減弱，染色變淺。此外，在8和10 h的泳道頂端均有分子量約為135和245 kDa的新增條帶出現(xiàn)。這是由于蛋白質分子間的交聯(lián)形成了異肽鍵或二硫鍵[20]，這些大分子物質在分離膠頂端積累，隨反應時間的增加而顏色變深。

如圖2-B所示，套作SPI與凈作SPI的電泳條帶無明顯差異，蛋糖比3∶1下反應6 h后，凈作大豆的條帶上移趨勢明顯，且條帶顏色較淺。凈作大豆中第一限制性氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)與賴氨酸含量均低于套作大豆[17]，反應中這些氨基酸所特有的活性基團進一步消耗，從而使得其產(chǎn)物條帶顏色相對較淺。

2.1.3 FTIR分析

紅外光譜可用于分析物質的化學組成和蛋白質的二級結構等。糖基化會使蛋白質的某些功能性基團消失或者出現(xiàn)新的基團[21]，紅外光譜圖上可清晰地觀察到特定基團光譜強度及位置的變化。

如圖3-a所示，在3 700～3 200 cm-1處，糖基化產(chǎn)物的峰寬和光譜強度與SPI相比均增大，這是由于低聚糖糖鏈上存在多個羥基，糖基化使得肽鏈接入糖鏈，增加了羥基的數(shù)量，O—H的伸縮振動和N—H的彎曲振動引起光譜圖的變化[22]。此外，在3 000～2 800 cm-1糖基化產(chǎn)物的光譜強度進一步增大，說明蛋白質與低聚糖分子共價結合引起C—H伸縮振動[23]。

2.2 糖基化產(chǎn)物溶解性與乳化性研究

2.2.1 溶解性

蛋白質與多糖通過糖基化形成共價復合物，多羥基的親水性使蛋白質分子溶解性顯著提高，次級鍵形成的弱復合物也有利于蛋白質的溶解。圖4-a中，糖基化產(chǎn)物與SPI相比，其溶解度在等電點(pH 4.6)處略有不同，在pH 3～4和pH 6～9出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。蛋糖比3∶1反應6 h的產(chǎn)物溶解度在pH 8.0時達最高96.74%，是同pH條件下SPI的1.77倍；蛋糖比1∶2和1∶3反應6 h后溶解度顯著下降(P<0.05)，尤其是蛋糖比1∶3的產(chǎn)物在pH 3.0和pH 6.0時溶解度分別下降48.39%和49.19%，其余pH條件下下降約20%～30%。等電點處溶解度的改變是由于糖基化導致羰基與游離氨基發(fā)生共價交聯(lián)，SPI所帶正電荷減少，負電荷含量相對增加[24]。多糖鏈的親水性羥基引入蛋白質，增加了蛋白質分子與水的親和力，也增大了蛋白質分子的空間位阻，阻止分子間聚集[25]，溶解度得以改善。蛋糖比1∶2和1∶3的產(chǎn)物溶解度整體較SPI低，而蛋糖比1∶1、2∶1和3∶1的產(chǎn)物溶解度整體較高。體系中糖分子較多時，糖基化反應速率加快，生成不溶性副產(chǎn)物[26]，且干熱條件下球蛋白舒展，疏水基團暴露，蛋白質之間發(fā)生聚合，形成不溶性的黏稠分散體系，導致溶解度下降。

如圖4-b所示，不同反應時間的糖基化產(chǎn)物之間的溶解度差異較小，但與SPI相比，pH 3～4和pH 6～9其溶解度均顯著提高(P<0.05)。反應6 h的產(chǎn)物溶解度在pH 8.0時達到最高，pH 8.0時反應10 h的產(chǎn)物溶解度最低，與接枝度的結果一致。反應6 h的產(chǎn)物接枝度最高，其溶解度顯著提高，而反應進行至10 h時，溶解度降低。

圖4-c中，套作SPI及其糖基化產(chǎn)物均比凈作SPI及其糖基化產(chǎn)物溶解度高，且套作SPI糖基化產(chǎn)物的溶解度在pH 3～9顯著得以改善(P<0.05)，尤其在pH 7.0時較SPI增加1.12倍。與套作SPI相比，凈作SPI糖基化產(chǎn)物溶解度在pH 5～9顯著下降(P<0.05)，尤其在pH 6.0時降低69.49%。溶解度存在差異一方面與接枝度有關，接枝引入糖鏈的親水羥基基團可增大SPI接枝物結合水的能力，套作SPI接枝度高于凈作SPI，因此套作SPI的溶解度高于凈作SPI；另一方面，套作SPI 11S/7S的值高于凈作大豆[27]，而調節(jié)11S和7S的比例可改善蛋白的加工適應性。

2.2.2 EA與ES的變化

如圖5-a所示，蛋糖比1∶2和1∶3的糖基化產(chǎn)物的EA與ES有顯著性變化(P<0.05)，其余蛋糖比差異較小。1∶2的糖基化產(chǎn)物EA為3.746 m2/g，較SPI降低29.89%，ES為21.481 min，較SPI增大35.72%；蛋糖比1∶3的糖基化產(chǎn)物EA為8.536 m2/g，較SPI增大59.76%，ES為13.021 min，較SPI降低17.73%。只有比例適當?shù)姆磻锊趴傻玫骄哂欣硐肴榛缘奶腔a(chǎn)物[27]。

如圖5-b所示，隨著反應時間的延長，糖基化產(chǎn)物的EA與ES均先升后降，反應6 h的糖基化產(chǎn)物EA最高(P<0.05)，較SPI增大14.94%；反應4 h的糖基化產(chǎn)物ES最高(P<0.05)，較SPI增大10.31%。接枝反應開始，蛋白質結構逐漸展開，球狀分子伸展暴露疏水基團，界面張力降低，使得溶液的乳化性逐漸提高。糖基化增加分子的空間位阻，油水界面的混合保護膜不斷增厚，可阻止油滴的聚集[28]。隨著時間的延長，一方面蛋白質分子中賴氨酸被破壞[29]，另一方面蛋白質間的相互作用增加，導致溶解度下降，從而引起乳化性的降低。

如圖5-c所示，套作SPI及其糖基化產(chǎn)物的EA均顯著高于凈作SPI及其糖基化產(chǎn)物(P<0.05)，ES高于凈作SPI而低于其糖基化蛋白，差異顯著(P<0.05)。凈作大豆糖基化蛋白EA較SPI降低4.50%，而ES卻增加2.47倍，顯著提高(P<0.05)。蛋白結構舒展，大量的疏水基團暴露，更易吸附于油水界面，從而提高SPI的乳化性質[30]。套作SPI與凈作SPI的乳化性質存在差異，可能與其分子結構有一定的關系。

3 結論

本實驗通過干熱法制備套作SPI/大豆低聚糖糖基化產(chǎn)物，以凈作SPI作為對照，采用OPA試劑法、SDS-PAGE和FTIR分析對糖基化反應的發(fā)生進行鑒定，同時也對糖基化產(chǎn)物的溶解性和乳化性進行測定。結果表明，糖基化在一定程度上可改善蛋白質的溶解性和乳化性，套作SPI糖基化產(chǎn)物的接枝度及加工特性均優(yōu)于凈作大豆且反應物之間的配比對糖基化產(chǎn)物性質的影響更大。因此，通過套作的種植方式以及對糖基化反應的控制，可實現(xiàn)具有較高溶解性和乳化性能的SPI/大豆低聚糖糖基化產(chǎn)物的制備，為SPI在食品加工中的應用提供理論基礎。