氮離子注入選育高自溶干酪乳桿菌及其肽聚糖水解酶的RT-qPCR分析

崔文明，呂加平，王小鵬，趙莉君，祝超智，張秋會(huì)，李苗云，趙改名

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002) 2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京，100193)

干酪乳桿菌是干酪制品生產(chǎn)中常用乳酸菌發(fā)酵劑的重要組成部分。在干酪成熟過程中，風(fēng)味形成不僅需要分泌到胞外的蛋白酶，同時(shí)也需要胞內(nèi)的脂肪酶和肽酶，而正是乳酸菌自溶過程中釋放的肽酶和脂肪酶將牛乳中的脂肪、蛋白和肽水解為風(fēng)味物質(zhì)，才賦予其獨(dú)特的風(fēng)味和優(yōu)良的品質(zhì)[1-3]。發(fā)酵劑的自溶會(huì)導(dǎo)致蛋白水解物的增加，尤其是游離氨基酸的增加(在干酪成熟過程中可以增加2～3倍)，苦味降低，從而使干酪產(chǎn)生更好的風(fēng)味[4-6]。除了賦予干酪制品獨(dú)特的風(fēng)味外，發(fā)酵劑自溶的適當(dāng)提高可以加速干酪的成熟，縮短干酪成熟的生產(chǎn)周期，當(dāng)自溶菌株與非自溶菌株聯(lián)合使用時(shí)，可以有效地縮短切達(dá)干酪的成熟時(shí)間[7-8]。

低能量離子注入作為一種較新的人工誘變技術(shù)，與其他傳統(tǒng)誘變方式(如γ射線、紫外照射等)相比具有損傷率低、突變率高和突變域廣的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物[9-10]、微生物[11-12]育種領(lǐng)域。常用的離子束有He+，Ar+，N+，所用能量一般在數(shù)十至數(shù)百keV，原理主要為經(jīng)過質(zhì)量選擇和加速的低能量離子束在真空條件下被注入生物體細(xì)胞時(shí)，離子束本身的能量可以直接造成胞內(nèi)重要的生物大分子如蛋白質(zhì)被分解，雙鏈DNA的解鏈，單鏈DNA和堿基的損傷[13]。目前用于誘變的低能量離子束的能量要比傳統(tǒng)的離子能量束能量至少低3個(gè)數(shù)量級，最初主要應(yīng)用于干的植物種子的誘變，在微生物體系中的應(yīng)用則因高水分含量限制了低能量離子束的發(fā)射范圍，使得離子能量不能有效到達(dá)生物樣品的內(nèi)部并產(chǎn)生預(yù)期的生物效果[14]。此后，隨著研究人員對低能量離子注入與生物體間的相互作用關(guān)系，從能量發(fā)射與吸收、質(zhì)量堆積效應(yīng)和電荷積累和轉(zhuǎn)移等方面進(jìn)行了深入的研究，最終確定了目前可用于微生物誘變的低能量離子誘變技術(shù)，并使其在工業(yè)應(yīng)用微生物的育種篩選方面得到廣泛應(yīng)用[15]。

本研究中，通過不同能量的低能N+注入的方式誘變干酪乳桿菌116-a，以自溶度為考察指標(biāo)，篩選高自溶突變菌株，并通過掃描電鏡觀察突變前后自溶菌體的形態(tài)變化，然后利用熒光定量PCR來檢測高自溶突變菌株與野生菌株間N-乙酰胞壁質(zhì)酶(AcmA)和N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶(GlcNAcase)的表達(dá)差異，從而確定在干酪乳桿菌116-a自溶中起關(guān)鍵調(diào)控作用的肽聚糖水解酶。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器

干酪乳桿菌 116-a于-20 ℃保存；MRS肉湯培養(yǎng)基和MRS(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；細(xì)菌gDNA提取試劑盒、100 mg/mL RNase A溶液、20 mg/mL溶菌酶、RNAPrep Pure細(xì)菌總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；2×Bench TopTMTaqMaster Mix與瓊脂糖凝膠/PCR產(chǎn)物純化試劑盒(美國Biomiga公司)；Biowest常規(guī)瓊脂糖G-10(香港Gene company Limited)；甘氨酸(超純級)；Goldview核酸染料(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；Triton X-100(分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Promega公司)；SYBR Green Ⅰ試劑、Prism 光學(xué)反應(yīng)管(美國 ABI公司)；DEPC(美國Amresco公司)。

DU800核酸蛋白分析儀，美國Backman；SIGMA 3K-15臺式高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UV2300分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-IN高性能無菌試驗(yàn)臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Alpha Ease FC凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech；雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀DYY-6C，北京六一儀器廠；TP600梯度PCR儀，日本TAKARA；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AUW220電子分析天平，日本Shimadzu公司；WH-3微型旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ABI 7500熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems；400 keV離子注入機(jī)，北京師范大學(xué)低能核物理研究所；Delta 320 pH計(jì)，法國梅特勒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株保藏及培養(yǎng)基制備

將貯藏于-20 ℃冰箱的凍干菌粉，在37 ℃條件下采用MRS肉湯培養(yǎng)基活化3次以上，短期內(nèi)可儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。MRS肉湯培養(yǎng)基依照產(chǎn)品說明書標(biāo)示比例進(jìn)行配制，滅菌條件：115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 樣品制備和N+注入

將活化后的干酪乳桿菌116-a培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以4%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD600nm=1.5左右，使用無菌MRS肉湯培養(yǎng)基稀釋菌懸液細(xì)胞量為2×108CFU/mL左右。

在超凈工作臺中添加100 μL上述菌懸液于直徑9.0 cm的潔凈無菌培養(yǎng)平皿中，涂布棒涂布均勻后，無菌風(fēng)吹干形成菌膜，光學(xué)顯微鏡鏡檢無細(xì)胞重疊后，進(jìn)行離子注入。取原種子菌懸液經(jīng)稀釋后，計(jì)算活菌落數(shù)。

采用注入能量30 keV的N+源，離子注入劑量分別為0.5×1015、1.0×1015、1.5×1015、2.0×1015、2.5×1015、3.0 ×1015ions/cm2。設(shè)置未進(jìn)行離子注入操作的真空對照和空氣對照。離子注入后，立即采用無菌MRS培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，將上述沖洗液經(jīng)適當(dāng)稀釋后取100 μL均勻涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄稀釋度與其對應(yīng)的平板菌落數(shù)，按公式(1)計(jì)算存活率。

(1)

1.2.3 突變菌株的篩選

分別挑取N+注入后的單菌落于MRS肉湯培養(yǎng)中培養(yǎng)至OD600nm值為0.8～1.0，然后離心(12 000 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體檢測自溶度。

突變率：以菌體自溶度變化作為考察指標(biāo)，以原始菌株為空白參照，當(dāng)突變菌株自溶度的變化幅度不超過±10%時(shí)定義為無意義突變，當(dāng)突變菌株自溶度變化低于-10%為負(fù)突變株，高于10%為正突變株。正突變率，負(fù)突變率和總突變率按公式(2)、(3)、(4)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

(3)

(4)

1.2.4 自溶度的檢測

經(jīng)活化的實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以4%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)至目標(biāo)菌體濃度后,離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)收集菌體。無菌生理鹽水懸浮洗滌菌體，重復(fù)洗滌3次，無菌備用Tri-HCl緩沖液(50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA)洗滌菌體1次，懸浮收集菌體于pH 6.5的Tri-HCl緩沖液，至菌懸液(OD600 nm值為0.4～0.6)，測定初始OD600 nm，讀數(shù)記為A0。其余上述菌懸液置于37 ℃培養(yǎng)箱溫育24 h后，測定OD600 nm，讀數(shù)記為A24h。則菌體自溶度按公式(5)計(jì)算求得：

(5)

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)及合成

分別以干酪乳桿菌BL-23基因組為模板，以 Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶，N-乙酰胞壁質(zhì)酶和內(nèi)參基因16S核糖體DNA的引物，并采用NCBI-Primer blast對引物特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。采用mfold 在線軟件(http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold)對引物擴(kuò)增子的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。所設(shè)計(jì)引物序列(表1)送至北京華大基因進(jìn)行合成，合成引物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 細(xì)菌總RNA的提取及cDNA的合成

總RNA的提取參考試劑盒中操作說明。

cDNA合成：參照反轉(zhuǎn)試劑盒用戶手冊。具體反轉(zhuǎn)體系為：25 mmol/L MaCl24 μL;Reverse Transcription 10 ×buffer 2 μL;10 mmol/L dNTP Mix 2 μL;rRNasin RNase inhibitor 0.5 μL;AMV Reverse transcriptase 15 U;Random primers 0.5 μg,總RNA template 1 μg,添加無核酸酶水(nuclease-free water)至總反應(yīng)體積20 μL。反應(yīng)條件為：室溫下放置 10 min，42 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃，5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性，0～5 ℃放置5 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR 反應(yīng)體系如下:總反應(yīng)體積為20 μL，10 μL 2×PCR mix (含SYBR-Green I)，4 μL cDNA模板，10 μmol/L 上下游引物各 2 μL和2 μL無核酸酶雙蒸水。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30s，72 ℃，1 min (40個(gè)循環(huán))；72 ℃ 延伸10 min。在延伸階段檢測熒光強(qiáng)度,收集信號。分別對引物進(jìn)行融解曲線的分析:加熱樣品從60 ℃ 到95 ℃,每隔0.5 ℃ 停留1 s 檢測1 次熒光強(qiáng)度變化。設(shè)置無模板空白對照(雙蒸水為模板)和RT-陰性對照(以RNA為模板)。

1.2.8 掃描電鏡觀察

分別低速離心收獲處于對數(shù)生長期的高自溶突變菌株菌體細(xì)胞和野生型菌株細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，TE緩沖液洗滌1次后，重懸于TE緩沖液，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h,離心收集菌體，重懸于電鏡樣品固定液，備用。將高自溶突變菌株自溶細(xì)胞和野生型菌株自溶細(xì)胞經(jīng)臨界點(diǎn)干燥后，樣品放置于SEM盤，表面噴金后放置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Statistics Analysis System(SAS)9.2進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入干酪乳桿菌116-a的存活率

離子注入的能量和劑量決定著突變菌株的存活率和突變率。如圖1所示，N+注入會(huì)顯著降低菌體的存活率，相比對照組，經(jīng)過N+注入之后，菌株存活率均在32%以下。但菌體存活率并不隨著注入劑量的增大而降低，而是在不同的N+注入劑量下表現(xiàn)出典型的“馬鞍型”特征，使其顯著區(qū)別于紫外、X射線和γ射線。

N+注入之所以能夠造成菌體的大幅度死亡是因?yàn)楫?dāng)離子注入細(xì)胞時(shí)會(huì)由于離子刻蝕效果在細(xì)胞表面產(chǎn)生類囊泡結(jié)構(gòu)和孔洞，甚至破壞細(xì)胞壁的完整性，此外離子注入所引入的能量和電荷的積累則會(huì)損傷菌體細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)構(gòu)和大分子活性物質(zhì)[16]。而“馬鞍型”劑量效應(yīng)曲線的可能產(chǎn)生機(jī)制是低劑量離子注入時(shí)以離子的動(dòng)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)和能量沉積效應(yīng)為主，兩者的共同作用則會(huì)極大地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)的核酸和生物膜，最終導(dǎo)致菌體的死亡；當(dāng)注入劑量逐漸提高至某一閾值時(shí)，細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制會(huì)被激活從而產(chǎn)生系列修復(fù)行為以維持菌體的存活，此時(shí)在細(xì)胞表面堆積的電荷產(chǎn)生的庫倫斥力也在一定程度上阻礙了后續(xù)離子對細(xì)胞造成的損傷；當(dāng)注入劑量繼續(xù)增大時(shí)，細(xì)胞自身的修復(fù)速度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞損傷的速度而電荷積累效應(yīng)到達(dá)臨界點(diǎn)時(shí)也會(huì)產(chǎn)生庫倫爆炸，此時(shí)保護(hù)屏障被破壞而自我修復(fù)能力的不足，則導(dǎo)致細(xì)胞存活率再度降低[17]。

2.2 干酪乳桿菌116-a突變株的篩選

2.2.1 N+注入干酪乳桿菌116-a的突變率

如圖2所示，在0.5×1015～2.5×1015ions/cm2之間，隨著注入劑量的增加菌株突變率也隨之增加。注入劑量在0.5×1015～3.0×1015ions/cm2之間時(shí)，最大正突變率和負(fù)突變率分別在注入劑量2.5×1015ions/cm2和2.0×1015ions/cm2處。而最大注入劑量時(shí)則導(dǎo)致最低的菌株突變率，可能是由于存活率的降低導(dǎo)致了突變率的降低。而在注入劑量1.5×1015ions/cm2和2.0×1015ions/cm2時(shí)，分別只有負(fù)突變菌株和正突變菌株。

2.2.2 干酪乳桿菌突變體的自溶度

由圖3可知，不同劑量N+注入共篩選到正突變變菌株23株，按正突變菌株數(shù)量排序可得其中自溶度增大超過15%菌株共有10株，占所有正突變菌株的43.5%。其中自溶度增大最多的正突變菌株出現(xiàn)在注入劑量0.5×1015ions/cm2處，最大2株正突變菌株的自溶度分別增加了25.7%和20.1%。

N+注入之所以能夠造成基因的突變是因?yàn)樵陔x子注入過程中離子束或因離子注入作用而產(chǎn)生的大量自由基在生物體細(xì)胞內(nèi)的積累，可以造成DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的損傷[18]。而一旦核酸損傷發(fā)生，則細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制就會(huì)對損傷進(jìn)行修復(fù)，主要的修復(fù)作用為同源重組和非同源末端連接，一般前一修復(fù)機(jī)制比較準(zhǔn)確基本不會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤，而后一修復(fù)機(jī)制則具有較高的出錯(cuò)率，從而經(jīng)常導(dǎo)致堿基的改變、缺失或錯(cuò)位插入，從而使生物體產(chǎn)生突變體[19]。

2.3 最大正突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

由于生物體細(xì)胞內(nèi)存在著嚴(yán)格的修復(fù)和糾錯(cuò)機(jī)制，所以篩選得到的氮離子誘變所導(dǎo)致的突變菌株在多次的傳代培養(yǎng)中，有可能在生物體本身的同源重組修復(fù)機(jī)制的作用下，將產(chǎn)生的錯(cuò)誤進(jìn)行修復(fù)[18,20]。因此，需要采用連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式，確保所得突變的遺傳穩(wěn)定性。本研究中選取上述研究結(jié)果中的最大正突變的菌株，進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)并分別檢測每一代的自溶度，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代的各代菌株自溶度結(jié)果如圖4所示，其中最大自溶度為56.73%，最小自溶度為52.67%，則最大的自溶度差異為4.08%。因此，經(jīng)過最大正突變菌株經(jīng)過10代傳代培養(yǎng)后，10代間自溶度波動(dòng)范圍都在5%以內(nèi)且通過統(tǒng)計(jì)分析代與代之間自溶度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P>0.05)，表明經(jīng)過N+注入誘變后，最大正突變菌株獲得了具有良好遺傳穩(wěn)定性的自溶度突變菌株。

2.4 最大正突變菌株與野生型菌株自溶過程中形態(tài)變化

如圖5中所示，在相同的自溶條件和自溶時(shí)間下，野生型干酪乳桿菌116-a屬于低自溶菌株，所以經(jīng)過誘導(dǎo)自溶后僅有少量細(xì)胞發(fā)生胞內(nèi)內(nèi)容物的逸出物，而菌體仍整體保持較飽滿的狀態(tài)；而在最大正突變菌株中由于自溶度的增大，菌體細(xì)胞的飽滿度開始降低，菌體細(xì)胞出現(xiàn)較明顯的凹陷和萎縮，部分細(xì)胞可以看到小孔洞的出現(xiàn)，同時(shí)更多菌體細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)逸出。

2.5 AcmA和GlcNAcase實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物特異性和擴(kuò)增效率

所有用于RT-qPCR的引物，在使用前都需要保證其特異性，不能存在非特異性產(chǎn)物和引物二聚體[21]。本試驗(yàn)中用到的各引物的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果如圖6中所示，各引物擴(kuò)增產(chǎn)物均只存在單一條帶，各條帶所在位置與設(shè)計(jì)引物產(chǎn)物大小相符，在100 bp附近也不存在引物二聚體。此外，在RT-qPCR過程中檢測到的熔解曲線，也都只出現(xiàn)單一的信號峰，其特異性熔解溫度分別為16S，82.4 ℃；AcmA，83.6 ℃；GlcNAcase，72.7 ℃進(jìn)一步表明試驗(yàn)中所用引物具有優(yōu)良的特異性，保證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

為了確保引物的擴(kuò)增效率，本試驗(yàn)中以梯度稀釋的cDNA為模板，分別進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，繪制各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到引物的相關(guān)參數(shù)如圖7所示。從圖中可以看到內(nèi)參基因16S rRNA和2個(gè)目的基因的線性均良好，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99～1.00范圍內(nèi)，其中16S rRNA：y=-3.191 7x+21.661,R2=0.991 3；AcmA：y=-3.249 8x+30.221，R2=0.997 4；GlcNAcase：y=-3.401 7x+33.747，R2=0.994 7。依據(jù)公式E=(10-1/slope-1)×100[22-23]計(jì)算各引物對擴(kuò)增效率，分別為16S rRNA：105.7%，AcmA：103.1%，GlcNAcase:96.8%。實(shí)驗(yàn)中所用的擴(kuò)增引物得擴(kuò)增效率均處于90%～110%之間，符合RT-qPCR對引物擴(kuò)增效率，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確和可靠。

2.6 AcmA和GlcNAcase在野生菌和最大正突變菌株中的表達(dá)差異

通過RT-qPCR研究AcmA和GlcNAcase在野生菌和最大正突變菌株中的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，AcmA和GlcNAcase在最大正突變菌株中的表達(dá)均比野生菌株中的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，其中最大正突變菌株中GlcNAcase的基因表達(dá)比野生菌中的表達(dá)上調(diào)了55倍，而AcmA的基因表達(dá)僅上調(diào)了2.8倍(結(jié)果如圖8所示)。這表明在最大正突變菌株中GlcNAcase表達(dá)的增加可能是導(dǎo)致菌體自溶度增加的重要原因。

AcmA和GlcNAcase是肽聚糖水解酶中的重要組成，兩者均可用于水解連接N-乙酰胞壁質(zhì)酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，其中前者通過解離N-乙酰胞壁質(zhì)酸的還原基團(tuán)實(shí)現(xiàn)糖苷鍵的破壞，而后者則通過解離N-乙酰葡萄糖胺的還原基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)糖苷鍵的破壞[24-25]。在正常的生長環(huán)境中，肽聚糖水解酶被精確的調(diào)控用于母代子代細(xì)胞間的細(xì)胞壁分離，而當(dāng)正常調(diào)控系統(tǒng)受到外界的阻撓或環(huán)境脅迫時(shí)，對肽聚糖水解酶的調(diào)控就失去控制，此時(shí)肽聚糖水解酶將導(dǎo)致菌體的自溶[26-27]。因此，菌體的自溶與肽聚糖水解酶的表達(dá)量和活性大小都密切相關(guān)。這也是GlcNAcase的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致菌體自溶增加的原因。此外，干酪乳桿菌中存在的肽聚糖水解酶約有十幾種，并不是所有的肽聚糖水解酶均在菌體的自溶中發(fā)揮重要作用[28]。從上述結(jié)果來看GlcNAcase是干酪乳桿菌自溶中關(guān)鍵肽聚糖水解酶可以有效調(diào)節(jié)自溶的發(fā)生，而AcmA在干酪乳桿菌自溶中所起的作用則有限。

3 結(jié)論

(1)低劑量的N+注入誘變作為一種較新型的微生物誘變育種技術(shù)，可以高效地用于微生物菌種的誘變和選育，本研究中野生型低自溶干酪乳桿菌116-a經(jīng)過注入劑量0.5×1015ions/cm2的N+注入誘變篩選得到自溶度增加25.6%的自溶突變菌株。

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析比較野生菌株和突變菌株的AcmA和GlcNAcase的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)與野生菌株中的肽聚糖水解酶GlcNAcase的表達(dá)量相比，最大正突變菌株中的肽聚糖水解酶GlcNAcase的表達(dá)量上調(diào)了55倍，表明肽聚糖水解酶GlcNAcase是影響干酪乳桿菌116-a自溶的重要肽聚糖水解酶，在調(diào)節(jié)干酪乳酸菌自溶中起著作用，而肽聚糖水解表達(dá)量的增加可以有效的提高菌體的自溶度。