以L-蘇氨酸為發(fā)酵底物的2,5-二甲基吡嗪高產(chǎn)菌株構(gòu)建

曹艷麗，張麗杰，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine，2,5-DMP)是一種含氮雜環(huán)化合物(圖1)，作為重要的風(fēng)味化合物廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品和熱處理食品中，例如白酒[1-3]、醬油[4-6]、發(fā)酵的可可粉[7-8]、燒烤的牛肉[9]、種子[10]以及花生[11]等，主要貢獻(xiàn)食品中的烤花生香氣[12-13]，是我國(guó)GB2760—1986中規(guī)定允許使用的香精物質(zhì)。2,5-DMP具有極低的閾值，在食品中添加1～2 μg/kg，就可以起到明顯的增香作用[14]。此外，2,5-DMP還是一種重要的醫(yī)藥中間體——5-甲基吡嗪-2-羧酸的重要合成原料[15]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于2,5-DMP的合成主要采用化學(xué)方法，但化學(xué)合成往往存在嚴(yán)峻的環(huán)保問題，且產(chǎn)品不是天然的。作為具有增香作用的食品添加劑，生物法生產(chǎn)的2,5-DMP明顯更受消費(fèi)者喜愛，且價(jià)格更高。

L-蘇氨酸是一種可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飼料添加等方面的常用氨基酸，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘇氨酸的工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，是目前通用的生產(chǎn)方法[16-18]。近年來，國(guó)內(nèi)外大型企業(yè)，如中國(guó)梅花、日本味之素、德國(guó)德固賽等公司逐漸增加產(chǎn)能(100余萬t)，導(dǎo)致L-蘇氨酸產(chǎn)能逐漸過剩，市場(chǎng)飽和，產(chǎn)品價(jià)格呈下降趨勢(shì)。因此，將產(chǎn)能過剩的低值生物基化學(xué)品高值化[19]，如構(gòu)建新的以L-蘇氨酸為底物的高值生物化學(xué)品2,5-DMP生產(chǎn)菌種及方法，是緩解L-蘇氨酸產(chǎn)能過剩,實(shí)現(xiàn)2,5-DMP生物法生產(chǎn)的有效思路。

在之前的研究工作中，本課題組篩選得到1株可以利用L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)2,5-DMP的野生型菌種，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，且已成功解析B.subtilis利用L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)2,5-DMP的合成機(jī)制(未發(fā)表)。如圖1所示，在B.subtilis中，微生物利用L-蘇氨酸脫氫酶(L-threonine dehydrogenase,TDH)為唯一關(guān)鍵酶，后經(jīng)過一系列非酶催化反應(yīng)生成2,5-DMP。然而，該菌種產(chǎn)量、產(chǎn)率均過低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。2,5-DMP作為一種重要的食品級(jí)風(fēng)味化合物，其生產(chǎn)菌株的安全性至關(guān)重要。B.subtilis為美國(guó)食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)認(rèn)定的安全菌種(generally recognized as safe,GRAS)[20]，有潛力作為食品級(jí)化合物生產(chǎn)宿主。另外，B.subtilis易培養(yǎng)、繁殖快、易保存，具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)[21]，是原核表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白表達(dá)較理想的宿主之一[22]。B.subtilis168具有更為清晰的遺傳背景及較強(qiáng)的遺傳操作可行性。因此，本研究以B.subtilis168為出發(fā)菌株，篩選不同種屬來源的TDH，在獲得外源表達(dá)具有高效催化活力的TDH工程菌株的基礎(chǔ)上，外源表達(dá)NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)，以促進(jìn)輔因子循環(huán)，最終構(gòu)建得到1株可利用L-蘇氨酸為底物高產(chǎn)2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox，首次實(shí)現(xiàn)了從L-蘇氨酸到2,5-DMP的高效生物轉(zhuǎn)化。該工作一方面緩解了L-蘇氨酸產(chǎn)能過剩的困境，另一方面有機(jī)會(huì)獲得國(guó)際認(rèn)可的“nature flavor”[23]高值風(fēng)味化合物產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 主要試劑與儀器

2，5-DMP標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich (美國(guó))；限制性內(nèi)切酶(NdeI，EcoR I，BamH I)、In-Fusion HD Cloning Kit、PrimerSTAR Max DNA Polymerase等分子操作所用酶，寶生物工程(大連)有限公司；溶菌酶、硫酸卡那霉素及氨芐青霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit等分子操作所用試劑盒，Omega Bio-Tek (美國(guó))；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

PCR 儀，Bio-Rad；核酸電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，美國(guó)ProteinSimple；多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；高效液相色譜儀，Agilent 1200；超高效液相色譜儀，Waters；超聲波細(xì)胞破碎儀，Scientz。

注：Ampr：氨芐青霉素抗性；Kanr：硫酸卡那霉素抗性。

1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L；固體LB培養(yǎng)基加入2%瓊脂。

LBT培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加5 g/LL-蘇氨酸。添加方法如下：配制50 g/L的L-蘇氨酸母液，使用無菌水系濾膜(0.22 μm)過濾除菌后，添加5 mL至無菌濃縮LB培養(yǎng)基中(121 ℃，20 min)，培養(yǎng)基中最初的L-蘇氨酸濃度以實(shí)際檢測(cè)濃度為準(zhǔn)。在菌株構(gòu)建和發(fā)酵過程中，抗生素的添加量為氨芐青霉素100 μg/mL，硫酸卡那霉素50 μg/mL。

PBS緩沖液：50 mmol/L Na2HPO4溶液與50 mmol/L NaH2PO4溶液適量混合，調(diào)至pH 8.0。

1.2 TDH過表達(dá)菌株的構(gòu)建

1.2.1 TDH過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

NCBI查找獲取分屬于7種不同種屬菌株的TDH編碼基因：Bacillussubtilis168、BacilluslicheniformisATCC 14580、BacillusamyloliquefaciensDSM7、Pseudomonasputida、EscherichiacoliK-12、Aspergilluscandidus、Aspergillusuvarum(見表2)。由于P.putida、E.coli K-12、A.candidus及A.uvarums四株菌株的基因組DNA無法獲取，且胞內(nèi)密碼子偏好性可能與本研究使用的宿主菌B.subtilis有一定差距，因此，本研究采用全基因合成結(jié)合密碼子優(yōu)化方法獲取該4株菌株的TDH編碼基因tdh。針對(duì)B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7三株菌株的基因tdh的獲取，本研究首先分別提取3株菌株的基因組[24]。

以各菌株基因組DNA為模板，分別以B.subtilis168-tdh-F/R、B.licheniformisATCC 14580-tdh-F/R和B.amyloliquefaciensDSM7-tdh-F/R為引物(表3)，通過PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)各菌種基因tdh。PCR反應(yīng)體系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25.0 μL，引物F和R (20 μM)各1.0 μL，基因組DNA模板2.0 μL，無菌水21.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，80 s]，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

質(zhì)粒pMA0911進(jìn)行雙酶切(37 ℃,30 min)，酶切位點(diǎn)為NdeI/EcoR I。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和與酶切的質(zhì)粒pMA0911經(jīng)膠回收純化后使用In-Fusion HD Cloning Kit進(jìn)行連接(50 ℃，15 min)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐青霉素抗性(100 μg/mL)篩選陽性克隆子。挑取克隆子提取質(zhì)粒，通過酶切和測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆子的正確性。

1.2.2 TDH過表達(dá)菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中，B.subtilis168感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化方法詳見參考文獻(xiàn)[24]。利用硫酸卡那霉素抗性(50 μg/mL)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，對(duì)挑取的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。所用鑒定引物為pMA0911-F/R (表3)，PCR反應(yīng)體系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，引物F和R (20 μmol/L)各0.5 μL，基因組DNA模板1.0 μL，無菌水10.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，115 s]，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

1.3 TDH和NOX共表達(dá)菌株的構(gòu)建

1.3.1 重組質(zhì)粒pMA0911-tdh(E.c)-nox的構(gòu)建

通過基因合成獲取重組質(zhì)粒pMA0911-nox，以此質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物nox-F/R (表3)，通過PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因nox，PCR反應(yīng)體系同1.2.1，PCR反應(yīng)條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，90 s]，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切質(zhì)粒pMA0911-tdh(E.c)(EcoR I/BamH I，37 ℃,30 min)經(jīng)膠回收純化后使用In-Fusion HD Cloning Kit進(jìn)行連接(50 ℃，15 min)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性(100 μg/mL)篩選陽性克隆子，提取質(zhì)粒，通過酶切和測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

1.3.2 TDH和NOX共表達(dá)菌株的構(gòu)建

方法同1.2.2。

1.4 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建成功的基因工程菌株在硫酸卡那霉素(50 μg/mL)抗性LB平板上進(jìn)行活化，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL 硫酸卡那霉素)，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接250 mL搖瓶(含有一定濃度L-蘇氨酸的LBT培養(yǎng)基50 mL，50 μg/mL硫酸卡那霉素)進(jìn)行發(fā)酵，24 h后取樣，測(cè)定在600 nm處的吸光度值OD600，然后計(jì)算出2,5-DMP和L-蘇氨酸的濃度。

1.5 2,5-DMP濃度測(cè)定

2,5-DMP采用超高效液相色譜進(jìn)行定量測(cè)定，所用流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液，流動(dòng)相B為色譜級(jí)甲醇。流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)梯度變化為：初始，31% B；0～3 min，31%～69% B；3.10 min，31% B；運(yùn)行時(shí)間為10 min。流速為0.2 mL/min，色譜柱為Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)，采用二極管陣列檢測(cè)器(photo-diode array,PDA)檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。

1.6 L-蘇氨酸濃度測(cè)定

L-蘇氨酸的濃度采用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)柱前在線衍生-高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。所用流動(dòng)相A為乙酸鈉緩沖液(55 mmol/L,pH 7.2)，流動(dòng)相B為乙酸鈉緩沖液(275 mmol/L,pH 7.2)∶色譜級(jí)甲醇∶色譜級(jí)乙腈=1∶2∶2(體積比)。流動(dòng)相梯度變化為：初始，8 % B；0～23 min，8%～52.3% B；23～23.5 min，52.3%～100% B；23.5～26.5 min，100% B；26.5～28 min，100%～8% B；運(yùn)行時(shí)間為30 min。流速為1 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm。

1.7 菌體生長(zhǎng)密度測(cè)定

取0.2 mL發(fā)酵液，使用蒸餾水進(jìn)行4倍稀釋，測(cè)定 600 nm 波長(zhǎng)下的吸光值(無菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照)。

1.8 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

取2 mL發(fā)酵液進(jìn)行離心(12 000 r/min,5 min)，利用0.85%(質(zhì)量濃度)的NaCl溶液對(duì)菌體洗滌2次。用1 mL PBS緩沖液懸浮菌體至OD600為3.0，加入20 μL溶菌酶(母液質(zhì)量濃度為20 mg/mL)，于37 ℃水浴放置1 h，取出懸浮菌液置于冰上。利用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)菌體進(jìn)行破碎(時(shí)間1 min；功率36%)，對(duì)破碎液離心(12 000 r/min,5 min)，取上清進(jìn)行適當(dāng)稀釋至蛋白終質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。蛋白含量采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定[25]。SDS-PAGE上樣預(yù)處理：取30 μL稀釋液加入10 μL的4×蛋白質(zhì)SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后放置沸水中10 min，隨后進(jìn)行離心(12 000 r/min,10 min)。取20 μL上清液進(jìn)行上樣，最終獲得SDS-PAGE圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源的TDH表達(dá)載體的構(gòu)建

前期研究表明，B.subtilis合成2,5-DMP的途徑中，TDH為唯一關(guān)鍵酶，催化L-蘇氨酸生成2-氨基乙酰乙酸，后者進(jìn)行一系列非酶促反應(yīng)最終生成2,5-DMP。因此，以2,5-DMP野生合成菌種為出發(fā)菌種，過表達(dá)TDH，理論上可以進(jìn)一步提高2,5-DMP產(chǎn)量，且不同來源的TDH可能具有不同的催化活性。因此，本研究計(jì)劃以B.subtilis168為出發(fā)菌種，首先選取不同種屬來源的TDH，并分別外源表達(dá)，通過檢測(cè)2,5-DMP產(chǎn)量，來篩選具有催化優(yōu)勢(shì)的TDH，并獲得2,5-DMP增產(chǎn)菌種。

通過在NCBI查找，確定了7種不同種屬來源的TDH編碼基因tdh(表2)：B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7、P.putida、E.coliK-12、A.candidus、A.uvarums。分別提取B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7全基因組，并以此為模板分別進(jìn)行TDH編碼基因tdh的克隆。選用B.subtilis外源表達(dá)質(zhì)粒pMA0911為載體，雙酶切(NdeI/EcoR I)后的質(zhì)粒與PCR擴(kuò)增的TDH編碼基因tdh(圖2-A)經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建TDH表達(dá)重組質(zhì)粒(圖2-B)。另外，因P.putida、E.coliK-12、A.candidus、A.uvarums四株菌株的基因組難以獲得，因此對(duì)上述4種菌株的TDH編碼基因tdh密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成，并構(gòu)建到表達(dá)載體pMA0911上。

對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒(圖2-B)進(jìn)行雙酶切(NdeI/EcoR I)驗(yàn)證，酶切結(jié)果如圖2-C所示，各酶切片段長(zhǎng)度與表4中一致，表明TDH編碼基因tdh成功與表達(dá)載體連接。為了進(jìn)一步確定基因序列的正確性，將酶切結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原有序列進(jìn)行比對(duì)，確定序列一致，表明各個(gè)來源的TDH編碼基因tdh未發(fā)生突變，不同來源的TDH表達(dá)載體pMA0911-tdh構(gòu)建成功。

2.2 TDH表達(dá)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵驗(yàn)證

將驗(yàn)證正確的7種不同種屬來源的TDH表達(dá)載體pMA0911-tdh分別轉(zhuǎn)入B.subtilis168感受態(tài)中，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，與理論上的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一致(表5)。表明以B.subtilis168為宿主，7種不同種屬來源的TDH外源表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

對(duì)構(gòu)建成功的工程菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，在含有5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液體培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)量(OD600)、生成的2,5-DMP和消耗的L-蘇氨酸。結(jié)果如圖4所示，各基因工程菌的OD600無明顯差別(圖4-B)，不同種屬來源的TDH外源表達(dá)菌株積累2,5-DMP能力具有顯著性差異，來源于E.coliK-12的TDH外源表達(dá)菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)利用L-蘇氨酸消耗量最高，積累2,5-DMP質(zhì)量濃度最高，發(fā)酵24 h后，2,5-DMP的積累量高達(dá)527.43 mg/L。而來源于P.putida、A.candidus與A.uvarums的TDH外源表達(dá)菌株2,5-DMP積累量并無明顯提高。

本研究對(duì)各基因工程菌株中TDH的表達(dá)情況進(jìn)行了SDS-PAGE分析。如圖5所示，來源于B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7和E.coliK-12的TDH成功表達(dá)，該結(jié)果與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.s)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.l)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.a)和B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)利用L-蘇氨酸產(chǎn)2,5-DMP的能力與對(duì)照菌株(B.subtilis168/pMA0911)相比顯著提高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(圖4)。然而，如圖5所示，基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(P.p)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(A.c)和B.subtilis168/pMA0911-tdh(A.u)的細(xì)胞破碎液并未顯示明顯的TDH目的蛋白條帶，與上述菌種利用L-蘇氨酸產(chǎn)2,5-DMP的產(chǎn)量與對(duì)照菌株相比變化不大的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(圖4)。雖進(jìn)行密碼子優(yōu)化，但菌種P.putida、A.candidus及A.uvarums與宿主B.subtilis親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，可能導(dǎo)致目的蛋白TDH表達(dá)量較低甚至沒有表達(dá)。

本研究的目的是獲得1株可以利用L-蘇氨酸高產(chǎn)2,5-DMP的基因工程菌株，因此，基于圖4所示結(jié)果，本研究選擇B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)作為后續(xù)菌株構(gòu)建的基礎(chǔ)菌種。

2.3 TDH與NOX共表達(dá)載體的構(gòu)建

由圖1所示，TDH為2,5-DMP合成過程中的唯一關(guān)鍵酶，其催化L-蘇氨酸與NAD+生成2-氨基乙酰乙酸及NADH。因此，在2,5-DMP合成過程中，輔酶NAD+的含量可能是制約2,5-DMP產(chǎn)量的重要因素(圖1)。雖然細(xì)胞在正常情況下可以實(shí)現(xiàn)自身還原力平衡，但在本研究中，由于TDH的過量表達(dá)，可能會(huì)使得NAD+過度消耗而難以實(shí)現(xiàn)快速再生，影響TDH的催化效率。因此，本研究計(jì)劃外源表達(dá)NADH氧化酶NOX，后者可以催化NADH生成NAD+和水，以實(shí)現(xiàn)NAD+的快速再生[26]。

因B.subtilis外源表達(dá)質(zhì)粒選擇有限，因此本研究決定將NOX編碼基因nox與TDH編碼基因tdh在同一質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄表達(dá)。首先通過全基因合成獲取攜帶NOX轉(zhuǎn)錄基因nox的質(zhì)粒pMA0911-nox(圖2-B)，并以此為模板，擴(kuò)增出攜帶質(zhì)粒pMA0911同源臂的目的基因nox(圖6-A)，將基因nox構(gòu)建到酶切質(zhì)粒pMA0911-tdh(E.c) (圖6-A)，重組質(zhì)粒pMA0911-tdh(E.c)-nox示意圖如圖6-B所示。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5 α感受態(tài)中進(jìn)行克隆，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖6-C所示，各酶切片段長(zhǎng)度與表4中一致。為了進(jìn)一步確定基因序列的正確性，將酶切結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過比對(duì)進(jìn)一步確定了序列一致且讀碼框正確。以上結(jié)果說明，雙基因共轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pMA0911-tdh(E.c)-nox構(gòu)建成功。

2.4 TDH與NOX共表達(dá)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pMA0911-nox和pMA0911-tdh(E.c)-nox分別轉(zhuǎn)入B.subtilis168感受態(tài)中，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，所用驗(yàn)證引物為pMA0911-F/R (表3)，結(jié)果如圖7所示，各菌株的菌液PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度如表5所示，經(jīng)比對(duì)可以確定NOX表達(dá)菌株和TDH與NOX共表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

對(duì)構(gòu)建成功的基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，在含有蘇氨酸終質(zhì)量濃度為5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液體培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)量(OD600)、生成的2,5-DMP以及消耗的L-蘇氨酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示。

從圖8可以看出，雖然菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox的細(xì)胞生長(zhǎng)量略低于菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)(圖8-B)，但對(duì)于2,5-DMP的積累量卻高于菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)，且具有顯著性差異(圖8-A)，而2菌株對(duì)于L-蘇氨酸的消耗量并不具有顯著性差異(圖8-B)。因此，NOX的存在對(duì)于過表達(dá)的TDH催化L-蘇氨酸最終生成2,5-DMP有促進(jìn)作用。菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox利用5.83 g/L的L-蘇氨酸發(fā)酵24 h，最終2,5-DMP的產(chǎn)量可達(dá)616.04 mg/L,與對(duì)照菌株B.subtilis168/pMA0911相比(圖4-A)，產(chǎn)量提高了22.5倍，與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)相比，產(chǎn)量增加了88.61 mg/L。有文獻(xiàn)報(bào)道，B.subtilis利用40 g/L的L-蘇氨酸發(fā)酵15 d，最終積累2,5-DMP的量為560 mg/L[27]，與之相比，本研究構(gòu)建得到的基因工程菌B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox利用L-蘇氨酸生物轉(zhuǎn)化為2,5-DMP的效率大大提高。

對(duì)基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox中NOX的表達(dá)情況和B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox中TDH和NOX共表達(dá)情況進(jìn)行SDS-PAGE分析,如圖9所示。

基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox的破碎液中顯示出NOX外源表達(dá)目的條帶?；蚬こ叹闎.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox的細(xì)胞破碎液中，均顯示出TDH及NOX外源表達(dá)目的條帶，表明該菌株中TDH及NOX均表達(dá)，與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox具有更高的2,5-DMP產(chǎn)量結(jié)果相一致(圖8)。

基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox利用L-蘇氨酸產(chǎn)2,5-DMP的能力遠(yuǎn)低于B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox(圖8-A)，分析其原因，在TDH表達(dá)水平不高的情況下，細(xì)胞自身的還原力水平足以維持菌株自身的TDH催化所需要的還原力，也就是說，即使還原力水平提高，但是在催化過程中真正需要的還原力水平并沒有提高，因此，該菌株B.subtilis168/pMA0911-nox對(duì)于2,5-DMP的積累量接近于對(duì)照菌株B.subtilis168/pMA0911 (圖4-A)。

3 結(jié)論與討論

來源于E.coliK-12的TDH在B.subtilis168中可以過表達(dá)，并且該蛋白的過表達(dá)更有利于B.subtilis168利用L-蘇氨酸合成2,5-DMP。在TDH過表達(dá)的基礎(chǔ)上，NOX的參與可以促進(jìn)NAD+的快速再生，從而有助于促進(jìn)2,5-DMP產(chǎn)量的提高。本研究成功構(gòu)建得到1株可以利用L-蘇氨酸高產(chǎn)2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox，該菌株可以在添加5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h，便可積累616.04 mg/L 2,5-DMP，與對(duì)照菌株B.subtilis168/pMA0911相比，產(chǎn)量提高了22.5倍。與此前報(bào)道的B.subtilis利用40 g/L的L-蘇氨酸發(fā)酵15 d，最終積累560 mg/L 2,5-DMP[27]相比較，該基因工程菌株利用L-蘇氨酸生物轉(zhuǎn)化為2,5-DMP的效率大大提高。該研究對(duì)于工業(yè)上實(shí)現(xiàn)2,5-DMP的生物合成具有重要意義。

與野生菌株相比，雖然構(gòu)建的基因工程菌株利用L-蘇氨酸生物轉(zhuǎn)化為2,5-DMP的效率大大提高，但其轉(zhuǎn)化率仍僅有23.3%。在L-蘇氨酸的微生物代謝中，有3條重要的途徑，分別起始于3種關(guān)鍵酶：TDH、L-蘇氨酸醛縮酶及L-蘇氨酸脫水酶(L-蘇氨酸脫氨酶)[28-29]，即L-蘇氨酸在菌株中的代謝流向不止TDH所在的一條途徑。另外，2-氨基-3-酮丁酸CoA連接酶可以催化2-氨基乙酰乙酸(TDH催化L-蘇氨酸形成的產(chǎn)物，圖1)進(jìn)入甘氨酸代謝途徑[30]，從而使得流向2,5-DMP的生成方向受阻。因此，本研究構(gòu)建的基因工程菌株利用L-蘇氨酸生產(chǎn)2,5-DMP的轉(zhuǎn)化率仍不高。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率，后續(xù)可以通過無痕基因敲除手段切斷L-蘇氨酸其他的代謝途徑，使得L-蘇氨酸盡可能多地流向2,5-DMP的生成方向。