羊乳中牛乳成分的可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

澹臺(tái)瑋，徐秦峰，張文娟，李艷妮

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 國(guó)家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西 西安 710021)

0 引言

在我國(guó)，乳及其制品已成為人們?nèi)粘I(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充劑.并且隨著生活水平的提高，對(duì)乳及其制品的需求逐漸由數(shù)量向質(zhì)量轉(zhuǎn)變，即人們更傾向于追求一些高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的乳制品，如羊乳及其制品[1].但由于養(yǎng)殖和季節(jié)波動(dòng)等影響，羊乳價(jià)格相對(duì)偏高[2].一些不法商家為了尋求商業(yè)利益，在羊乳中摻入牛乳，以次充好，且摻入手段多樣，不僅損害了消費(fèi)者合法權(quán)益，并對(duì)羊乳行業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生了不利影響[3].由于傳統(tǒng)感官檢驗(yàn)及常規(guī)指標(biāo)不易辨別，在2016年發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《羊奶真實(shí)性鑒定技術(shù)規(guī)程》(NY/T3050-2016)中[4]，主要通過凝膠電泳、酶聯(lián)免疫或PCR方法檢測(cè)羊奶產(chǎn)品是否存在牛源性蛋白或者DNA，來鑒別羊奶產(chǎn)品是否摻入了牛源性奶成分.

相比于蛋白質(zhì)，DNA對(duì)于熱加工更為穩(wěn)定[5]，并且由于PCR方法對(duì)目標(biāo)DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增，PCR方法適用于生羊奶、UHT滅菌液態(tài)羊奶及羊奶粉中摻入牛源性奶成分的高靈敏檢測(cè).但是PCR方法需要熱循環(huán)儀器和凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，操作繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)羊奶真實(shí)性的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，限制了此方法的推廣應(yīng)用.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)[6]則可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下，特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增核酸序列.LAMP反應(yīng)無需熱循環(huán)儀器，且LAMP產(chǎn)物可通過熒光目視可視化快速簡(jiǎn)單的鑒別[7].已有的LAMP熒光檢測(cè)染料主要包括鈣黃綠素、SYBR Green I等，普遍存在穩(wěn)定性差、斯托克斯(stoke′s)位移小導(dǎo)致的顏色區(qū)分不明顯等問題[8].

為了克服這種局限，本研究中發(fā)展了核酸分子“光開關(guān)”釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+作為可視化LAMP熒光染料.[Ru(bpy)2(dppz)]2+在水溶液中本身不發(fā)光，DNA存在時(shí)熒光顯著增強(qiáng)，具有優(yōu)良的水溶性、穩(wěn)定性、生物低毒性、Stoke′s位移大等優(yōu)點(diǎn)[9-11].通過將金屬釕配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的核酸分子“光開關(guān)”特性與LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合，建立了羊乳中牛乳成分的可視化LAMP檢測(cè)方法.該方法直接通過可視化熒光目視比色判定檢測(cè)結(jié)果，具有快速、直觀、低成本等優(yōu)點(diǎn)，可為羊奶真實(shí)性現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供技術(shù)支持，并可通過LAMP引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)其它動(dòng)植物源性食品的真實(shí)性快速檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮牛乳樣品采自西安市未央?yún)^(qū)草灘奶牛場(chǎng)，鮮羊乳樣品采自陜西省西安市未央?yún)^(qū)市場(chǎng)，采集的鮮乳制品于-20℃保存?zhèn)溆?用于驗(yàn)證引物特異性的非目標(biāo)DNA(雞、豬、馬、兔和鴿子)均購(gòu)于四川華漢三創(chuàng)有限公司.不同品牌的羊乳產(chǎn)品(液態(tài)乳、羊奶片、全脂羊乳粉及配方奶粉)等樣品分別購(gòu)自西安市以及網(wǎng)上不同的超市，用于驗(yàn)證所建立方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

1.2 主要試劑和儀器

(1)試劑：磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根有限公司,甜菜堿(Sigma公司)，釕(II)配合物[Ru(bpy)2dppz]2+(Jena Bioscience公司)，dNTP混合液，Bst 2.0 WarmStarDNA聚合酶，MgSO4，均采自New England Biolabs.

(2)儀器：高速冷凍離心機(jī)(5424R，Eppendorf有限公司)；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司)，電熱恒溫水槽(DK-8D，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，超微量分光光度計(jì)(Q6000，美國(guó)Quawell)，藍(lán)光透射儀(VE0100，SMOBIO).

1.3 DNA提取

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[12]，本實(shí)驗(yàn)中采用磁珠法提取新鮮乳品或羊奶制品中DNA，以超微量核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度和純度后，將DNA溶液稀釋到7 ng/μL，儲(chǔ)存在-20 ℃，備用.

1.4 LAMP引物選取

本研究涉及的牛、羊特異性引物以線粒體保守序列為靶基因，選取SN/T 4419.21-2016標(biāo)準(zhǔn)中牛特異性引物及文獻(xiàn)報(bào)道的羊特異性引物[13]，如表1所示.引物由上海生工生物有限公司合成.

表1 本實(shí)驗(yàn)中LAMP擴(kuò)增引物序列

1.5 可視化LAMP方法建立及優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系為10μL，包括:1μL 10×Thermol Pol buffer，外引物F3和B3(10μM)各0.2μL，內(nèi)引物FIP和BIP(40μM)各0.2μL，1.4μL dNTPs(10 mmol/L)，1.6μL甜菜堿(0.8 M)，0.4μL Bst DNA聚合酶(8 U/μL)，加入待測(cè)DNA 1.2μL，以雙蒸水為空白對(duì)照，最后用水補(bǔ)齊到10μL，混勻.在64 ℃下恒溫反應(yīng)45 min.

反應(yīng)結(jié)束后取1μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入50μL釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+溶液，在藍(lán)光透射儀下觀察顏色變化,出現(xiàn)紅色熒光為陽(yáng)性，無色為陰性，同時(shí)結(jié)合2%的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定.

為了確保顏色區(qū)分更明顯，對(duì)鎂離子濃度及釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料濃度進(jìn)行優(yōu)化，其中鎂離子濃度分別為2、4、6、8、10、12 mM，釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料濃度分別為5μM、10μM、15μM、20μM、25μM.

1.6 可視化LAMP方法的特異性與靈敏度

以雞、豬、馬、兔、鴿子的基因組DNA分別作為待測(cè)樣品模板，奶牛、山羊的乳基因組DNA分別作為模板陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水作為模板陰性對(duì)照(NTC)，按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后通過觀察顏色變化，驗(yàn)證引物的特異性.

將7 ng/μL的奶牛和山羊DNA原液10倍濃度梯度稀釋，濃度依次為：7 ng/μL、0.7 ng/μL、0.07 ng/μL、0.007 ng/μL、0.000 7 ng/μL、0.000 07 ng/μL、0.000 007 ng/μL，每個(gè)梯度均取1.2μL為模板，按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證方法的靈敏度.

1.7 可視化LAMP方法的摻假比例檢出限

為了驗(yàn)證所建立方法的靈敏度及適用性，在提取的羊乳DNA中摻入不同比例的奶牛乳DNA(比例依次為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%和0%)，取上述混合DNA 1.2μL為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，確定所建立方法的檢出限.

1.8 市售樣品的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用

使用優(yōu)化好的可視化LAMP方法對(duì)市售羊乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證建立方法的實(shí)用價(jià)值.

2 結(jié)果與討論

2.1 可視化LAMP檢測(cè)方法的建立

為了確定方法的可行性，在LAMP反應(yīng)體系中設(shè)置有模板與空白對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后添加[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料觀察熒光顏色變化，并通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光光譜掃描進(jìn)行確認(rèn).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(b)中插圖所示，在DNA模板存在時(shí)，能夠觀察到明顯的熒光發(fā)射；而在沒有DNA模板時(shí)，幾乎觀察不到任何的熒光發(fā)射.熒光目視比色與圖1(a)中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，表明[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料可用于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè).此外，在圖1(b)中[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料最大熒光發(fā)射處于紅光波段,采用可見藍(lán)光激發(fā)Stoke′s位移>150 nm，對(duì)比明顯，目視比色更容易區(qū)分，可減小主觀誤差.

(a)電泳圖(M：DNA Marker)(b)熒光光譜圖(插圖：顏色對(duì)比圖;1:陽(yáng)性對(duì)照;2:陰性對(duì)照)圖1 可視化LAMP檢測(cè)結(jié)果

2.2 可視化LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

為了建立最優(yōu)的可視化LAMP檢測(cè)體系，對(duì)鎂離子濃度及釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料濃度進(jìn)行優(yōu)化.鎂離子濃度優(yōu)化結(jié)果(如圖2所示)顯示，其濃度為8 mM時(shí)，顯色反應(yīng)最為明顯.

同時(shí)，為了達(dá)到最佳的熒光目視比色效果，對(duì)釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果(如圖3所示)顯示：當(dāng)染料濃度大于10μM時(shí)即可達(dá)到較明顯的陽(yáng)性紅色、陰性無色的顏色對(duì)比，基于節(jié)約試劑和檢測(cè)效果穩(wěn)定性考慮，選擇15μM釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+濃度作為后續(xù)試驗(yàn)的染料濃度.

圖2 鎂離子濃度的優(yōu)化(1～6分別為2、4、6、8、10、12 mM鎂離子濃度)

圖3 釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料濃度的優(yōu)化(1～5分別為5、10、15、20、25 μM染料濃度)

2.3 特異性檢測(cè)

采用牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子等樣品DNA為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以驗(yàn)證引物的特異性，其結(jié)果如圖4所示.針對(duì)牛、羊源性成分設(shè)計(jì)的特異性引物，僅含有目標(biāo)成分DNA時(shí)觀察到明顯的顏色變紅，即檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，空白對(duì)照和其他動(dòng)物源性樣品均未變色，為陰性結(jié)果，表明LAMP引物的特異性良好.

(a)牛源性成分(1～8分別為牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子和空白對(duì)照)

(b)羊源性成分(1～8分別為羊、牛、雞、豬、馬、兔、鴿子和空白對(duì)照)圖4 牛、羊源性成分LAMP引物特異性驗(yàn)證

2.4 靈敏度檢測(cè)

為了確定建立的熒光目視比色方法能夠檢測(cè)到牛、羊乳DNA最低含量，將10倍梯度稀釋的牛、羊源性成分DNA分別用于LAMP反應(yīng)，其結(jié)果如圖5所示.兩種目標(biāo)成分DNA檢測(cè)可達(dá)到0.007 pg/μL和0.7pg/μL的檢測(cè)限，表明基于釕(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料的目視比色檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度；顏色對(duì)比方面顯示出紅色和無色的明顯區(qū)分效果.

(a)牛源性成分

(b)羊源性成分圖5 牛、羊源性成分LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè)(1～8為7、0.7、0.07、0.007、0.000 7、0.000 07、0.000 007 ng/μL DNA和空白對(duì)照)

2.5 檢出限的確定

用可視化LAMP技術(shù)檢測(cè)8種不同比例奶牛乳和羊乳DNA混合樣品，結(jié)果(如圖6所示)顯示，在所有混合比例的樣品中，該方法能檢測(cè)出羊乳中摻假0.1%的牛乳，高于標(biāo)準(zhǔn)中PCR方法的2%檢出限[4].

圖6 羊乳中摻入不同比例牛乳的可視化LAMP檢測(cè)(1～8分別為摻入牛乳DNA比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用價(jià)值，選取市售不同品牌的全脂奶粉、脫脂奶粉、羊奶片及配方奶粉等13個(gè)羊奶樣品，分別以奶牛、羊特異性引物對(duì)這些樣品提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增.結(jié)果(如圖7、表2所示)顯示，標(biāo)注為純羊乳的樣品(5、6、9)檢測(cè)出牛乳成分，顯示了在羊乳中摻入不同程度的牛乳成分；而樣品13(標(biāo)識(shí)有生羊乳、牛乳清粉)僅檢測(cè)出牛乳成分，與標(biāo)識(shí)的主成分不符.同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光LAMP及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，其結(jié)果與可視化LAMP結(jié)果一致，證明了該可視化LAMP方法可在實(shí)際檢測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用，且檢測(cè)結(jié)果可靠.

(a)牛源性成分

(b)羊源性成分圖7 市售羊乳制品中牛、羊源性成分檢測(cè)結(jié)果(1:牛源性成分陽(yáng)性對(duì)照；2：羊源性成分陽(yáng)性對(duì)照；3～15為不同品牌的市售樣品；16：空白對(duì)照)

表2 市售羊乳制品中牛、羊源性成分檢測(cè)結(jié)果

注：“+”代表檢測(cè)出該目標(biāo)DNA；“-”代表未檢測(cè)出目標(biāo)DNA.

3 結(jié)論

根據(jù)線粒體保守序列選取牛、羊特異性引物，將金屬釕配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的核酸分子“光開關(guān)”特性與LAMP擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，建立了快速鑒別羊乳及其制品摻假牛乳的可視化LAMP檢測(cè)方法.

結(jié)果表明，[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料可用于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的熒光目視檢測(cè)，并且其具有的大Stoke′s位移使得LAMP擴(kuò)增DNA呈現(xiàn)紅色熒光發(fā)射，與激發(fā)的藍(lán)光對(duì)比明顯，目視比色更容易區(qū)分.該方法具有良好的特異性和靈敏性，在混合樣品中可檢測(cè)羊乳中摻假0.1%牛乳，完全滿足實(shí)際市場(chǎng)摻入量5%的檢測(cè)需要[14]，并成功應(yīng)用于市售樣品的摻假檢測(cè).

相對(duì)于現(xiàn)有的基于其他熒光染料的可視化LAMP技術(shù)[15-17]，其節(jié)約了檢測(cè)成本，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)限短，結(jié)果準(zhǔn)確，而且克服了其他染料熒光目視比色時(shí)顏色對(duì)比不明顯，以至可能無法區(qū)分其所對(duì)應(yīng)的物種的缺點(diǎn)，更適用于大批量樣品的快速摻假鑒別，可以作為乳品市場(chǎng)監(jiān)督和檢驗(yàn)鑒定的可行性方法.