茯茶多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化和對益生菌生長的影響

汪夢雯，劉文婷，任雪寧，鄭 雪，胡 松，楊 苗，夏 飛

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021)

0 引言

茯茶是一種后發(fā)酵黑茶，具有降血脂、減肥、抗氧化和抗腹瀉等[1-3]功效.以黑毛茶為原料經(jīng)過毛茶篩分、汽蒸、渥堆、壓制成型、發(fā)花、干燥和成品包裝等工藝制成[4].“金花菌”是茯茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌群，是一種無毒無害，符合安全標準要求，并對人體健康有益的菌群[5-7].茯茶中的活性多糖具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、保肝護肝、抗氧化、調節(jié)腸道微生態(tài)等生物活性[8,9].多糖的多種生物活性，引起很多研究者的關注.目前認為多糖可通過多種途徑調節(jié)人體的新陳代謝，一是通過清除活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)維持機體自由基平衡以達到抗氧化防御；其次可通過影響腸道菌群調節(jié)和改善胃腸道微環(huán)境，達到防治腹瀉的作用.此外，也可通過調節(jié)益生菌來激活吞噬細胞，提高機體免疫力.然而，目前茯茶多糖的抗氧化活性及其對益生菌生長的影響作用還尚未完全闡釋清楚.

從茯茶中有效提取茯茶多糖環(huán)節(jié)是限制其開發(fā)利用的瓶頸.目前，茯茶多糖通常采用熱水浸提、酸堿浸提、酶和超聲波輔助浸提等方法[10].由于茯茶多糖為水溶性多糖，且熱水浸提法操作簡單、成本較低，因此該方法是提取茯茶多糖最常采用的一種方法.然而，由于提取原料的差異，多糖得率往往不高、提取過程較長.采用超聲輔助處理可促進細胞壁破碎，胞內(nèi)多糖溶出，從而提高多糖得率以及縮短提取時間.合理結合熱水浸提和超聲處理提取茯茶多糖的工藝目前仍需進行探索.

為探索茯茶多糖最佳提取工藝及茯茶多糖的體外抗氧化和對益生菌生長規(guī)律的影響.本研究通過優(yōu)化浸提時間、超聲時間、超聲功率和料液比四個因素，對超聲輔助熱水浸提法提取茯茶多糖工藝進行優(yōu)化,并探討茯茶多糖的體外抗氧化活性和對腸道益生菌生長的規(guī)律的影響.從而為茯茶功效的研究和高附加值茯茶多糖食品開發(fā)奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料及菌種

市售茯茶，實驗室保藏菌種：乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，屎腸球菌(EnterococcusFaecium)均為本研究室保存.

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母菌粉、吐溫80、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚，以上試劑均為分析純.

采用MRS培養(yǎng)基[11]，其中加入2%的瓊脂即為MRS固體培養(yǎng)基.

1.1.3 主要儀器

紫外可見分光光度計(SP-752PC)，上海光譜儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LS-C50L)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;冷凍干燥機(CTFD-10S)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司;數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300VDB)，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉蒸發(fā)儀(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 茯茶多糖提取工藝單因素實驗設計

以茯茶多糖得率為考察指標，分別考察浸提時間、超聲時間、超聲功率和料液比四個因素對茯茶多糖得率的影響.在浸提溫度為100 ℃條件下：分別選取浸提時間[12]為30 min、60 min、90 min、120 min和150 min，固定超聲時間為20 min,超聲功率300 W，料液比為1∶30；超聲時間[13]為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，固定浸提時間為90 min，超聲功率為300 W，料液比為1∶30；超聲功率[12]為180 W、210 W、240 W、270 W和300 W，固定超聲時間為20 min，浸提時間為90 min，料液比為1∶30；料液比[14]為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，固定超聲時間為20 min，超聲功率為300 W，浸提時間為90 min.提取的茯茶多糖進行冷凍干燥，茯茶多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法進行[15].

1.2.2 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，以浸提時間、超聲時間、液料比為自變量，利用Design Expert.V8.0.6軟件進行三因素三水平Box-Behnken中心組合實驗設計，如表1所示.

表1 茯茶多糖響應面試驗因素與水平

1.2.3 茯茶多糖體外抗氧化活性

將提取的茯茶多糖配制成1 mg/mL的母液，并稀釋至0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL，備用.分別測定茯茶多糖的總還原力[16]、DPPH自由基清除率[17]、超氧陰離子清除率[12]和羥基自由基清除率[18]，每個樣品重復測定三次，以同濃度的Vc作為陽性對照.

1.2.4 茯茶多糖對益生菌生長的影響

將乳酸乳球菌(L.lactis)，戊糖片球菌(P.pentosaceus)，凝結芽孢桿菌(B.coagulans)和屎腸球菌(E.faecium)在MRS固體培養(yǎng)基上活化后，接入液體MRS培養(yǎng)基，制備種子液.

將茯茶多糖添加至液體培養(yǎng)基中，使其質量濃度分別為0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL.分別接入2 mL四種待測菌種子液，進行生長曲線的測定.菌液在37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)，每隔2 h取菌液，用紫外分光光度計測定培養(yǎng)液在600 nm波長處的吸光度值.以培養(yǎng)時間為橫坐標，以OD值為縱坐標，分別繪制四菌株在不同茯茶多糖濃度時的生長曲線.以未加入茯茶多糖的培養(yǎng)基為對照組.

1.3 統(tǒng)計分析

每個試驗重復三次，結果表示為Means±SD，采用ORIGIN(Origin Pro V 9.0)作圖.采用Design-Expert.V8.0.6軟件進行方差分析，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸提時間對茯茶多糖得率的影響

單因素篩選浸提時間結果表明，多糖得率隨浸提時間延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(圖1(a)).這是因為浸提時間過長可能會導致其他物質溶出，影響茯茶多糖的得率[19,20].在90 min時茯茶多糖得率達到最大值，為3.59%.因此選擇最佳浸提時間為90 min.

2.1.2 超聲時長對茯茶多糖得率的影響

超聲時長對茯茶多糖得率的影響如圖1(b)所示.隨著超聲時間的增加，茯茶多糖得率呈先增加后下降的趨勢.這可能是由于超聲時間過長導致茯茶多糖結構發(fā)生破壞而使茯茶多糖得率下降[13].當超聲時長為30 min時，茯茶多糖得率最高可達3.20%.因此最佳超聲時間選擇30 min.

2.1.3 超聲功率對茯茶多糖得率的影響

超聲功率在180～300 W范圍時，茯茶多糖得率整體呈現(xiàn)下降的趨勢，240 W時多糖得率最低,如圖1(c)所示.超聲功率為180 W時，茯茶多糖得率最高為2.93%，比超聲功率240 W時茯茶多糖得率高0.13%.綜合考慮茯茶多糖得率和成本損耗，選擇最佳超聲功率為180 W.

2.1.4 料液比對茯茶多糖得率的影響

料液比在1∶10～1∶30范圍時，茯茶多糖得率呈上升趨勢，如圖1(d)所示，料液比1∶30時達到最大值，為2.95%.液料比的增加可以有效促進水溶性多糖物質的溶出，而溶劑用量過大會造成茯茶多糖濃度過低，后續(xù)濃縮、沉淀等操作步驟繁多，造成部分多糖損失，導致茯茶多糖得率下降[21,22].由此確定最佳料液比選擇1∶30.

(a)浸提時間對茯茶多糖得率的影響

(b)超聲時間對茯茶多糖得率的影響

(c)超聲功率對茯茶多糖得率的影響

(d)料液比對茯茶多糖得率的影響圖1 單因素對茯茶多糖得率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化茯茶多糖的提取工藝

2.2.1 Box-Behnken中心組合實驗設計及結果

在單因素實驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理，以浸提時間(A)、超聲時間(B)、料液比(C)設計三因素三水平共17組響應面分析實驗，實驗方案設計如表2所示.從表2可初步看出茯茶多糖得率最高的提取方案：浸提時間為90 min，超聲時間為30 min，料液比為1∶30時茯茶多糖得率最高為3.62%.

表2 Box-Behnken中心組合實驗設計與結果

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

以茯茶多糖得率為響應值，對中心組合的實驗結果進行回歸分析，獲得擬合的二次多項回歸方程為：Y=3.57+0.09A+0.081C+0.018A-0.089B+0.12AC-0.048BC-0.43A2-0.54B2-

0.42C2.

表3 回歸方程方差分析

注：“***”表示差異極顯著(P<0.001)；“**”表示差異非常顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示差異不顯著.

2.2.3 響應面優(yōu)化分析

采用Design Expert8.0.6軟件繪制得到響應面曲面圖和等高線圖，如圖2所示.通過改變研究試驗范圍內(nèi)的兩個因子并將另一個因子保持在零水平來形成模型的表面響應圖，以確定任何獨立變量對茯茶多糖得率的影響[24].等高線圖的形狀為橢圓時，表示兩因素相互作用顯著；其形狀為圓形時表示兩因素相互作用不顯著[14,25].浸提時間在76～112 min范圍、超聲時間在25～36 min范圍時，有較高的多糖得率；超聲時間對茯茶多糖得率的影響大于浸提時間，如圖2(a)所示.響應面曲線(圖2(d))坡度較陡，表明浸提時間和超聲時間的交互作用對茯茶多糖得率影響顯著(P<0.05).

由圖2(b)可知，當料液比在1∶22.5～35、浸提時間在73.5～113 min范圍內(nèi)，茯茶多糖有較高的得率；浸提時間對茯茶多糖得率的影響大于液料比，如圖2(b)所示.響應面曲線坡度較陡，如圖2(e)所示，表明浸提時間和料液比的交互作用對茯茶多糖得率有影響，但通過方差分析浸提時間和料液比的交互作用不顯著.

當超聲時間在25～36.5 min、料液比在1∶23.5～30之間時，茯茶多糖有最高得率；超聲時間對茯茶多糖得率的影響大于液料比(如圖2(c)所示).而響應曲面的坡度較陡(如圖2(f)所示)，表明超聲時間和料液比的相互作用對茯茶多糖得率影響較大.

(a)超聲時間與浸提時間對茯茶多糖得率影響曲面圖

(b)浸提時間和料液比對茯茶多糖得率影響曲面圖

(d)超聲時間與浸提時間對茯茶多糖得率影響平面分析

(f)超聲時間和料液比對茯茶多糖得率影響平面分析圖圖2 各交互因素作用的響應面圖和等高線圖

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗證模型

Design Expert 8.0.6軟件分析得到茯茶多糖提取的最佳工藝條件為：浸提時間93.64 min、超聲時間30.72 min、料液比1∶29.02，在該條件下預測茯茶多糖提取率為3.58%.根據(jù)實際情況調整最佳提取工藝為浸提時間93 min，超聲時間30 min，料液比1∶29.為了驗證響應面法的可靠性，在此條件下進行兩次重復性驗證試驗，測得茯茶多糖提取率平均值為3.62%，相對誤差為1.05%，實測值與理論值之間的擬合度較好，表明利用響應面法對茯茶多糖提取工藝的優(yōu)化是可行的.

2.3 茯茶多糖的益生作用

2.3.1 茯茶多糖抗氧化活性

茯茶多糖總還原力如圖3(a)所示.茯茶多糖濃度與總還原力之間存在一定的量效關系，當茯茶多糖濃度為0.1 mg/mL時，其吸光值為0.17 A，為對照組Vc吸光值的24.37%.與靈芝孢子粉多糖的體外抗氧化活性相比，1.0 mg/mL靈芝孢子粉多糖的總還原力為0.47 A[26]，而茯茶多糖濃度為0.6 mg/mL時，其總還原力為0.67 A，較靈芝孢子粉多糖的總還原力強.

隨著濃度增加，茯茶多糖對DPPH自由基的清除力整體呈現(xiàn)上升趨勢，如圖3(b)所示.當濃度為0.3 mg/mL時達到最高值為70.03%，此濃度Vc對DPPH的清除力為92.85%.而3 mg/mL的枸杞多糖對DPPH自由基的清除率為80.41%[27]，可以推測，茯茶多糖對DPPH的清除能力極可能強于枸杞多糖.

茯茶多糖對超氧陰離子的清除力隨濃度增加而增加，如圖3(c)所示.茯茶多糖為0.1 mg/mL時，對超氧陰離子的清除率僅為9.64%，當茯茶濃度增加至0.4 mg/mL和0.6 mg/mL時，茯茶多糖對超氧陰離子的清除率顯著提高.而陽性對照Vc組對超氧陰離子的清除率在80%以上.

茯茶多糖對羥基自由基也表現(xiàn)出一定的清除力，如圖3(d)所示.茯茶多糖濃度為0.1 mg/mL時對羥基自由基的清除率為18.66%，同濃度Vc對羥基自由基對清除率為55.75%.當茯茶多糖濃度為0.6 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率增加至23.76%，而0.6 mg/mL靈芝孢子粉多糖對羥基自由基的清除力為56.50%，靈芝子實體多糖對羥基自由基清除力為52.26%[26].因此，濃度為0.6 mg/mL時，對羥基自由基的清除力表現(xiàn)為：靈芝孢子粉多糖>靈芝子實體多糖>茯茶多糖.雖然茯茶多糖對羥基自由基清除率不及靈芝孢子粉及靈芝子實體多糖，然而茯茶多以夏秋茶為原料加工，因此，研究茯茶多糖的抗氧化活性及其高附加值產(chǎn)品的加工，對于剩余茶葉資源的開發(fā)利用具有重要的意義.

(a)茯茶多糖的總還原力

(b)茯茶多糖對DPPH自由基的清除力

(c)茯茶多糖對超氧陰離子的清除力

2.3.2 茯茶多糖對益生菌生長規(guī)律的影響

茯茶多糖的添加對凝結芽孢桿菌、戊糖片球菌、屎腸球菌表現(xiàn)出抑制作用.如圖4(a)所示，茯茶多糖的添加對凝結芽孢桿菌的菌量生長整體表現(xiàn)出一定的抑制作用，且隨著培養(yǎng)基中茯茶多糖濃度增加，對菌量生長的抑制作用有一定的增加趨勢.戊糖片球菌也受到抑制作用.

如圖4(b)所示，在茯茶多糖濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL和4 mg/mL時，對戊糖片球菌的生長有抑制作用.5 mg/mL的茯茶多糖對戊糖片球菌前期菌量生長有顯著抑制作用(P<0.05)，而在菌體生長16 h后，顯著促進戊糖片球菌菌量的增加(P<0.05).

茯茶多糖在對屎腸球菌的生長具有較明顯的抑制作用(如圖4(c)所示)，且5 mg/mL茯茶多糖對屎腸球菌的生長抑制非常顯著(P<0.01).茯茶多糖對乳酸乳球菌生長的影響隨濃度變化差異較大，如圖4(d)所示.茯茶多糖濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL時，菌體生長量與對照組基本相似.3 mg/mL茯茶多糖較顯著抑制乳酸乳球菌菌量的生長(P<0.05)；而隨茯茶多糖濃度增加至5 mg/mL時，對菌量生長有顯著促進作用(P<0.05).

多糖類物質對益生菌的生長并沒有明確的濃度和效應關系.猴頭菇多糖對益生菌的生長有顯著促進作用，7 mg/mL的猴頭菇多糖顯著促進保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的生長[28]，而4 mg/mL牛蒡菊糖對雙歧桿菌卻產(chǎn)生抑制作用[29].本研究中茯茶多糖對益生菌生長的影響作用并不是隨著濃度的升高而增加，與白術多糖對雙歧桿菌的生長的影響相似：劉麗莎等[30]發(fā)現(xiàn)白術多糖對雙歧桿菌的生長作用并不是濃度越高對雙歧桿菌促進生長越明顯.茯茶多糖對戊糖片球菌(P.pentosaceus)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)以及屎腸球菌(E.faecium)的生長整體表現(xiàn)出抑制作用.這與白術多糖對雙歧桿菌的生長作用相似，白術多糖濃度超過2 mg/mL時，對B.infanits,B.adolescentis和B.animalis的生長促進作用逐呈現(xiàn)下降趨勢[30].此外，白術多糖對B.lottgum和B.bifidum的生長促進作用不顯著[30].而0～2 mg/mL的白術多糖較明顯促進B.infanits,B.adolescentis和B.animalis三種益生菌的生長.

(b)不同濃度的茯茶多糖對戊糖片球菌生長的影響

(c)不同濃度的茯茶多糖對屎腸球菌生長的影響

(d)不同濃度的茯茶多糖對乳酸乳球菌生長的影響圖4 茯茶多糖對益生菌生長規(guī)律的影響(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

3 結論

本研究獲得茯茶多糖最佳提取工藝為：浸提時間90 min、超聲時間30 min、料液比1∶30、超聲功率180 W，在該條件下，茯茶多糖得率為3.69%.通過測定茯茶多糖的總還原力、DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除能力，表明茯茶多糖具有較好的抗氧化作用.茯茶多糖在體外對戊糖片球菌(P.pentosaceus)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)以及屎腸球菌(E.faecium)的生長具有一定抑制作用，濃度為3 mg/mL的茯茶多糖對乳酸乳球菌表現(xiàn)出抑制作用，而濃度為5 mg/mL時對菌量體生長具有明顯促進作用.