枸杞多糖及其硫酸化產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性

孫玉姣，高潤凝，崔湘怡，張 楠

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

多糖廣泛存在于自然界，是一類重要的生物信息分子.它們參與了細(xì)胞識別、生長、分化、機體代謝、胚胎發(fā)育和免疫應(yīng)答等許多重要的生命活動.免疫調(diào)節(jié)活性是多糖最重要的生物活性，多糖免疫功能的發(fā)揮可直接或間接影響多糖發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等其他功能.多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，是許多藥食兩用植物最重要的免疫活性成分，不僅能激活巨噬細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，促進抗體生成，還能激活補體系統(tǒng)，增強紅細(xì)胞免疫功能等[1]；而且多糖的免疫調(diào)節(jié)活性是通過宿主中介起作用，無毒副作用，不影響正常細(xì)胞.因此，多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究引起了人們極大興趣[2].

近年來，多糖的化學(xué)分子修飾，尤其是硫酸化修飾受到了食品化學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)等領(lǐng)域工作者的廣泛關(guān)注.硫酸化修飾是通過化學(xué)方法在多糖分子結(jié)構(gòu)中引入硫酸基團，從而使多糖糖鏈中單糖分子的羥基被硫酸基團取代.相比天然多糖，硫酸化修飾多糖具有更加廣泛和優(yōu)越的生物活性[3,4].研究發(fā)現(xiàn)，部分多糖經(jīng)過硫酸化修飾后，免疫調(diào)節(jié)活性顯著增強，主要表現(xiàn)為促進脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖以及刺激細(xì)胞因子分泌等方面[5,6].此外，多糖經(jīng)過硫酸化修飾后，生物活性增強，可以有效提高多糖的利用率，對其開發(fā)與應(yīng)用具有深遠意義.

阿拉伯半乳聚糖(Aragalactan)的免疫調(diào)節(jié)活性已得到廣泛認(rèn)可，研究發(fā)現(xiàn)，從枸杞中提取的多糖類型均為阿拉伯半乳聚糖.枸杞(Lycium bararum L.)是我國一種藥食兩用物質(zhì)，有“補腎益精，養(yǎng)肝明目”的功效，民間多用來作為延年益壽的補品，也是進行食品或保健食品開發(fā)的重要原料.近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)枸杞具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，其中多糖是枸杞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7].因此，本研究擬以枸杞多糖為模型分子，通過對枸杞多糖進行硫酸化修飾，研究硫酸化修飾對多糖免疫調(diào)節(jié)活性的影響.本研究的開展有助于在分子水平上深入探討硫酸化多糖免疫調(diào)節(jié)活性的作用機制，為多糖的目的性篩選和定向硫酸化修飾提供理論依據(jù).此外，通過硫酸化修飾，可擴大并優(yōu)化枸杞多糖的免疫調(diào)節(jié)功能，有助于拓寬其在功能性食品方面的開發(fā)和應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

1.1.1 實驗材料

枸杞干果購于陜西省西安市中藥材市場，產(chǎn)地為寧夏省中衛(wèi)市.

1.1.2 實驗試劑

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)(相對分子質(zhì)量分別為5、12、25、50、80和150 kDa)、硫酸化試劑三氧化硫-吡啶復(fù)合物(SO3·Py)、二甲基亞砜(DMSO)、MTT(四氮唑藍)和脂多糖(LPS)購于美國Sigma-Aldrich公司；DEAE-52纖維素填料購于上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-100凝膠填料購于瑞典Pharmacia有限公司；RAW 264.7細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素、中性紅染料、磷酸對硝基苯酯和Triton X-100購于上海生工生物工程股份有限公司；NO測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；IL-1β和TNF-αELISA試劑盒購于武漢基因美科技有限公司；RNA抽提試劑Trizol、PrimeScriptTM RT和SYBR-Green PCR試劑盒購于Takara公司；其余試劑都是國產(chǎn)分析純.

1.1.3 實驗儀器

T6新世紀(jì)型紫外-可見光分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；BS-IOOA型自動部分收集儀,上海滬西分析儀器廠；EQUINOX-55型紅外光譜儀,德國Bruker公司；Waters 2695型高效液相色譜儀,美國Waters公司，2414示差折光檢測器、色譜柱TSK-gel G4000SW,7.5 mm × 30.0 cm，日本Tosoh公司；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀,美國Thermo公司；CFX Connect Real-Time PCR 儀,美國Bio-Rad公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞粗多糖LBP的提取

枸杞粗多糖LBP的提取和分離純化采用前期已建立的方法[8].將100 g枸杞干果浸泡在400 mL的蒸餾水中，在室溫放置2 h后，將浸出液濃縮到體積為50 mL.提取過程重復(fù)兩次，合并提取液.然后加入4倍體積的95%(v/w)乙醇，過夜放置于4 ℃環(huán)境下.再將溶液于4 ℃離心，沉淀部分溶于50 mL的蒸餾水中.采用Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v)除去游離蛋白，重復(fù)6～7次，待溶液中不形成白色凝膠狀沉淀為止.最后將此溶液對水透析，濃縮和凍干，得到枸杞粗多糖LBP.

1.2.2 枸杞多糖LbGp1和LbGp4的分離純化

采用DEAE-52型弱堿性(HCO3- form)的陰離子交換柱(5.0 cm × 50 cm)對得到的枸杞粗多糖分離.取1 g LBP溶于10 mL的蒸餾水中，離心取上清后上樣.依次用500 mL的蒸餾水，0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.25 mol/L和0.5 mol/L NaHCO3洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min.同時自動收集洗脫液，每管8 min.收集完畢后，用紫外-可見光分光計隔管檢測蛋白吸收(280 nm)和糖吸收(490 nm，苯酚-硫酸法).根據(jù)蛋白和糖的光吸收值，繪制出洗脫曲線，將同一色譜峰的洗脫液合并后，透析，濃縮，凍干.經(jīng)過陰離子交換柱的分離，一共得到了五個組分，分別為Lbp1、Lbp2、Lbp3、Lbp4和Lbp5.

將Lbp1和Lbp4用Sephadex G-100凝膠柱(2.0 cm × 100 cm)進一步純化，取80 mg Lbp1和Lbp4上樣，用0.1 mol/L NaCl緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min.將洗脫曲線中的主要組分收集起來，透析，濃縮，凍干，得到LbGp1和LbGp4.

1.2.3 總糖含量的測定

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[9].以Ara為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將Ara配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL和1.0 mL于試管中，每管用蒸餾水補到2.0 mL.依次加入50μL的80%(w/v)苯酚溶液和2.5 mL的濃硫酸.搖勻后，在室溫下放置20 min，于490 nm處測定光吸收值.2 mL的蒸餾水作為空白對照，同樣按上述方法操作.平行做三份，求出各個濃度吸光度的平均值.將得到的結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量，縱坐標(biāo)為平均吸光度值，得到線性回歸方程.

樣品的總糖含量測定：將LbGp1和LbGp4配制成濃度為2 mg/mL的溶液，吸取各樣品溶液0.1 mL，按以上操作方法測定其吸光度值.根據(jù)回歸方程計算各個樣品的總糖含量.

1.2.4 非選擇性硫酸化修飾

分別稱取20 mg、40 mg和80 mg三乙胺-三氧化硫，加入25 mL二甲基甲酰胺和300 mg枸杞多糖，于50 ℃攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)完成后，用5 mol/L NaOH中和反應(yīng)物，加入三倍體積95%乙醇，靜置過夜后離心，收集沉淀物，干燥，然后溶于少量蒸餾水，用截留分子量為300 Da的透析袋透析，凍干，命名為LbGp1-SL、LbGp1-SM和LbGp1-SH以及LbGp4-SL、LbGp4-SM和LbGp4-SH.

1.2.5 巨噬細(xì)胞株 RAW 264.7的培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞用含有1%雙抗(青霉素和鏈霉素)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng).放置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，隔天傳代.

1.2.6 細(xì)胞活力的檢測

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)150μL，以培養(yǎng)液作對照，藥物處理24 h，加入100μL的MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃、5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h.棄上清，每孔加入100μL的DMSO，溫室振蕩10 min.用酶標(biāo)儀于490 nm處測各孔的吸光度[10].

1.2.7 細(xì)胞吞噬能力的檢測

采用吞噬中性紅實驗檢測枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的影響.收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cell/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)150μL，并以150μL脂多糖(LPS，1μg/mL)和培養(yǎng)液分別作為陽性對照和空白對照.培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入0.1%中性紅生理鹽水溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150μL的細(xì)胞裂解液，37 ℃放置1 h，振蕩均勻，用酶標(biāo)儀于540 nm處測各孔的吸光度[11].

1.2.8 NO含量的檢測

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)150μL，并以150μL LPS(1μg/mL)和培養(yǎng)液分別作為陽性對照和空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行檢測.采用NO檢測試劑盒檢測NO含量.用酶標(biāo)儀于492 nm處測各孔的吸光度[12].

1.2.9 酸性磷酸酶活力的檢測

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)150μL，并以150μL LPS(1μg/mL)和培養(yǎng)液分別作為陽性對照和空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入25μL的1% Triton X-100和150μL的磷酸對硝基苯酯(1 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1 h.反應(yīng)結(jié)束后，加入50μL的3 mol/L NaOH進行檢測.用酶標(biāo)儀于405 nm處測各孔的吸光度[13].

1.2.10 細(xì)胞因子分泌量的檢測

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200 μg/mL)150μL，并以150μL LPS(1μg/mL)和培養(yǎng)液分別作為陽性對照和空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行檢測.采用ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的分泌水平.

1.2.11 細(xì)胞因子mRNA表達量的檢測

采用qRT-PCR方法檢測硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子基因表達的影響.收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h.加入不同濃度硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)150μL.硫酸化多糖處理24 h后，加入0.6 mL的Trizol試劑，然后用移液槍反復(fù)吹打直至裂解液中無明顯沉淀，提取細(xì)胞中的總RNA.將提取的總RNA進行純度鑒定后，進行qRT-PCR分析檢測細(xì)胞因子TNF-α和IL-1βmRNA的表達水平[14].

qRT-PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸34 s，共計40個循環(huán).引物序列如表1所示.

表1引物序列

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞多糖及其硫酸化產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

2.1.1 總糖含量分析

如表2所示，硫酸化修飾后，枸杞多糖LbGp1和LbGp4的糖含量顯著下降，并且隨著硫酸化程度的提高，糖含量也隨之降低.

表2 枸杞多糖及其硫酸化產(chǎn)物的總糖含量(%)

2.1.2 硫酸基團含量分析

以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線.橫坐標(biāo)為硫酸基團的質(zhì)量(mg)，縱坐標(biāo)為其在360 nm處的吸光度值A(chǔ)(A=A1-A2)，由此得到的線性回歸方程是：y=3.239 3x+0.000 3，R2=0.996 5，由此計算LbGp1-SL、LbGp1-SM和LbGp1-SH以及LbGp4-SL、LbGp4-SM和LbGp4-SH的硫酸基含量(如表3所示).并且，隨著硫酸化程度的提高，硫酸基含量也隨之增加.

表3 枸杞多糖硫酸化產(chǎn)物的硫酸基含量(%)

2.1.3 相對分子質(zhì)量分析

如表4所示，硫酸化修飾后，枸杞多糖LbGp1和LbGp4的相對分子質(zhì)量逐漸增加.并且，隨著硫酸化程度的提高，相對分子質(zhì)量也隨之增加.

表4 枸杞多糖及其硫酸化產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量(kDa)

2.1.4 FT-IR譜圖分析

硫酸化枸杞多糖的紅外光譜如圖1所示.從光譜中可以看出，相比于枸杞多糖，硫酸化枸杞多糖在3 600～3 200 cm-1位置的吸收降低，推測這是由于多糖經(jīng)過硫酸化修飾后，硫酸基取代了羥基的位置，因此多糖O-H的伸縮振動峰吸收降低.并且，硫酸化枸杞多糖出現(xiàn)了兩個新的特征峰.在1 229 cm-1處有S=O的伸縮振動峰，在808 cm-1處有C-O-S的伸縮振動峰，這說明枸杞多糖LbGp1和LbGp4確實發(fā)生了硫酸化.

(a)LbGp1-O (b)LbGp1-SL

(c)LbGp1-SM (d)LbGp1-SH

(e)LbGp4-O (f)LbGp4-SL

(g)LbGp4-SM (h)LbGp4-SH圖1 枸杞多糖(a、e)和硫酸化枸杞多糖(b、c、d、f、g、h)的FT-IR光譜

2.2 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，不同濃度的枸杞多糖和硫酸化枸杞多糖(25、50、100、150、200μg/mL)均能顯著刺激RAW 264.7細(xì)胞的增殖.相比于枸杞多糖，硫酸化枸杞多糖的促進作用更加明顯，并且硫酸化修飾對LbGp1的免疫增強作用高于LbGp4.

圖2 枸杞多糖(A)和硫酸化枸杞多糖(B)對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

2.3 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞在體內(nèi)通過吞噬作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，靜息的巨噬細(xì)胞受到免疫調(diào)節(jié)藥物刺激后，其吞噬功能會增強，因此測定巨噬細(xì)胞的吞噬功能可以評價藥物的免疫活性[15].不同濃度的枸杞多糖和硫酸化枸杞多糖處理細(xì)胞24 h后，采用中性紅法測定RAW 264.7細(xì)胞的吞噬活性，來評價枸杞多糖和硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞吞噬功能的影響.如圖3所示，不同濃度的枸杞多糖和硫酸化枸杞多糖均可以提高RAW 264.7細(xì)胞吞噬中性紅的能力，并且隨著多糖濃度的增加，RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力也隨之增加.此外，LbGp1-SH和LbGp4-SH處理后，RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力最高，表現(xiàn)為LbGp1-SH >LbGp1-SM >LbGp1-SL >LbGp1；LbGp4-SH >LbGp4-SM >LbGp4-SL >LbGp4.說明硫酸基團含量越高，越有利于增加RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力.

圖3 枸杞多糖(A)和硫酸化枸杞多糖(B)對RAW 264.7細(xì)胞吞噬功能的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

2.4 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7分泌NO的影響

NO是一種重要的生物信號分子，在機體內(nèi)廣泛參與多種生理過程.研究證明，巨噬細(xì)胞通過釋放NO發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒、促進淋巴細(xì)胞增殖等免疫功能，NO分泌水平成為評價巨噬細(xì)胞活化的重要指標(biāo).NO在體內(nèi)極不穩(wěn)定，細(xì)胞分泌后會很快轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽.實驗中采用Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中亞硝鹽的含量反映細(xì)胞分泌NO水平.由圖4可見，空白組的RAW 264.7細(xì)胞分泌少量的 NO，陽性對照LPS可以顯著刺激NO產(chǎn)生，細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的枸杞多糖和硫酸化枸杞多糖處理24 h后，NO的分泌水平顯著提高.并且，硫酸化枸杞多糖處理組的NO分泌水平強于枸杞多糖處理組，其中，LbGp4-SH的促進水平可以LPS的促進作用想媲美.此外，LbGp4及其硫酸化產(chǎn)物處理組的NO分泌水平表現(xiàn)為LbGp4-SH>LbGp4-SM>LbGp4-SL>LbGp4，說明硫酸化修飾更能有效促進枸杞多糖LbGp4刺激細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生，并且硫酸基團含量越高，NO的產(chǎn)生量也隨之增加.

圖4 枸杞多糖(A)和硫酸化枸杞多糖(B)對RAW 264.7細(xì)胞分泌NO的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

2.5 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞酸性磷酸酶活力的影響

酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶，存在于巨噬細(xì)胞的溶酶體中，酸性磷酸酶活性的高低反映了巨噬細(xì)胞被激活的程度[16].由圖5可見，陽性對照LPS可以顯著提高酸性磷酸酶的活力；對比LbGp1的各個硫酸化修飾產(chǎn)物，LbGp1-SH由于含有較高的硫酸基團含量，在50～200μg/mL濃度之間均表現(xiàn)出較高的酸性磷酸酶活力；而LbGp4的硫酸化產(chǎn)物L(fēng)bGp4-SH、LbGp4-SM和LbGp4-SL對RAW 264.7細(xì)胞酸性磷酸酶活力的影響更加明顯，在各個濃度下，表現(xiàn)出LbGp4-SH>LbGp4-SM>LbGp4-SL>LbGp4，說明硫酸化修飾更能有效維持和促進枸杞多糖LbGp4對胞內(nèi)酸性磷酸酶活力的激活作用.并且巨噬細(xì)胞胞內(nèi)酸性磷酸酶活力隨著硫酸基團含量的增加而提高，因此LbGp4-SH的酸性磷酸酶活力最高.

圖5 枸杞多糖(A)和硫酸化枸杞多糖(B)對RAW 264.7細(xì)胞酸性磷酸酶活力的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

2.6 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子分泌的影響

白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是巨噬細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，參與機體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過程[17].由圖6可見，相比于枸杞多糖LbGp1和LbGp4，硫酸化枸杞多糖更能有效促進RAW 264.7細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的分泌，其作用效果比LPS的刺激作用更加明顯，表現(xiàn)為LbGp1-SH>LbGp1-SM>LbGp1-SL>LbGp1；LbGp4-SH>LbGp4-SM>LbGp4-SL>LbGp4，說明硫酸化枸杞多糖更能有效促進細(xì)胞因子的分泌，并且硫酸基團含量越高，IL-1β和TNF-α的分泌量也越高.

圖6 枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子IL-1β(A)和TNF-α(C)以及硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子IL-1β(B)和TNF-α(D)分泌的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

2.7 硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子mRNA表達的影響

通過ELISA方法檢測硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸化枸杞多糖可促進IL-1β和TNF-α的分泌，進一步采用qRT-PCR 方法對該結(jié)果進行驗證.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸化枸杞多糖同樣影響細(xì)胞因子mRNA水平上的表達.如圖7所示，硫酸化枸杞多糖能明顯上調(diào)IL-1β和TNF-α的基因表達，并且硫酸基團含量越高，IL-1β和TNF-αmRNA表達越高.

圖7 枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子IL-1β(A)和TNF-α(C)以及硫酸化枸杞多糖對RAW 264.7細(xì)胞因子IL-1β(B)和TNF-α(D)表達的影響(***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05對比于空白組)

3 結(jié)論

本研究以枸杞多糖LbGp1和LbGp4為對象，對其進行非選擇性硫酸化修飾，得到了一系列硫酸化枸杞多糖產(chǎn)物L(fēng)bGp1-SL、LbGp1-SM和LbGp1-SH以及LbGp4-SL、LbGp4-SM和LbGp4-SH.以巨噬細(xì)胞RAW 264.7為靶細(xì)胞，從細(xì)胞和分子水平分別研究了硫酸化修飾對枸杞多糖免疫調(diào)節(jié)活性的影響，結(jié)果表明，硫酸化修飾能明顯增強枸杞多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，并且硫酸化修飾對LbGp4的影響更加顯著.研究結(jié)果可為進一步闡明硫酸化枸杞多糖免疫增強作用的分子機制提供科學(xué)依據(jù)，為深入探討硫酸化多糖的構(gòu)效關(guān)系奠定理論基礎(chǔ).