自噬在創(chuàng)面愈合中的作用研究進(jìn)展

冷敏 彭穎 林曉瑩 汪虹

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院燒傷科（昆明650188）

創(chuàng)面愈合是涉及一系列復(fù)雜生物學(xué)行為的動(dòng)態(tài)過程，分為4個(gè)伴隨和重疊的階段：炎癥、血管再生、再上皮化與膠原蛋白沉積［1］。既往研究［2］表明，多種細(xì)胞及細(xì)胞因子在創(chuàng)面愈合中起著重要作用，目前已有研究證實(shí)自噬參與調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)［3］，但事實(shí)上，自噬除了參與調(diào)控MSCs功能之外，也在調(diào)控創(chuàng)面愈合各個(gè)階段相關(guān)細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要作用。自噬（autophagy）是溶酶體與細(xì)胞內(nèi)成分（細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等）融合、降解，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器更新的過程。研究顯示［4-5］，自噬參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，并與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括癌癥、衰老、創(chuàng)傷等，已成為當(dāng)今基礎(chǔ)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)本文通過查閱國(guó)內(nèi)外最新文獻(xiàn)，旨在總結(jié)自噬在創(chuàng)面愈合中的相關(guān)作用機(jī)制，以期為今后進(jìn)一步通過調(diào)控自噬從而改善創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 自噬的分類及作用過程

目前普遍認(rèn)為自噬主要以三種形式存在——伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬和巨自噬——其主要區(qū)別在于它們的生理功能和向溶酶體的傳遞方式不同［6］。其中巨自噬是自噬中研究最廣泛的形式，巨自噬（以下簡(jiǎn)稱自噬）指對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸以及細(xì)胞質(zhì)、部分細(xì)胞器和細(xì)胞膜等成分的降解過程［7］。當(dāng)前研究表明，自噬主要有兩種類型——非選擇性自噬和選擇性自噬，非選擇性自噬是指位于自噬小體形成位點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)成分被隨機(jī)分配到自噬體中；相反，在選擇性自噬過程中，某些分子、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器被稱為“自噬受體”的特殊蛋白質(zhì)所識(shí)別和吞噬，細(xì)胞根據(jù)自身狀態(tài)利用這些不同類型的自噬來維持自身的穩(wěn)態(tài)或調(diào)節(jié)其功能［8-10］。

完整的自噬過程被描述為自噬通量，包括自噬體的形成，自噬體與溶酶體的融合，以及溶酶體中物質(zhì)的降解［11］。相關(guān)研究表明自噬通常由一種稱為ULK多蛋白復(fù)合物介導(dǎo)啟動(dòng)的，ULK1與ATG13、ATG101以及FIP200相互作用，形成ULK復(fù)合物［12］，它在細(xì)胞內(nèi)起著應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)傳感器的作用［13］。該復(fù)合物是自噬的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，其活性主要通過mTORC1和AMP活化蛋白激酶（AMPK）在不同位點(diǎn)磷酸化來調(diào)控，最終將細(xì)胞內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到溶酶體的雙膜小泡進(jìn)行降解［14-15］。ULK復(fù)合物激活觸發(fā)Ⅲ類PI3K復(fù)合物Ⅰ（PI3KC3）上的多個(gè)蛋白磷酸化，包VPS34、Beclin?1、LC3、VSA15和Atg14等，這些蛋白的磷酸化激活PI3KC3信號(hào)通路［16］。其中LC3蛋白在Atg4半胱氨酸蛋白酶作用下形成LC3 I，再與PE結(jié)合形成自噬體膜的主要成分LC3 II［17］。

2 自噬與創(chuàng)面愈合

2.1 自噬可改善創(chuàng)面炎癥炎癥期是創(chuàng)面損傷后的第一個(gè)階段，炎性細(xì)胞大量活化，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子失控釋放，進(jìn)而導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，而促進(jìn)自噬可抑制炎性細(xì)胞因子的生成，有助于炎癥的消退，而減少炎癥對(duì)于預(yù)防組織損傷和隨后的纖維化至關(guān)重要［18］。例如，有報(bào)道稱自噬相關(guān)蛋白的缺乏會(huì)誘導(dǎo)炎性小體異常激活，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷，相反自噬誘導(dǎo)劑可通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白顯著改善了炎性體相關(guān)疾病的癥狀［19］。而胸腺素β4（Tβ4）是已知的具有抗炎活性的物質(zhì)，相關(guān)研究表明胸腺素β4（Tβ4）抗炎活性主要通過誘導(dǎo)自噬發(fā)生，可促進(jìn)傷口的愈合。RENGA等［20］發(fā)現(xiàn)Tβ4可通過激活LAP/DAPK1信號(hào)途徑，下調(diào)NF?κB，明顯降低炎性細(xì)胞因子（如TNF?α），進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)生。這就提示通過Tβ4增強(qiáng)自噬活性是抑制炎癥的潛在方法。此外，最近CHIU等［21］在用遠(yuǎn)紅外（FIR）治療深Ⅱ度燒傷大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IR不僅增加了巨噬細(xì)胞中自噬小泡的形成，且誘導(dǎo)了LC3?II，Beclin?1的表達(dá)的增加，進(jìn)而激活自噬，最終抑制了NLRP3炎性體的形成并減少了IL?1β的分泌；另一方面FIR也可誘導(dǎo)ASC的泛素化，并限制NLRP3炎性體的活性，從而增加創(chuàng)面愈合率。總之，Tβ4和FIR兩者都可通過調(diào)控自噬，減少炎癥期相關(guān)炎癥因子產(chǎn)生，進(jìn)而減輕炎癥。

2.2 自噬可誘導(dǎo)創(chuàng)面血管生成創(chuàng)面損傷常常伴隨著血管缺損，造成創(chuàng)面缺氧和隨后ROS積累導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，最近有研究表明，缺氧可激活自噬相關(guān)蛋白，從而刺激ECs增殖和分化，并誘導(dǎo)血管生成［22］。有研究人員用紅景天苷處理被過氧化氫損害的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示紅景天苷可通過激活A(yù)MPK促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin?1，LC3?II/LC3?I表達(dá)明顯上升，且細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞活力的顯著提高［23］。提示紅景天苷誘導(dǎo)自噬可能通過調(diào)節(jié)ECs的適應(yīng)性來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而提升ECs活力，為紅景天苷作用于創(chuàng)面血管再生打下基礎(chǔ)。ERK是一種泛素激酶，ERK信號(hào)通路在VEGF旁分泌中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)C57小鼠進(jìn)行全層皮切除，同時(shí)局部注射雷帕霉素（自噬激動(dòng)劑）干預(yù)的MSCs，誘導(dǎo)LC3?II表達(dá)可通過MAPK/ERK1/2信號(hào)通路刺激MSCs中VEGF旁分泌，促進(jìn)ECs形成，有助于創(chuàng)面血管再生［24］。說明自噬可激活ERK信號(hào)通路上調(diào)VEGF的表達(dá)，為自噬調(diào)節(jié)MSCs治療作用提供了新見解。

2.3 自噬有助于創(chuàng)面再上皮化創(chuàng)面再上皮化是角質(zhì)形成細(xì)胞從基底層向角質(zhì)層遷移并同時(shí)發(fā)生增殖與分化的過程。因創(chuàng)面血管破裂及傷口邊緣的耗氧量增加，角質(zhì)形成細(xì)胞遷移多在缺氧環(huán)境中進(jìn)行［25］。研究證明，由缺氧環(huán)境介導(dǎo)的ROS積累可觸發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞中p38和JNK MAPK的激活，進(jìn)而上調(diào)了BNIP3誘導(dǎo)的自噬，并導(dǎo)致LC3、Atg5、Beclin?1等的表達(dá)明顯增加，促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞遷移［26］。但缺氧導(dǎo)致過量ROS的積累對(duì)傷口修復(fù)是不利的，而瑞芬太尼可減少ROS的產(chǎn)生。近期KIM等［27］通過對(duì)比瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組、過氧化氫組、3?MA（自噬抑制劑）+瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組人角質(zhì)形成細(xì)胞，結(jié)果顯示瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組的Atg5，Beclin?1，LC3?II表達(dá)明顯上升，且該組人角質(zhì)形成細(xì)胞自噬體也顯著增多，而凋亡相對(duì)減少，同時(shí)增加了細(xì)胞遷移。該研究不僅證明瑞芬太尼預(yù)處理可改善過氧化物誘導(dǎo)的人類角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化損傷，而且還證明了瑞芬太尼的抗氧化作用是通過自噬介導(dǎo)的，自噬激活可以抗氧化損害，幫助創(chuàng)面再上皮化。此外，有研究證實(shí)角蛋白對(duì)再上皮化形成也至關(guān)重要，如李雄等［28］在研究中發(fā)現(xiàn)在深Ⅱ度燙傷動(dòng)物模型中，用暴露燒傷療法（MEBT）/濕潤(rùn)燒傷膏（MEBO）均勻涂抹創(chuàng)面，可通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin?1，LC3，使角蛋白19的表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化。

此外，有學(xué)者［29］發(fā)現(xiàn)皮膚電場(chǎng)變化也激活自噬，參與了創(chuàng)面愈合過程。完整皮膚中存在跨上皮電勢(shì)差（trans?epithelial potential，TEP），但是在創(chuàng)面形成后，TEP會(huì)立即消失，同時(shí)產(chǎn)生內(nèi)源性傷口電場(chǎng)（EF），即創(chuàng)面內(nèi)部帶有負(fù)電被稱為陰極，傷口周圍完好組織帶正電被稱為陽極，以便細(xì)胞向傷口中心定向遷移［30］。有學(xué)者證實(shí)，磷酸酶和張力同源物（PTEN）和PI3K是感應(yīng)EF的關(guān)鍵因子，其中PTEN又是PI3K的負(fù)性調(diào)控因子，已有研究發(fā)現(xiàn)EF通過下調(diào)PTEN激活PI3K信號(hào)通路中的mTORC1的活性，并誘導(dǎo)LC3?II的表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬激活，加快角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial?to?mesenchymal transition，EMT）和定向遷移速度［31］；此外，YAN等［32］學(xué)者發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面的缺氧環(huán)境可以通過下調(diào)AMPK誘導(dǎo)mTORC1下游靶點(diǎn)p70S6K（Thr389），4E?BP1（Thr70）表達(dá)上升來促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化。YAN等［33］研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證實(shí)EF通過誘導(dǎo)自噬活性即LC3?II增多，增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的距離和速度，但其遷移不是方向性的而是自噬體依賴性的，即EF以恒定自噬通量誘導(dǎo)自噬體形成的時(shí)間依賴性。此結(jié)果揭示了EF的作用機(jī)制，即增強(qiáng)EF使細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)劑是自噬，為EF促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供了新視角。

2.4 自噬促進(jìn)創(chuàng)面瘢痕形成瘢痕是創(chuàng)面損傷后皮膚結(jié)締組織修復(fù)的結(jié)果，其特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞的增殖與膠原蛋白的沉積等。創(chuàng)面在形成瘢痕時(shí)，成纖維細(xì)胞中LC3陽性點(diǎn)數(shù)量增加，且創(chuàng)面邊緣高于中心［34］，表明自噬與成纖維細(xì)胞的功能相關(guān)。YOON等［35］通過對(duì)比瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組、過氧化氫組、3?MA+瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組人皮膚成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示瑞芬太尼預(yù)處理過氧化氫組通過PI3K信號(hào)通路上調(diào)ATG5、Becline?1、LC?3 II的表達(dá)，激活自噬，進(jìn)而激發(fā)人皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，使細(xì)胞中的氧化應(yīng)激作用減輕，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，幫助創(chuàng)面修復(fù)。當(dāng)皮膚受到熱損傷時(shí)，膠原蛋白會(huì)產(chǎn)生變性，變性的膠原蛋白一方面作用于procas?pase?3，使其表達(dá)下降，減少細(xì)胞凋亡；另一方面隨著變性膠原蛋白濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)可通過PI3KC3途徑上調(diào)LC3?II/LC3?I和beclin?1的表達(dá)，顯著增加人皮膚成纖維細(xì)胞的自噬水平，最終幫助細(xì)胞存活［36］，促進(jìn)了創(chuàng)面瘢痕形成。

此外，有學(xué)者證實(shí)抗凋亡蛋白Bcl?2和BAG3表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了自噬從而參與了瘢痕形成。JIAN?LI研究團(tuán)隊(duì)在他們的研究中發(fā)現(xiàn)，用五谷蟲提取物涂抹全層皮切除的大鼠動(dòng)物模型時(shí)，五谷蟲提取物不僅激活了自噬，使Beclin 1、LC3 II表達(dá)增加；而且激活了Smad2/TGF?β和STAT3信號(hào)通路，使下游效應(yīng)分子BAG3和Bcl?2表達(dá)增加，致使抗凋亡活性增強(qiáng)，進(jìn)而減少傷口組織中成纖維細(xì)胞的凋亡，最終增加成纖維細(xì)胞及TGF?β的數(shù)量，促進(jìn)膠原蛋白形成，提升創(chuàng)面愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間［37］。這就表明Bcl?2和BAG3表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了自噬從而參與了創(chuàng)面愈合。而有研究員從反方向證明了Bcl?2表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了自噬，從而參與了創(chuàng)面愈合中的瘢痕過程，MYTYCH等［38］的發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中的一種抗炎蛋白klotho的沉默，可使caspase?3增多和Bcl?2表達(dá)下調(diào)，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡；此外，還可導(dǎo)致ATG16L和LC3表達(dá)的減少，而自噬則被抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)NF?κB和IGF?IR通路激活，促炎因子TNF?α，IL?6，IL?1β的分泌增加及抗炎因子IL?10的分泌抑制，最終抑制成纖維細(xì)胞增殖，傷口愈合過程顯著被抑制。

2.5 糖尿病慢性創(chuàng)面以上研究均證實(shí)自噬參與了創(chuàng)面愈合的多個(gè)階段。隨著近年來糖尿病慢性創(chuàng)面的進(jìn)一步研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在高糖背景下自噬也參與了創(chuàng)面愈合相關(guān)細(xì)胞的作用過程。高糖環(huán)境下，角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力受損，LINGFEI等［39］用高濃度葡萄糖干預(yù)角質(zhì)形成細(xì)胞，通過下調(diào)p38/MAPK信號(hào)途徑使自噬相關(guān)蛋白Atg5和LC3?II的表達(dá)顯著降低，自噬被抑制，細(xì)胞遷移速度下降；而p38/MAPK激活劑MKK6可顯著改善細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞遷移。褪黑素是AMPK信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑，JIN等［40］證實(shí)采用糖尿病小鼠進(jìn)行全層皮切除，同時(shí)每天腹膜內(nèi)注射褪黑激素溶液10 mg/kg，不僅可以使Bcl?2表達(dá)上調(diào)，Bax、caspase?9和細(xì)胞色素c表達(dá)降低，明顯減輕EPCs凋亡；同時(shí)還可以通過激活A(yù)MPK信號(hào)途徑提高LC3?II/LC3?I比率，降低p62蛋白質(zhì)水平，增強(qiáng)EPCs中自噬通量，最終促進(jìn)EPs遷移和粘附，毛細(xì)血管數(shù)量明顯增加，縮短糖尿病慢性創(chuàng)面愈合時(shí)間。MEBT/MEBO是一種中醫(yī)療法，可大大提高臨床上潰瘍傷口愈合的有效性，AITIAN等學(xué)者［41］用糖尿病大鼠進(jìn)行全層皮切除，MEBT/MEBO組通過激活了PI3K?Akt?mTOR信號(hào)通路激活自噬，促進(jìn)糖尿病潰瘍傷口的修復(fù)與愈合。綜上所述，外部干預(yù)可改善糖尿病環(huán)境下受損的細(xì)胞活性，這為糖尿病慢性創(chuàng)面的臨床干預(yù)提供新見解。

3 展望

綜上所述，自噬貫穿了創(chuàng)面愈合的整個(gè)過程。研究證實(shí)自噬在創(chuàng)面愈合過程中可減少炎性因子的產(chǎn)生、促進(jìn)ECs增殖、再上皮化和瘢痕形成，其也可改善高糖環(huán)境下受損的細(xì)胞活性，因此進(jìn)一步明確自噬在創(chuàng)面愈合過程中的具體作用機(jī)制，并開發(fā)靶向自噬相關(guān)通路的藥物，將有望為臨床中促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供更有效的治療手段。但自噬在創(chuàng)面愈合中的相關(guān)研究仍局限在基礎(chǔ)研究層面，且具體作用機(jī)制仍不完全清楚，仍存在大量亟待解決的問題，如自噬在創(chuàng)面愈合各個(gè)時(shí)期的重要性仍有待進(jìn)一步明確，自噬過分促進(jìn)瘢痕的形成是否會(huì)增加后續(xù)抗瘢痕治療的難度，以及過分促進(jìn)自噬可能引發(fā)一系列并發(fā)癥等等。

此外，如前文所述創(chuàng)面損傷產(chǎn)生的ROS在抗氧化劑的作用下可促進(jìn)自噬，減輕凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害，但其具體機(jī)制還不明確，所以筆者認(rèn)為深入研究ROS作用于自噬和凋亡的具體機(jī)制，同時(shí)在抗氧化劑的干預(yù)下，爭(zhēng)取最大化改善細(xì)胞活性，這無疑將為后續(xù)細(xì)胞治療成功應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)做鋪墊。這將為今后臨床工作中應(yīng)用自噬調(diào)控改善創(chuàng)面愈合以及為其治療提供更多的選擇方案。